Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của nấm linh chi đỏ (ganoderma lucidum)

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA THEO HƯỚNG BẢO VỆ GAN CỦA NẤM LINH CHI ĐỎ (GANODERMA LUCIDUM) Nguyễn Thị Thu Hương∗, Nguyễn Thị Ngọc Hằng** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nhiều công trình nghiên cứu ñã chứng minh nấm linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hoạt ñộng hệ miễn dịch có hiệu trị liệu tốt cho bệnh nhân bị ung thư bị bệnh gan Đề tài ñược thực với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan cao chiết cồn cao chiết nước linh chi ñỏ giống Nhật ñược nuôi trồng Việt Nam mô hình thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan cyclophosphamide Đối tượng-Phương pháp nghiên cứu: Cao cồn ñược chuẩn bị cách chiết hồi lưu bột nguyên liệu với cồn 96% Cao nước ñược chuẩn bị cách ñun nguyên liệu với nước nóng 100°C Nghiên cứu in vitro: khảo sát hoạt tính dập tắt gốc tự thử nghiệm 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid màng tế bào não chuột thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA) Nghiên cứu in vivo: Các cao thử liều tương ñương 5g dược liệu/kg thể trọng ñược cho uống liên tục ngày sau tiêm phúc mạc liều cyclophosphamide 150 mg/kg thể trọng Vào ngày thứ 8, mổ tách lấy gan chuột ñem ñịnh lượng MDA Kết quả: Kết nghiên cứu in vitro cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao cồn mạnh cao nước Nghiên cứu in vivo cho thấy cyclophosphamide làm tăng hàm lượng MDA gan lô chứng uống nước cất Cao cồn linh chi ñỏ chưa thể tác dụng làm giảm gia tăng hàm lượng MDA gây cyclophosphamide cao nước lại làm giảm ñạt ý nghĩa thống kê gia tăng hàm lượng MDA so với lô chứng Kết luận: Linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy hóa, thải trừ gốc tự do, ức chế trình peroxy hóa màng tế bào, làm giảm tăng hàm lượng MDA gan bị gây tổn thương oxy hóa cyclophosphamide Từ khóa: Nấm Linh chi ñỏ, cyclophosphamide, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng bảo vệ gan SUMMARY STUDY ON ANTIOXIDANT EFFECTS OF GANODERMA LUCIDUM ON CYCLOPHOSPHAMIDE-INDUCED HEPATOTOXICITY Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Thi Ngoc Hang Objectives: Ganoderma lucidum (Fr.) Karst (Lingzhi or Reishi) is a medicinal mushroom widely used in Asia, and has antioxidant effect, promotes immune function and induces some positive benefits for cancer patients, as well as patients with liver disease The purpose of this study was to evaluate the in vitro antioxidant activity and hepatoprotective effect of ethanol extract and aqueous extract of Ganoderma lucidum cultivated in Vietnam on liver damage induced by cyclophosphamide in mice Methods: For in vitro study, the free radical scavenging effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) test and the anti-lipid peroxidation effect on malonyl dialdehyde (MDA) test of test extracts were examined For in vivo study, the model of cyclophosphamide-induced liver damage was applied to study on the hepatoprotective effect of test extracts Results: The free radical scavenging effect in DPPH test and the anti-lipid peroxidation effect in MDA test of ethanol extract were higher than those of aqueous extract A single dose of cyclophosphamide at 150 mg/kg body weight (intraperitoneal injection) produced an increase of hepatic MDA content in control mice Aqueous extract alleviated significantly the increase of hepatic MDA content caused by cyclophosphamide Ethanol extract had no effect on cyclophosphamide-induced increase of MDA content Conclusion: Ganoderma lucidum cultivated in Vietnam had shown an antioxidant activity and produced the hepatoprotective effect against cyclophosphamide-induced liver damage ∗ ,** Trung tâm Dược liệu Tp HCM- Viện Dược liệu Địa liên hệ: PGS.TS Ntuyễn Thị Thu Hương ĐT: 38298530 Email: huongsam@hotmail.com 129 Keywords:Ganoderma lucidum, antioxidant activity, cyclophosphamide, oxidative damage, hepatoprotective effect ĐẶT VẤN ĐỀ Stress oxy hóa liên quan ñến số bệnh lý người ung thư, xơ vữa mạch máu, xơ gan, bệnh sa sút trí tuệ,… Các chất có tác dụng chống oxy hóa có khả bảo vệ quan (não, tim, mạch máu, gan, thận) khỏi tác ñộng xấu stress oxy hóa, ñặc biệt người cao tuổi trình lão hóa Nhiều công trình nghiên cứu ñã chứng minh nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hoạt ñộng hệ miễn dịch có hiệu trị liệu tốt cho bệnh nhân bị ung thư bị bệnh gan [3] Cyclophosphamide (CY), thuốc ñược sử dụng phổ biến phác ñồ hóa trị liệu ung thư, tác nhân alkyl hóa kìm tế bào, qua gan ñược biến ñổi sinh học trở thành 4hydroxycyclophosphamide aldophosphamide có tính alkyl hóa cao, dẫn ñến hình thành tác nhân gây ñộc tế bào acrolein, chloroacetaldehyde Những thử nghiệm chuột nhắt trắng chứng minh CY làm gia tăng trình peroxy hóa lipid tế bào gan gây tổn thương oxy hóa gan sử dụng dài ngày [1] Trên sở ñó, ñề tài ñược thực với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan cao chiết cồn cao chiết nước linh chi ñỏ giống Nhật ñược nuôi trồng Việt Nam dựa mô hình thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan cyclophosphamide chuột nhắt trắng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nấm linh chi ñỏ ñược cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Linh chi Nấm Dược liệu Dược liệu ñược xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát Cao cồn ñược chuẩn bị cách chiết hồi lưu soxhlet bột nguyên liệu với cồn 96% theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết ñược cô giảm áp thu ñược cao cồn với hiệu suất chiết 6,6% Cao nước ñược chuẩn bị cách ñun nguyên liệu lần với nước nóng, lần 100°C theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết ñược cô cách thủy thu ñược cao nước với hiệu suất chiết 6% Các cao chiết ñược hòa tan nước cất cho chuột nhắt trắng uống với thể tích 10 ml/kg thể trọng chuột Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng ñực, chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± g, ñược cung cấp Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế – Tp Nha Trang ñược ñể ổn ñịnh tuần trước thử nghiệm Chuột ñược nuôi ñầy ñủ thực phẩm viên, rau xanh nước uống ñầy ñủ Thể tích cho uống cao thử nghiệm hay tiêm phúc mạc cyclophosphamid 10 ml/kg thể trọng chuột Thuốc thử nghiệm Endoxan® chứa 534,5 mg cyclophosphamid monohydrat tương ñương với 500 mg cyclophosphamid khan (ký hiệu CY), Baxter Oncology GmbH, Germany Lô sản xuất 8K593E, sản xuất 11/2008, hạn dùng 11/2011 Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu in vitro Phương pháp xác ñịnh khả dập tắt gốc tự (thử nghiệm DPPH) [2],[ 7] Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo chế dập tắt gốc tự làm giảm màu 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Xác ñịnh khả cách ño quang bước sóng có hấp thu cực ñại λ = 515 nm 0,5 ml mẫu thử nồng ñộ khảo sát ñược cho phản ứng với ñồng lượng dung dịch DPPH 0,8 mM pha MeOH Hỗn hợp sau pha ñược ñể nhiệt ñộ phòng 30 phút Đo quang bước sóng λ = 515 nm Acid ascorbic (Merck, Germany) ñược sử dụng làm chất ñối chiếu Phương pháp xác ñịnh khả ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) [4],[7] Xác ñịnh khả ức chế peroxy hóa lipid mẫu nghiên cứu qua việc xác ñịnh hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), sản phẩm trình peroxy hóa lipid màng tế bào MDA có khả phản ứng với acid thiobarbituric ñể tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có ñỉnh hấp thu cực ñại λ = 532 nm 130 0,1 ml mẫu thử nồng ñộ thử nghiệm ñược cho phản ứng với 0,5 ml dịch ñồng thể não thêm ñệm phosphat 50 mM vừa ñủ ml Ủ hỗn hợp phản ứng 37oC 15 phút dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% Sau ly tâm lấy dịch cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% 15 phút nhiệt ñộ 100oC Làm lạnh tiến hành ño quang bước sóng λ = 532nm Trolox (Calbiochem Ltd Co.), ñồng phân vitamin E ñược sử dụng làm chất ñối chiếu Tính toán kết Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100 ODC: Mật ñộ quang chứng dung môi (DMSO hay MeOH) ODT: Mật ñộ quang mẫu thử Các số liệu kết thử nghiệm ñược biểu thị trị số trung bình lần ño khác Cách tính giá trị IC50: Vẽ ñồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả dập tắt gốc tự hay khả ức chế peroxy hóa lipid theo nồng ñộ khảo sát chất cần thử nghiệm phần mềm Excel Từ ñồ thị, nội suy giá trị nồng ñộ dập tắt gốc tự hay ức chế peroxy hóa lipid IC50 cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b y = 50 vào ñể suy IC50 Phương pháp nghiên cứu in vivo Gây mô hình tổn thương gan cyclophosphamide [6] Chuột thí nghiệm ñược chia thành hai nhóm: - Nhóm bình thường, ký hiệu CY (-): • Lô chứng: uống nước cất • Lô thử: uống cao thử o Cao cồn: liều tương ñương g dược liệu (0,332 g/kg thể trọng) o Cao nước: liều tương ñương g dược liệu (0,300 g/kg thể trọng) - Nhóm bệnh lý, ký hiệu CY(+): chuột ñược tiêm phúc mạc liều cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng • Lô chứng: uống nước cất • Lô thử: uống cao thử o Cao cồn: liều tương ñương 5g dược liệu (0,332 g/kg thể trọng) o Cao nước: liều tương ñương 5g dược liệu (0,300 g/kg thể trọng) Thời gian cho uống ngày khoảng 8-9 sáng liên tục ngày sau tiêm cyclophosphamid Vào ngày thứ 8, sau lần cho uống cuối mổ tách lấy gan chuột ñem ñịnh lượng MDA Phương pháp xác ñịnh hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) gan chuột [7] Tách gan chuột nghiền ñồng thể dung dịch ñệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1:10 nhiệt ñộ 0-5 0C Lấy ml dịch ñồng thể, thêm vào ml dung dịch ñệm Tris - HCl, ủ 37 0C Kết thúc phản ứng ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy ml dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8 % 100 0C 15 phút ño quang λ = 532 nm Đánh giá kết Hàm lượng MDA ñược tính theo phương trình hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981) Sau tính ñược hàm lượng MDA (nmol/ml dịch ñồng thể), suy hàm lượng MDA (nmol/g protid) Các số liệu ñược biểu thị trị số trung bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn giá trị trung bình) xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA StudentNewman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat) Kết thử nghiệm ñạt ý nghĩa thống kê với ñộ tin cậy 95% P < 0,05 so với lô chứng KẾT QUẢ-BÀN LUẬN Kết nghiên cứu in vitro Bảng Hoạt tính chống oxy hóa cao cồn cao nước nấm linh chi ñỏ thử nghiệm DPPH HTCO HTCO Nồng ñộ Cao nước Cao cồn (µg/ml) (%) (%) 2000 54,49 68,01 131 1500 46,26 56,71 1000 34,54 42,99 500 22,11 25,83 100 10,98 12,08 50 9,30 7,71 10 4,22 7,40 Nhận xét bàn luận bảng kết 1: Trong thử nghiệm DPPH, DPPH gốc tự có màu tím nhờ vào ñiện tử N chưa ghép ñôi, sau phản ứng với oxy nguyên tử chất dập tắt gốc tự bị giảm màu tím Hoạt tính chống oxy hóa cao cồn cao nước thể qua việc làm giảm màu DPPH, dẫn ñến giảm ñộ hấp thu bước sóng 515 nm Bảng kết cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa mẫu cao cồn cao nước nồng ñộ 2000 µg/ml cao tương ñương với chất ñối chiếu acid ascorbic khoảng nồng ñộ 0,51 mM Bảng Hoạt tính chống oxy hóa cao cồn cao nước nấm linh chi ñỏ thử nghiệm MDA HTCO HTCO Nồng ñộ Cao cồn Cao nước (µg/ml) (%) (%) 10 25,49 12,64 50 27,46 16,37 100 25,39 16,37 500 35,85 30,26 1000 44,87 22,49 1500 55,13 32,33 2000 58,34 41,66 Nhận xét bàn luận bảng kết 2: Trong thử nghiệm MDA, MDA chất ñược sinh trình peroxy hóa lipid màng tế bào, phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo phức hợp có màu hồng Hoạt tính chống oxy hóa hai mẫu thử cao cồn, cao nước thể qua việc làm giảm màu phức hợp làm giảm lượng MDA có mẫu dẫn ñến giảm ñộ hấp thu bước sóng 532 nm Bảng kết cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa mẫu cao cồn cao nước nồng ñộ 2000 µg/ml cao tương ñương với chất ñối chiếu trolox khoảng nồng ñộ 1-5 mM Tóm lại, dựa giá trị IC50 cao cồn cao nước linh chi ñỏ hai thử nghiệm DPPH MDA kết luận hoạt tính chống oxy hóa in vitro cao cồn mạnh cao nước (bảng 3) Bảng Giá trị IC50 cao cồn cao nước linh chi ñỏ IC50 (µg/ml) DPPH MDA Cao cồn Cao nước Cao cồn Cao nước 1326 1708 1368 2818 Kết nghiên cứu in vivo Bảng Kết khảo sát hàm lượng MDA gan lô uống cao cồn nấm linh chi ñỏ Nhóm Lô Liều Hàm lượng Hàm lượng n=10 (g/kg) MDA MDA (nmol/ml dịch (nmol/g ñồng thể) Protid) CY (-) 86,595 ± Chứng 3,172 ± 0,116 3,168 132 Cao cồn 0,332 3,019 ± 0,107 84,902 ± 2,908 161,962 ± CY Chứng 5,932 ± 0,324 8,854# (+) Cao 159,390 ± cồn 0,332 5,747 ± 0,371 10,139 # P < 0,001 so với lô chứng bình thường, không tiêm cyclophosphamide Bảng Kết khảo sát hàm lượng MDA gan lô uống cao nước nấm linh chi ñỏ Nhóm Lô Liều Hàmlượng Hàm lượng n=10 (g/kg) MDA MDA (nmol/ml (nmol/g dịch ñồng Protid) thể) 86,595 ± Chứng - 3,172 ± 0,116 3,168 CY (-) Cao 98,269 ± 0,300 nước 3,757 ± 0,269 6,243 161,962 ± Chứng - 5,932 ± 0,324 CY 8,854# (+) Cao 99,860 ± 0,300 nước 7,191* 3567 ± 0,263 # P < 0,001 so với lô chứng bình thường, không tiêm cyclophosphamide * P < 0,05 so với lô chứng tương ứng Nhận xét bàn luận bảng kết 5: Lô chứng tiêm cyclophosphamide uống nước cất ngày có hàm lượng MDA tăng ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ cyclophosphamide gây tổn thương peroxy hóa màng tế bào dẫn ñến việc làm tăng hàm lượng MDA gan Do gan, cyclophosphamide ñược biến ñổi sinh học trở thành 4-hydroxycyclophosphamide aldophosphamide có tính alkyl hóa, dẫn ñến hình thành tác nhân gây ñộc tế bào acrolein, chloroacetaldehyde [1] Ngoài ra, nghiên cứu trước ñây nhóm ñã chứng minh cyclophosphamide làm giảm hàm lượng glutathion, chất chống oxy hóa nội sinh thể, ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học ngày thứ sau tiêm cyclophosphamide [6] Điều cho thấy glutathion nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein N-acetylcystein) với chức giải ñộc ñã thông qua hệ thống cytocrom P-450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa cyclophosphamide thể Độc tính cyclophosphamide tăng kéo theo suy giảm glutathion nội sinh gan, ñó gián tiếp làm tăng trình peroxy hóa lipid màng tế bào dẫn ñến hàm lượng MDA tăng Lô bình thường không tiêm cyclophosphamide uống cao cồn cao nước nấm linh chi ñỏ ngày có hàm lượng MDA không thay ñổi ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao cồn cao nước tác dụng thể chuột bình thường Lô tiêm cyclophosphamide uống cao cồn nấm linh chi ñỏ liều 0,332 g/kg thể trọng chuột ngày không làm thay ñổi hàm lượng MDA ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy cao cồn chưa thể tác dụng ức chế gia tăng hàm lượng MDA gan gây cyclophosphamide Lô tiêm cyclophosphamide uống cao nước nấm linh chi ñỏ liều 0,300 g/kg thể trọng chuột ngày làm hàm lượng MDA giảm ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy cao nước thể tác dụng ức chế gia tăng hàm lượng MDA gan gây cyclophosphamide Những công trình nghiên cứu giới ñã chứng minh triterpenoid, polysaccharide nhóm hoạt chất ñịnh dược tính Linh chi, ñó có tác dụng chống oxy hóa Nấm linh chi có nhiều loại linh chi ñỏ, ñen, xanh, tím…nhưng ñó tốt Linh chi ñen ñỏ, ñặc biệt Linh chi ñỏ Lý hai loại Linh chi có chứa hàm lượng polysaccharide cao hẳn so với loại lại [5] Các polysaccharide Linh chi có tác dụng bảo vệ gan phục hồi tổn thương gan stress oxy hóa gây carbon tetraclorid, ethanol theo chế dập tắt gốc tự như: ức chế tăng sinh mức nitric oxide (NO) tạo peroxynitrit superoxid anion (O2.-), ức chế 133 tạo thành sản phẩm trình peroxy hóa lipid malonyl dialdehyd (MDA), ức chế giảm hoạt enzym superoxide dismutase [3] Các thành phần hoạt chất nấm Linh chi ñỏ ñược nuôi trồng Việt Nam ñã ñược phía Nhật Bản xác ñịnh (theo xác nhận nhà cung cấp-Trung tâm Nghiên cứu Linh chi Nấm Dược liệu) Điều ñược khẳng ñịnh qua kết tác dụng chống oxy hóa cao chiết nước thực nghiệm gây tăng MDA gan cyclophosphamide KẾT LUẬN Linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy hóa, thải trừ gốc tự do, ức chế trình peroxy hóa màng tế bào, làm giảm tăng hàm lượng MDA gan bị tổn thương oxy hóa cyclophosphamide TÀI LIỆU THAM KHẢO Abraham P, Sugumar E.,(2008), Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamide: a defense mechanism? Exp Toxicol Pathol., 59(5): pp 301-306 Amarowiez R., Pegg R.P., Rahimi-Moghaddam P., Barl B., Weil J.A.,(2004) Free radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies, Food Chemistry, pp 84, 551-562 Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L.,(2007) Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol Annu Rev., 265-301 Stroev E A., Makarova V G., (1998), Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory In: Manual in Biochemistry, Moscow, 243 -256 Lê Xuân Thám (2005), Nấm Linh Chi Ganodermataceaea Donk NXB Khoa học Kỹ thuật, Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008), Tác dụng Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm F Nees, Acanthaceae) thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch cyclophospamid”, Y học TP Hồ Chí Minh, tập 12, phụ số 4, tr 142-147 Viện Dược liệu – Bộ Y Tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ Dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội , tr 279-292 134 ... tâm Nghiên cứu Linh chi Nấm Dược liệu) Điều ñược khẳng ñịnh qua kết tác dụng chống oxy hóa cao chi t nước thực nghiệm gây tăng MDA gan cyclophosphamide KẾT LUẬN Linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy. .. khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan cao chi t cồn cao chi t nước linh chi ñỏ giống Nhật ñược nuôi trồng Việt Nam dựa mô hình thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan cyclophosphamide... có tác dụng chống oxy hóa có khả bảo vệ quan (não, tim, mạch máu, gan, thận) khỏi tác ñộng xấu stress oxy hóa, ñặc biệt người cao tuổi trình lão hóa Nhiều công trình nghiên cứu ñã chứng minh nấm