Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro và in vivo của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae)

Thạch hộc tự nhiên (Kim thoa Thạch hộc) (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) là thực vật quý hiếm đã được chứng minh có hiệu quả chống oxy hóa mạnh trên thực nghiệm và xu hướng hiện nay là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO VÀ IN VIVO CỦA CAO CHIẾT THẠCH HỘC NUÔI CẤY MÔ VÀ THẠCH HỘC TỰ NHIÊN (DENDROBIUM NOBILE LINDL ORCHIDACEAE) Lâm Cẩm Tiên*, Trần Cơng Luận** TĨM TẮT Tình hình chung mục tiêu nghiên cứu: Thạch hộc tự nhiên (Kim thoa Thạch hộc) (Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae) thực vật quý chứng minh có hiệu chống oxy hóa mạnh thực nghiệm xu hướng áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn chất lượng cao Để góp phần làm rõ tác dụng dược lý Thạch hộc nuôi cấy mô so với Thạch hộc trồng tự nhiên, khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan Thạch hộc nuôi cấy mô in vitro, in vivo thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro: khảo sát hoạt tính ức chế peroxy hố lipid màng tế bào não chuột thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA) Nghiên cứu in vivo: Các cao thử liều khác cho uống liên tục ngày sau tiêm cyclophosphamide liều 150 mg/kg thể trọng chuột Kết đánh giá dựa định lượng MDA GSH gan Kết quả: Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên có IC50 = 34,86 (μg/ml) tương đương với thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32 (μg/ml) mạnh cao Thạch hộc nuôi cấy mơ có IC50 = 86,20 (μg/ml) Tác dụng chống oxy hóa in vivo: mẫu cao có tác dụng chống oxy hóa tương đương nhau, làm giảm hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH gan chuột Kết luận: Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên có IC50 = 34,86 (μg/ml) yếu so với thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32 (μg/ml) mạnh cao Thạch hộc ni cấy mơ có IC50 = 86,20 (μg/ml) Tác dụng chống oxy hóa in vivo: mẫu cao có tác dụng chống oxy hóa tương đương nhau, làm giảm hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH gan chuột Từ khóa: Thạch hộc tự nhiên, Thạch hộc ni cấy mơ, chống oxy hóa, MDA, GSH ABSTRACT IN VITRO AND IN VIVO STUDY ON ANTIOXIDANT EFFECTS OF EXTRACTS FROM WILD DENDROBIUM AND TISSUE CULTURE DENDROBIUM (DENDROBIUM NOBILE LINDL ORCHIDACEAE) Lam Cam Tien, Tran Cong Luan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 17 – 24 Background and aims: Wild dendrobium (Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae) is a rare plant that has been proven to have potent antioxidant efficacy in the experiment and the current trend is to apply plant biotechnology to produce medicinal sources with a large scale and high quality In order to clarify the pharmacological effect of tissue culture dendrobium in comparison with wild dendrobium, we investigated the in vitro and in vivo antioxidant effect in trend of hepatoprotective effect Methods: For in vitro study, the anti-lipid peroxidation effect of test extracts on malonyl dialdehyde (MDA) test were examined For in vivo study, acoholic extract from tissue culture dendrobium and wild dendrobium were given orally in days after single dose of cyclophosphamide (intraperitoneal injection at 150 mg/kg body weight) * Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược TP HCM Tác giả liên lạc: ThS BS Lâm Cẩm Tiên ** Đại học Công nghệ Miền Đông ĐT: 01699940841 Email: lamcamtien2015@gmail.com 17 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Evaluation were checked with a quantification of hepatic MDA and GSH Results: Based on IC50, wild dendrobium with IC50 34.86 (μg/ml) was shown equivalent in vitro antioxidant activity activity to Trolox (28.32 μg/ml) and better than tissue culture dendrobium (86.20 μg/ml) For in vivo study, the results indicated that both extracts effectively reduced the levels of MDA and significantly increased the levels of GSH in mouse liver Conclusion: In vitro antioxidant activity: alcoholic extractions of wild dendrobium has IC50 = 34.86 μg/ml, lower than Trolox with IC50 = 28.32 (μg/ml) and higher than alcoholic extractions of tissue culture dendrobium with IC50 = 86.20 (μg/ml) In vivo antioxidant activity: Both samples were equally effective in antioxidant activity, which reduced MDA and increased GSH levels in mices Keywords: Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae., wild dendrobium, tissue culture dendrobium, antioxidant effect, MDA, GSH Nguyễn Hữu Thọ, ấp 2, xã Long Thới, huyện ĐẶT VẤN ĐỀ Nhà bè, TP HCM cung cấp Mẫu cấy từ Đã từ lâu, Thạch hộc (Dendrobium nobile thân Thạch hộc, nuôi ống nghiệm Lindl Orchidaceae) dược tháng với môi trường sử dụng MS bổ sung liệu quý, Trung Quốc sử dụng 30g/l đường, 8g/l agar, 50g/l khoai tây, 200ml/l thuốc giảm đau, hạ sốt, kích thích dày, để cải nước dừa, 1g/l than hoạt tính, mẫu ni thiện cảm giác ngon miệng, kích thích tiết nước cấy điều kiện pH 5,7 - 5,8, thời gian chiếu bọt, điều trị bệnh khác nhau, viêm sáng 16 giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux, dày, đái tháo đường, lão hóa da, bệnh tim nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm trung bình 50 - 60% mạch, mà phần lớn cho liên quan chặt Mẫu sấy khô nhiệt độ 45 - 50oC chẽ với trao đổi chất, chống lại rối loạn bảo quản hộp kín việc tạo gốc tự do(1) Một số nghiên cứu Thạch hộc tự nhiên vườn lan xã nước chứng minh Thạch hộc có tác Qui Đức, huyện Bình Chánh, TP HCM cung dụng kháng viêm, chống tế bào ung thư, chống cấp Mẫu sấy khô nhiệt độ 45-50oC đột biến gen điều hòa miễn dịch,…gần định danh Trung Tâm Sâm Dược cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro(2) Liệu TP HCM Hiện Thạch hộc thực vật quý hiếm, Phương tiện đưa vào sách đỏ, cần bảo tồn(6), nên Hóa chất: Cyclophosphamid momohydrat xu hướng áp dụng cơng nghệ sinh học (CY-Endoxan® 500 mg), Acid tricloacetic (TCA), thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn Acid thiobarbituric (TBA), Silymarin Sigma chất lượng cao Co.Ltd, USA; Đệm Phosphat (PBS), Dung dịch Để so sánh làm rõ tác dụng chống oxy hóa dimethyl sulfosid (DMSO), Kali clorid 1,15% Thạch hộc nuôi cấy mô so với Thạch hộc (KCl), Natri clorid 0,9% (NaCl), Đệm Tris-HCl trồng tự nhiên, tiếp tục khảo sát tác Merck Co Germany, Trolox (Calbiochem dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan Ltd Co.) Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên in Thuốc đối chiếu: Silymarin Sigma Co vitro, in vivo thực nghiệm Ltd, USA ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCÚU Đối tượng nghiên cứu Thạch hộc nuôi cấy mô Công ty cổ phần khoa học công nghệ Anh Đào, số 1031, 18 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đồng hai giới (chủng Swiss albino, - tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2g), cung cấp Viện Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Vắcxin Sinh phẩm Y tế Nha Trang Trong suốt trình thử nghiệm chuột nuôi với thức ăn viên điều kiện môi trường ổn định Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập Phương pháp xác định khả ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA)(5) Xác định khả ức chế peroxy hóa lipid mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), sản phẩm trình peroxy hóa lipid màng tế bào MDA có khả phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại λ = 532 nm Nghiên cứu Y học sử dụng làm chất đối chiếu Tính tốn kết Cơng thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100 ODC: Mật độ quang chứng dung môi (DMSO) ODT: Mật độ quang mẫu thử Các số liệu kết thử nghiệm biểu thị trị số trung bình lần đo khác Cách tính giá trị IC50 Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả dập tắt gốc tự hay khả ức chế peroxy hóa lipid theo nồng độ khảo sát chất cần thử nghiệm phần mềm Excel Từ đồ thị, nội suy giá Pha thuốc thử TBA 0,8% Mỗi mẫu thử cao cồn nuôi cấy mô tự nhiên tiến hành nghiên cứu nồng độ: 2000µg/ml, 1000µg/ml, 500µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml (các mẫu pha dd DMSO) Chiết 5g bột dược liệu bình tam giác diethyl ether bể siêu âm khoảng 20 phút (4 lần × 30ml) Chiết đến dịch ether sau bốc khơng để lại vết mờ mặt kính đồng hồ Gộp dịch chiết lại, lọc, cô đến khoảng 50ml dịch chiết Bã dược liệu sau chiết ether chiết cồn cao độ (96%) bếp cách thuỷ (3 lần × 30ml) Gộp dịch chiết lại, lọc, lại đến khoảng 50ml dịch chiết trị nồng độ dập tắt gốc tự hay ức chế peroxy Tách não chuột nghiền đồng thể dung dịch đệm phosphat mM theo tỉ lệ 1: 10 (não: dung dịch đệm) nhiệt độ - 5oC Lấy 0,5ml dịch đồng thể, thêm vào 0,1ml nồng độ mẫu thử 1,4ml đệm phosphat, ủ 37oC 15 phút Kết thúc phản ứng 1ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2ml dịch cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% 100oC 15 phút đo màu λ = 532nm Các mẫu đo lần lấy kết trung bình hai lần đo Trolox (Calbiochem Ltd Co.), đồng phân vitamin E Đỗ Trung Đàm Từ Dmax định chọn liều cho thử nghiệm 1/10, 1/20 Dmax Thạch hộc ni cấy hóa lipid IC50 cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b y = 50 vào để suy IC50 Gây mơ hình tổn thương gan cyclophosphamide(3) Đã xác định Dmax cao chiết Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên: Đối với Thạch hộc nuôi cấy 25g/kg chuột (tương đương 126,45g dược liệu khô) Đối với Thạch hộc tự nhiên 28,6g/kg chuột (tương đương 348,78g dược liệu khô) Theo “Phương pháp xác định độc tính cấp” 1/20, 1/40 Dmax Thạch hộc tự nhiên Cao chiết Thạch hộc nuôi cấy: liều 2,5g/kg (1/10 Dmax), liều 1,25g/kg (1/20 Dmax) Cao chiết Thạch hộc tự nhiên: liều 1,43g/kg (1/20 Dmax), liều 0,715g/kg (1/40 Dmax) Chuột tiêm phúc mạc lần cyclophosphamide (CY) liều 150mg/kg, chia lô theo bảng sau: 19 Nghiên cứu Y học Bảng Mơ hình nghiên cứu tác dụng chống oxy hố in vivo cao chiết Thạch hộc Nhóm Lơ (n= 8) Chứng Thử cao nuôi cấy CY (-) Thử cao tự nhiên Đối chiếu Chứng Thử cao nuôi cấy Thử cao nuôi cấy CY (+) Thử cao tự nhiên Thử cao tự nhiên Đối chiếu Tiêm phúc Mẫu thử uống (10 ml/kg mạc CY thể trọng chuột) (-) nước cất 2,5 g/kg chuột (tương (-) đương 12,65 g dược liệu khô) 1,43 g/kg chuột (tương (-) đương 17,44 g dược liệu khô) (-) silymarin 0,1 g/kg chuột 150 mg/kg nước cất 1,25 g/kg chuột (tương 150 mg/kg đương 6,32 g dược liệu khô) 2,5 g/kg chuột (tương 150 mg/kg đương 12,65 g dược liệu khô) 0,715 g/kg chuột (tương 150 mg/kg đương 8,72 g dược liệu khô) 1,43 g/kg chuột (tương 150 mg/kg đương 17,44 g dược liệu khô) silymarin 0,1 g/kg thể trọng 150 mg/kg chuột Các cao thử nghiệm cho uống lần ngày vào buổi sáng (8 - h) liên tục ngày sau tiêm cyclophosphamid Vào ngày thứ 8, sau lần cho uống cuối mổ tách gan chuột đem định lượng MDA GSH Phương pháp xác định hàm lượng malondialdehyd (MDA) glutathion (GSH) gan chuột (4) Tách gan chuột nghiền đồng thể dung dịch đệm KCl 1,15% Lấy - 2ml dịch đồng thể, thêm dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vđ ml Ủ hỗn hợp phản ứng 37oC 60 phút dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% MDA: Sau ly tâm lấy 2ml dịch cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% 100oC 15 phút đo quang λ = 532 nm Hàm lượng MDA (nM/ml) tính theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA GSH: Sau ly tâm lấy 1ml dịch trong, cho phản ứng với 0,2ml thuốc thử Ellman thêm đệm EDTA phosphat vđ ml 20 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Để phút nhiệt độ phòng sau tiến hành đo quang bước sóng λ = 412 nm Hàm lượng GSH (nM/g protid) tính theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn GSH Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Các liệu trình bày dạng Mean ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn trị số trung bình) Việc xử lý thống kê đề tài dùng phần mềm phần mềm SigmaStat 3.5 Các số liệu khảo sát nhóm súc vật thí nghiệm độc lập (nhóm chứng nhóm dùng thuốc) mẫu bé (< 30) Do phương pháp thống kê sử dụng phép kiểm Student cho dãy số liệu độc lập So sánh khác nhóm có tác dụng gây ngủ phép kiểm One – Way ANOVA t – test (phần mềm SigmaStat 3.5) Sự khác xem có ý nghĩa giá trị P < 0,05 so với lơ chứng KẾT QUẢ Hoạt tính chống oxy hóa in vitro Trong thử nghiệm MDA, mẫu thử cao cồn Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên làm giảm màu phức hợp MDA acid thiobarbituric, chứng tỏ mẫu thử có nhóm chất có hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên làm giảm hàm lượng MDA dịch não chuột, dẫn đến tượng giảm màu của phức hợp Dựa vào IC50 thử nghiệm MDA, sơ kết luận hoạt tính chống oxy hóa in vitro Thạch hộc tự nhiên mạnh Thạch hộc nuôi cấy mô Bảng Kết thuốc đối chiếu Trolox Nồng độ ban đầu (mM) Nồng độ ban đầu (µg/ml) Nồng độ phản ứng (µg/ml) OD HTCO% 10 0,5 0,1 2500 1250 250 125 25 125,00 62,50 12,50 6,25 1,25 0,124 0,203 0,376 0,445 0,529 77,70 63,49 32,37 19,96 4,86 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Từ bảng xây dựng phương trình logarit y = 16,26ln(x) – 4.391; R2 = 0,974; suy IC50 = 28,32 (µg/ml) Từ bảng 3, Thạch hộc nuôi cấy mô, xây dựng phương trình logarit y = Nghiên cứu Y học 9,215ln(x) + 8,931; R2=0,971; suy IC50 = 86,20 (µg/ml) Đối với Thạch hộc tự nhiên, xây dựng phương trình logarit y = 12,95ln(x) + 3,998; R2=0,966; suy IC50= 34,86 (µg/ml) Bảng Kết thử test MDA mẫu Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên Nồng độ Ban đầu (µg/ml) Nồng độ phản ứng (µg/ml) 2000 1000 500 100 50 100 50 25 2,5 Thạch hộc nuôi cấy mô OD L1 0,161 0,216 0,251 0,29 0,32 L2 0,192 0,206 0,25 0,286 0,306 Nghiên cứu in vivo Kết khảo sát hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) gan sau gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamide Bảng Kết khảo sát hàm lượng MDA gan lô cho uống cao Thạch hộc ni cấy mơ Thạch hộc tự nhiên Nhóm Lơ (n= 8) Chứng bình thường Thạch hộc ni cấy CY (-) Thạch hộc tự nhiên Silymarin Chứng bệnh lý Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc nuôi cấy CY (+) Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc tự nhiên Silymarin Liều uống Hàm lượng MDA (g/kg) (nM/g protein) 35,061 ± 3,638 2,5 41,843 ± 2,628 # 1,43 46,259 ± 2,922 0,1 31,725 ± 1,79 # 62,181 ± 3,119 1,25 45,513 ± 2,729 * ,$ 2,5 50,177 ± 4,482* 0,715 47,921 ± 5,718 * 1,43 42,014 ± 3,929 * 0,1 36,184 ± 2,801* TB 0,177 0,211 0,251 0,288 0,313 HTCO% 53,86 44,84 34,51 24,71 18,17 Thạch hộc tự nhiên OD L1 0,121 0,174 0,255 0,295 0,317 L2 0,124 0,182 0,229 0,272 0,315 TB 0,123 0,178 0,242 0,284 0,316 HTCO% 67,97 53,46 40,00 25,88 17,39 1,43g/kg có hàm lượng MDA gan tăng so với lô chứng lô đối chiếu silymarin 0,1g/kg đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05), điều cho thấy cao Thạch hộc tự nhiên khơng có tác dụng chống oxy hóa thể chuột bình thường, chưa có nghiên cứu so sánh tác dụng chống oxy hóa Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy mô thực ngồi nước trước đây, cần tiến hành thêm thử nghiệm khác với số chuột thử nghiệm cao để đưa kết luận tính chống oxy hóa Thạch hộc tự nhiên ni cấy mơ Nhóm bệnh lý CY (+) Lơ chứng tiêm cyclophosphamid uống nước cất ngày làm tăng hàm lượng MDA so với lơ chứng bình thường đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Nhóm bình thường CY (-) Hàm lượng MDA gan lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25g/kg 2,5g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) cho thấy cao Thạch hộc nuôi cấy mơ có tác dụng ức chế gia tăng hàm lượng MDA gan gây cyclophosphamid Lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 2,5g/kg lơ đối chiếu silymarin 0,1g/kg có hàm lượng MDA gan khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao Thạch hộc nuôi cấy mơ khơng có tác dụng thể chuột bình thường Hàm lượng MDA gan lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715g/kg 1,43g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05) cho thấy cao Thạch hộc tự nhiên có tác dụng ức chế gia tăng hàm lượng MDA gan gây cyclophosphamid Lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều Lô đối chiếu silymarin (0,1g/kg) thể (#): P < 0,05 so với lô chứng CY (-) (*): P < 0,05 so với lô chứng CY (+) tương ứng ($): P < 0,05 so với lô đối chiếu silymarin CY (+) Từ bảng 4, cho thấy: 21 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học tác động làm giảm gia tăng hàm lượng MDA gây cyclophosphamid so với lô chứng đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05), tác dụng làm giảm hàm lượng MDA lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25g/kg không khác biệt so với lô đối chiếu silymarin (0,1g/kg); lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715g/kg 1,43g/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA không khác biệt so với lô đối chiếu silymarin 0,1g/kg Lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy liều 1,25g/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA (giảm 26,8% so với lô chứng bệnh) không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715g/kg (giảm 22,9% so với lô chứng bệnh) 1,43g/kg (giảm 32,4% so với lô chứng bệnh) Kết khảo sát hàm lượng glutathion (GSH) gan sau gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamide Bảng Kết khảo sát hàm lượng GSH gan lô cho uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên Nhóm Lơ (n= 8) Chứng bình thường Thạch hộc ni cấy mơ CY (-) Thạch hộc tự nhiên Silymarin Chứng bệnh lý Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc nuôi cấy mô CY (+) Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc tự nhiên Silymarin Liều uống Hàm lượng GSH (nM/g (g/kg) protein) 8627,679 ± 539,418 2,5 8098,171 ± 797,613 1,43 6031,090 ± 484,076 0,1 9693,044 ± 525,897 # 5557,294 ± 388,485 1,25 7170,738 ± 586,503 * 2,5 7515,966 ± 824,415 * # $ 0,715 5884,622 ± 301,588 1,43 6869,425 ± 337,289 * 0,1 ,$ 8442,570 ± 437,238 * # ( ): P < 0,05 so với lô chứng CY (-) (*): P < 0,05 so với lô chứng CY (+) tương ứng ($): P < 0,05 so với lô đối chiếu silymarin CY (+) Từ bảng 5, cho thấy: Nhóm bình thường CY(-) Lơ cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 2,5g/kg 22 lơ đối chiếu silymarin 0,1 g/kg có GSH gan không thay đổi so với lô chứng, chứng tỏ cao Thạch hộc ni cấy mơ khơng có tác dụng thể chuột bình thường Lơ uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg có hàm lượng GSH gan giảm so với lô chứng lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05), chứng tỏ cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg khơng có tác dụng chống oxy hóa thể chuột bình thường, kết phù hợp với kết định lượng MDA giảm lô dùng Thạch hộc tự nhiên Bảng 3, cần tiến hành thêm thử nghiệm khác với số chuột thử nghiệm cao để đưa kết luận tính chống oxy hóa Thạch hộc tự nhiên ni cấy mơ Nhóm bệnh lý CY(+) Lô chứng tiêm cyclophosphamid uống nước cất ngày có hàm lượng GSH giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bình thường (p < 0,05) Hàm lượng GSH gan lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25 g/kg 2,5 g/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng (p < 0,05) Lô đối chiếu silymarin (0,1 g/kg) thể tác động làm tăng hàm lượng GSH so với lô chứng tương ứng đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05); lô uống cao Thạch hộc ni cấy mơ liều 1,25 g/kg 2,5 g/kg có tác dụng làm tăng hàm lượng GSH không khác biệt so với lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg Hàm lượng GSH gan lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715 g/kg tăng không đạt ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bệnh lý có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chiếu silymarin (0,1 g/kg) (p < 0,05) Hàm lượng GSH gan lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bệnh lý khơng có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Lô uống cao Thạch hộc ni cấy có tác dụng làm tăng hàm lượng GSH liều 1,25 g/kg (tăng 29% so với lô chứng bệnh) 2,5 g/kg (tăng 35,2% so với lô chứng bệnh) không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg (tăng 23,6% so với lô chứng bệnh) BÀN LUẬN Hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua thử nghiệm MDA MDA chất sinh q trình peroxy hóa lipid màng tế bào, phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo phức hợp có màu hồng Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc làm giảm màu phức hợp làm giảm lượng MDA có mẫu Kết thử nghiệm cho thấy mẫu thử cao Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên làm giảm màu phức hợp MDA acid thiobarbituric, chứng tỏ mẫu thử có chất có hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên làm giảm hàm lượng MDA dịch não chuột, dẫn đến tượng giảm màu của phức hợp Vậy mẫu thử có tác dụng bắt giữ gốc tự do, nồng độ mẫu Thạch hộc ni cấy mơ IC50 = 86,20 (µg/ml) (bảng 2) nồng độ mẫu Thạch hộc tự nhiên IC50 = 34,86 (µg/ml) (bảng 3) Dựa bảng 1, cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao Thạch hộc nuôi cấy mô cao Thạch hộc tự nhiên tăng theo nồng độ khảo sát (từ 50 µg/ml đến 2000 µg/ml) Ở nồng độ 2000 µg/ml cao Thạch hộc tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa tương đương với chất đối chiếu Trolox nồng độ mM cao gấp 1,3 lần so với cao Thạch hộc nuôi cấy Dựa vào IC50 thử nghiệm MDA cho thấy hoạt tính chống oxy hóa Thạch hộc tự nhiên với IC50 = 34,86 (µg/ml) yếu so với thuốc đối chiếu IC50 = 28,32 (µg/ml) mạnh Thạch hộc ni cấy mơ IC50 = 86,20 (µg/ml) Theo nghiên cứu Trung Quốc cao chiết cồn Thạch hộc có nobilin D E (alkaloid) ly trích từ có khả chống oxy hóa mạnh thử nghiệm dùng phương Nghiên cứu Y học pháp 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) với IC50 = 32 (µg/ml) tương đương với thuốc đối chiếu Trolox(7) Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vivo Khảo sát hàm lượng MDA gan MDA gan sản phẩm q trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan, hàm lượng MDA gan cao chứng tỏ gan bị tổn thương oxy hóa nặng Kết bảng ghi nhận lô chứng tiêm cyclophosphamid uống nước cất ngày có hàm lượng MDA gan tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bình thường, chứng tỏ cyclophosphamid gây tổn thương peroxy hóa tế bào gan dẫn đến việc làm tăng hàm lượng MDA gan Hàm lượng MDA gan lô tiêm cyclophosphamid uống thuốc đối chiếu silymarin liều 0,1 g/kg; cao Thạch hộc nuôi cấy mô với liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg cao Thạch hộc tự nhiên với liều 0,715 g/kg; 1,43 g/kg thể trọng chuột ngày làm hàm lượng MDA giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý, cho thấy silymarin, cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715 g/kg; 1,43 g/kg có tác dụng bảo vệ gan theo chế chống oxy hóa thể qua việc làm giảm hàm lượng MDA gan gây cyclophosphamid So sánh tác dụng làm giảm hàm lượng lượng MDA lô thử cao Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy mô cho thấy Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25 g/kg so với lô uống liều 0,715 g/kg 1,43 g/kg cao Thạch hộc tự nhiên khác biệt không ý nghĩa thống kê với với lô uống silymarin liều 0,1 g/kg Chứng tỏ tác dụng làm giảm hàm lượng MDA gan mẫu cao Thạch hộc tự nhiên cao Thạch hộc nuôi cấy tương đồng với Khảo sát hàm lượng GSH gan Kết bảng ghi nhận có giảm hàm lượng GSH lô chứng tiêm cyclophosphamid so với lô chứng sinh lý CY (-) Điều cho thấy GSH nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein N-acetylcystein) 23 Nghiên cứu Y học với chức giải độc thông qua hệ thống cytocrom P - 450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa cyclophosphamid thể Độc tính cyclophosphamid tăng kéo theo suy giảm GSH nội sinh gan, gián tiếp làm tăng q trình peroxy hóa lipid dẫn đến hàm lượng MDA tăng Kết thu lô tiêm cyclophosphamid thuốc đối chiếu silymarin liều 0,1 g/kg; uống cao Thạch hộc nuôi cấy với liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1.43 g/kg ngày làm hàm lượng GSH tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý Cho thấy cao Thạch hộc nuôi cấy liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan thông qua việc phục hồi hàm lượng GSH bị suy giảm cyclophosphamid So sánh tác dụng làm tăng hàm lượng lượng GSH cao Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy cho thấy Thạch hộc nuôi cấy liều 1,25 g/kg 2,5 g/kg so với lô uống liều 1,43 g/kg cao Thạch hộc tự nhiên khác biệt không ý nghĩa thống kê so với lô uống silymarin liều 0,1 g/kg Chứng tỏ tác dụng làm tăng hàm lượng GSH gan mẫu cao Thạch hộc tự nhiên cao Thạch hộc nuôi cấy tương đồng với KẾT LUẬN Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên có IC50 = 34,86 (µg/ml) yếu thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32 (µg/ml) 24 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 mạnh cao Thạch hộc ni cấy mơ có IC50 = 86,20 (µg/ml) Tác dụng chống oxy hóa in vivo: mẫu cao có tác dụng chống oxy hóa tương đương nhau, làm giảm hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH gan chuột TÀI LIỆU THAM KHẢO China’s Pharmarcopoiea, Part One (1977) The People’s Health Sciences Publication Beijing (Peking), China, pp 145 Lee YH, Park JD, Baek NI, Kim SI, Ahn BZ (1995) "In Vitro and In Vivo Antitumoral Phenanthrenes from the Aerial Parts of Dendrobium nobile" Planta Medica; 61(2): 178-180 Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008) “Tác dụng Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm F Nees Acanthaceae) thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamide” Y học TP Hồ Chí Minh; 12(4): 142-147 Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2010) “Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)” Tạp chí Y học TP.HCM; 14(2): 129 – 134 Viện Dược liệu (2006) Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ Dược thảo NXB Khoa học Kỹ thuật; tr 28-35, 279-292, 367 Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007) Sách Đỏ Việt Nam NXB Khoa học tự nhiên công nghệ; tr 57-60 Zhang X, Xu JK, Wang J, Wang NL, Kurihara H, Kitanaka S, Yao XS (2007), "Bioactive Bibenzyl Derivatives and Fluorenones from Dendrobium nobile" J Nat Prod.; 70: 24-28 Ngày nhận báo: 25/04/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/06/2018 Ngày báo đăng: 20/09/2018 ... Thạch hộc tự nhiên Nhóm Lơ (n= 8) Chứng bình thường Thạch hộc nuôi cấy CY (-) Thạch hộc tự nhiên Silymarin Chứng bệnh lý Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc nuôi cấy CY (+) Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc tự. .. uống cao Thạch hộc ni cấy mơ Thạch hộc tự nhiên Nhóm Lơ (n= 8) Chứng bình thường Thạch hộc ni cấy mô CY (-) Thạch hộc tự nhiên Silymarin Chứng bệnh lý Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc nuôi cấy mô. .. silymarin liều 0,1 g/kg Chứng tỏ tác dụng làm tăng hàm lượng GSH gan mẫu cao Thạch hộc tự nhiên cao Thạch hộc nuôi cấy tương đồng với KẾT LUẬN Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên