khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lược vàng callisia fragrans – họ thài lài – commelinaceae

Kết quả chính đạt được - Thu được 3 loại cao: cao ether dầu hỏa, cao acetat etyl, cao etanol - Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học : Cao ether dầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA FRAGRANS – HỌ THÀI LÀI – COMMELINACEAE

MÃ SỐ: T2010 - 72

S 0 9

S 0 0

S KC 0 0 3 2 0 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM

0O0 -

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ : T2010-72 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2011

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA

HỌC CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA

FRAGRANS – HỌ THÀI LÀI –

COMMELINACEAE

Trang

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 : TỔNG QUAN 3

1.1.Giới thiệu về cây lược vàng 3

1.2.Những nghiên cứu về cây lược vàng 4

1.3 Tổng quan về các phương pháp sắc ký 6

1.3.1.Sắc ký cột (column chromatography) 6

1.3.2.Sắc ký bản mỏng 7

PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Hóa chất và dụng cụ 8

2.2 Thu hái và xử lý nguyên liệu 8

2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lược vàng 8

2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học 14

PHẦN 3 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài : KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LƯỢC VÀNG

CALLISIA FRAGRANS, HỌ THÀI LÀI – COMMELINACEAE

Mã số đề tài : T2010 – 72

Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Thị Bạch Lê Tel : 0903753720

Email : ntble@hcmute.edu.vn

Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Sư Phạm Kỹ thuật TP.HCM

Thời gian thực hiện : 6/2010 – 4/2011

- Thử nghiệm cao Acetat etyl và cao ether dầu hỏa trên các chủng vi khuẩn như :

Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis

3 Kết quả chính đạt được

- Thu được 3 loại cao: cao ether dầu hỏa, cao acetat etyl, cao etanol

- Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học :

Cao ether dầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và sáp

Cao acetat etyl chứa một ít sterol và nhiều flavonoid

Cao etanol chứa đường khử, lượng nhỏ tanin, một ít flavonoid và amin

- Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao acetat etyl : cao AcEt trích từ lá

cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa và Bacilus subtilis

- Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao ether dầu hỏa : cao ehter dầu hỏa trích từ lá cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn yếu đối với vi khuẩn

Staphylococcus aureus

4 Địa chỉ ứng dụng

Kết quả nghiên cứu được chuyển tải trong bài báo chuyên ngành, nhằm cung cấp

thơng tin về thành phần hĩa học cây lược vàng Callisa fragans giúp những nhà

nghiên cứu trên cùng lĩnh vực cĩ định hướng trong nghiên cứu về cây lược vàng

Và kết quả này cịn làm định hướng nghiên cứu tiếp theo cho đề tài này là trích

ly cơ lập những chất cĩ mặt trong cây đã khảo sát được

INFORMATION ON RESEARCH RESULT

1 General information

Project title : CHEMICAL STUDY ON CALLISA FRAGANS – COMMELINACEAE

Code number : T2010-72

Coordinator : NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ

Implementing institution : University of Technical Education, HCM city

Duration : from Jun 2010 to Apr 2011

2 Objecttive(s)

- Chemical study on Callisa fragans through out three liquids : petroleum ether,

ethyl acetat, ethanol

- Bioactive test on ethyl acetat extract

3 Research result:

- Extraction 3 residue : petroleum ether, ethyl acetat, ethanol

- Chemical study on these extract:

Petroleum ether residue containing a large of lipid Ethyl acetat residue containing many flavonoids Ethanol residue containing saccharides, and flavonoids

- Ethyl acetat ectract shows antimicrobial activitives on some bacteria lives :

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis

4 Effects, transfer alternatives of research result and applicability

The result of this research will be published on an article to send the knowledge of

the Callisa fragans for the researchers who are working on the same field

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có hơn 12.000 loại cây cỏ, trong đó có rất nhiều dược liệu quý Thêm vào đó, nền y học cổ truyền (YHCT) của nước ta được xếp vào tốp mạnh của thế giới Tuy nhiên, so với các nước có nền YHCT hàng đầu thế giới thì nền YHCT của nước ta còn một khoảng cách lớn Nếu không được sự đầu tư phát triển một cách tương xứng thì khoảng cách đó càng được nới rộng, thậm chí có nguy cơ tụt hậu và quan trọng nhất là không phát huy được thế mạnh của YHCT

để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe người dân Do đó tôi chọn hướng nghiên cứu hóa dược để tìm những hoạt chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc được sử dụng trong dân gian nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học trong việc sử dụng các cây thuốc đó trong YHCT, đồng thời tìm mối liên hệ giữa YHCT và y học hiện đại

Cây lược vàng có tên khoa học là Callisia Fragrans – họ Thài lài

Commelinaceae Việc sử dụng cây Lược vàng làm thuốc mới chỉ được công bố ở Nga theo bài viết của tác giả Vladimir-Ogarkov đăng trên tạp chí sức khỏe và đời sống của Nga Cây Lược vàng được dùng để chữa bệnh đường dạ dày ruột, túi mật, lá lách và cả bệnh hen phế quản, dị ứng và ung thư Các chế phẩm thuốc từ Lược vàng cũng có hiệu quả làm ngừng đau, trừ ngứa, làm liền sẹo, bỏng, chấn thương và gãy xương

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Từ những năm giữa thế kỷ 20, một số nhà khoa học Mỹ và Canada đã phát hiện: những loài cây thuộc họ Commelinaceae (trong đó có cây lược vàng), chứa nhiều loại hoạt chất sinh học, có khả năng kiềm chế sự phát triển của các khối u Ở Nga, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của lược vàng được tiến hành tại Đại học Y khoa thành phố Irkyt, từ những năm 80, thế kỷ trước, dưới sự chỉ đạo của GS Semenov, một nhà khoa học rất nổi tiếng Kết quả nghiên cứu nhiều năm ở Irkyt cho thấy: Trong cây lược vàng có một số hoạt chất sinh học

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

2

thuộc nhóm flavonoid và steroid thực vật Ngoài ra, trong cây còn có sắt, đồng, crôm những nguyên tố có tác dụng quan trọng đối với hoạt động sống của cơ thể Hai chất thuộc nhóm flavonoid được phát hiện là: kercitin và kempferol Lvercitin có hoạt tính giống như vitamin P và là chất chống oxy hóa, có tác dụng lợi tiểu và chống co giật Có thể sử dụng trong điều trị dị ứng, chảy máu nội tạng, viêm thận, viêm khớp, cũng như một số bệnh tim mạch, mắt và nhiễm trùng, Kempferol có tác dụng làm tăng độ bền của mạch máu, an thần, chống viêm, lợi tiểu mạnh – giúp cơ thể bài tiết các chất độc hại ra ngoài Có thể sử dụng để chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn, bệnh dị ứng, rối loạn chức năng bài tiết nước tiểu Các steroid có trong thực vật được gọi là các phytosterol Chúng có hoạt tính tương tự nội tiết tố sinh dục, còn có tác dụng diệt khuẩn, chống xơ vữa động mạch và kiềm chế sự phát triển của các khối u Có thể ứng dụng trong điều trị một số dạng ung thư, cũng như các bệnh tuyến tiền liệt, bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa

Ở Việt Nam, đặc biệt ở Thanh Hóa, nhiều người ở câu lạc bộ Hàm Rồng đã sử dụng cây Lược vàng để chữa rất nhiều bệnh theo kinh nghiệm dân gian Nga như: viêm họng, viêm phế quản, tê liệt chân tay, đau lưng, khớp, bướu cổ di chứng não, tim mạch, huyết áp và xơ vữa động mạch, u nang buồng trứng Tuy nhiên, việc chữa trị cũng chỉ theo kinh nghiêm dân gian, chưa có một nghiên cứu cụ thể để xác định thành phần hóa học chủ yếu cũng như dược tính của cây lược vàng trồng

ở Việt Nam Do đó, chúng tôi quyết định chọn đề tài để khảo sát toàn diện cây lược vàng nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học cho việc sử dụng cây này một cách hiệu quả , phục vụ tốt cho cộng đồng

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là cây lược vàng, thu hái tại xã Phước Thạnh, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

- Phạm vi nghiên cứu : khảo sát thành phần hóa học toàn cây, và thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các loại cao và các hợp chất ly trích được

PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây lược vàng [1]

Cây lượt vàng (hay còn gọi là ria vàng) có tên khoa học là Callisa fragrans, họ

Thài Lài (Commmelinaceae)

Mô tả : Cây thảo, sống lâu năm

Thân đứng cao từ 15 – 40 cm, có thân bò ngang trên mặt dất Thân chia đốt và

có nhánh Đốt ở phía thân dài từ 1-2cm, ở nhánh có thể dài tới 10cm

Lá đơn , mọc so le, phiến lá thuôn hình ngọn giáo, dài 15-20cm, rộng 4-6cm,

bề mặt nhẵn, mặt trên xanh đậm hơn mặt dưới, mọng nước Bẹ lá ôm khít lấy thân Mép lá nguyên , thường có màu vàng khi lá già Lá thường có màu tím ở những cây có nhiều ánh sáng Gân lá song song

Hoa hợp thành xim, sắp xếp ở ngọn một trục dài và cong thành chùm Cụm hoa không cuống, gồm 6-12 bông hoa Hoa màu trắng, có cuống, cuống hoa dài 1mm

Lá bắc ngoài cụm hoa hình vỏ trấu, kích cỡ 1cm x 1cm, màu vàng Lá bắc của hoa hình lòng thuyển, kích thước 1,5mm x 3mm, phần dưới trắng, phần trên xanh, mép

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

4

nguyên, có lông mịn phía dưới Tràng 3, hình trứng, kích thước 1mm x 2,5mm, màu trắng , mép nguyên Nhị 6, rời, chỉ nhị dài khoảng 1,5mm, phần dưới dính với cánh hoa, bao phấn hình hạt đậu, đính vào hai bên trung đới Bầu trên, 3 ô, cao khoảng 0,5mm, vòi nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5mm, núm nhụy hình chổi

Thành phẩn hóa học : các lipid gồm triacylglycerid, sulfolipid, digalactosylglycerid Các acid béo : paraffinic, olefinic Các sắc tố: caroten, chlorofyl, phytosterol Các flavonoid : quercetin, kaempferol isoorientin (3’,4’,5’,7’-tetrahydroxyflavone-6-C-β-D-glucopyranosid) Các vitamin PP, B2 và các nguyên tố vi lượng : Fe, Cr, Ni, Cu

1.2 Những nghiên cứu về cây lược vàng [2,6,7]

Các nhà khoa học tại Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội và Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã phân lập thành công hợp chất flavon C-glucosid, isoorientin[2]

, ginsenoside và L-tryptophan là những hợp chất có rất nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý trong lĩnh vực làm

thuốc, thực phẩm chức năng

Hợp chất isoorientin (3’,4’,5’,7’tetrahydoxyflavone-6-C-β-D-glucopyranosid)

là một flavon có mặt trong một số loài thực vật bậc cao

Nhiều nghiên cứu[6] đã cho thấy hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học

có giá trị trong các thử nghiệm in vitro và in vivo, bao gồm hoạt tính chống oxi

hóa, kháng viêm, kháng sinh, bảo vệ gan, hạ đường huyết Một nghiên cứu trên

chuột cho thấy isoorientin được hấp thụ kém qua đường ruột nhưng lại được chuyển hóa thành các sản phẩm khác nhờ vi sinh vật đường ruột, đồng thời, thời gian lưu giữ trong ruột khá dài (khoảng 12h) đủ để hợp chất này thể hiện các tác dụng sinh học Trước đó, nghiên cứu của Hatori và các cộng sự đã chứng minh rằng isoorientin chuyển hóa thành các dẫn xuất 6-C-glucosyleriodictyol, eriodictyol, luteotin, acid 3,4-dihydroxyphenylpropionic và phloroglucinol khi

được ủ kị khí với các vi sinh vật đường ruột

Giống như các chất thuộc nhóm flavonoid, hoạt tính chống oxi hóa của isoorientin thể hiện rõ rệt trong các nghiên cứu trên hệ DPPH và lipid peroxid với giá trị IC50 khá thấp (9-10µM) Khả năng chống oxi hóa này được chứng minh do isoorientin kích thích sự hoạt hóa của yếu tố phiên mã Nrf2, từ đó thức đẩy quá trình tổng hợp các gene liên quan đến khả năng chống oxi hóa như NAD(P)H:

quinone oxidoreductase 1 (NQO-1), hemeoxigenase 1 (HO-1), periaxin (PRX)

Hoạt tính cống viêm của isoorientin cũng được nghiên cứu khá chi tiết trong thời gian gần đây Năm 2004, Kupeli[7]

và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng chống viêm của isoorientin trên chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan Kết quả cho thấy, với liều 30mg/kg thể trọng, isoorientin làm giảm đến hơn 40% thể tích khối viêm

mà hoàn toàn không gây độc cho dạ dày Trong một thí nghiệm khác, isoorientin ở liều 25mg/kg thể trọng làm giảm đến 57% tế bào bạch cầu và 40% hoạt tính myeloperoxidase trên mô hình chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan Nghiên cứu của Odontuya và cộng sự cũng cho thấy isoorientin có khả năng ức chế quá trình tổng hợp thromoxan B2, một sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic có liên

quan trực tiếp đến quá trình viêm và tự miễn

Một hoạt tính đáng quan tâm khác của isoorientin là những tác dụng liên quan đến bệnh tiểu đường Có khá nhiều nghiên cứu chứng tỏ isoorientin khá khả năng làm hạ đường huyết, giảm mỡ máu Thí nghiệm trên mô hình chuột gây tiểu

đường bằng streptozotocin cho thấy cao chiết nước và butanol từ lá cây Cecropia obtusifolia chứa isoorientin có tác dụng làm giảm đường huyết sau khi cho uống

3h Sau đó, với thí nghiệm tương tự, Sezik và cộng sự đã chứng minh isoorientin

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

6

với liều 15m/kg thể trọng làm giảm đáng kể lượng đường glucose trong máu trong vòng 5-15 ngày Tuy nhiên, một nghiên cứu khác, isoorientin lại không tác dụng đến α-glucosidase, một enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa

glucose

Hợp chất isoorientin thể hiện hoạt tính kháng sinh yếu trên các chủng vi khuẩn

và nấm với giá trị MIC trong khoảng 100-200 µg/mL Trong một số nghiên cứu, mặc dù dịch chiết các mẫu thực vật chứa isoorientin ức chế mạnh sự phát triển các chủng vi sinh vật kiểm định, nhưng khi được phân lập ra, hoạt tính của isoorientin

lại có giá trị thấp hơn dịch chiết ban đầu

Ngoài những hoạt tính sinh học kể trên, isoorientin còn thể hiện nhiều tác dụng khác như bảo vệ gan, thận, chống tụ máu, ức chế enzym acetylcholinesterase và butyrylchlolinesterase vốn có liên quan đến các bệnh về thần kinh

1.3 Tổng quan về các phương pháp sắc ký

1.3.1 Sắc ký cột (column chromatography) [3,4]

Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp nhiều loại hợp chất

ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm 2 pha : một pha động và một pha tĩnh)

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150µm) được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay dưới ống dẫn ra của cột

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau Với hai phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột

chậm hơn so với phân tử nhỏ và cũng có khi nó còn ở lại trong cột lâu hơn so với vài phân tử tuy có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ

1.3.2 Sắc ký bản mỏng [3]

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu, trong đó, pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng

- Bình sắc ký : một chậu, lọ, hũ, bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy

- Pha tĩnh : một lớp mỏng khoảng 0,25mm của một loại chất hấp thu được tráng mỏng, đều, phủ lên nền phẳng

- Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1microlit dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

- Pha động : dung môi, hoặc hỗn hợp hai dung môi di chuyển chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất theo nó Dung môi di chuyển lên cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy thuộc vào độ hóa tan của mẫu chất trong dung môi

Với chất hấp thu là silics gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm