Báo cáo y học: "NGHIêN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CHẾ PHẨM PANTOGIN" pps

NGHIêN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CHẾ PHẨM PANTOGIN Phạm Thành Suôl* Phạm Hùng Lực* Nguyễn Văn Minh** Trịnh Văn Lẩu*** TĨM T¾t Pantogin bào chế từ sâm nhung, “loại thuốc bổ đầu tay” Thành phần có hoạt tính chủ yếu nhân sâm hỗn hợp > 30 triterpenoid saponin, gọi ginsenoside, chúng thể tác dụng sinh học đa dạng có tác dụng chống oxy hố Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên dựa tiêu: đo thiobarbituric acid reacted substances (TBA-RS), protein carbonyl mô gan chuột thực nghiệm gây độc cho gan carbon tetraclorid (CCl4) * Từ khoá: Pantogin; Tác dụng chống oxy hoá STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PANTOGIN Pham Thanh Suol Pham Hung Luc Nguyen Van Minh Trinh Van Lau SUMMARY As one of the most tonic traditional medications, combination of ginseng and cornu cervi were studied and developed into a modern product pantogin The main active ingredients of ginseng contains a mixture of over 30 triterpenoid saponins, commonly referred to as ginsenosides, which have manifested a variety of bio-activities, including antioxydant effects Methods to evaluate the antioxydant activity of products of natural origin are based on certain criteria such as measuring thiobarbituric acid reacted substances (TBA-RS) and protein carbonyl (PC) contents in hepatic tissues of mice whose liver injury has been induced by CCl4 * Key words: Pantogin; Antioxidant activity ĐẶT VẤN ĐỀ quan tâm để ứng Những năm gần đây, dụng người đặc tính chống oxy hóa loại thảo dược Pantogin bào chế kế thừa từ dược liệu quý thành y học Cổ sâm, nhung, “thuốc bổ truyền kinh nghiệm đầu tay” Sản phm ny * Tr-ờng Đại học Y D-ợc Cần Thơ ** Häc viƯn Qu©n y *** ViƯn KiĨm nghiƯm thc TW Phản biện khoa học: PGS TS Vũ Mạnh Hùng dân gian, đồng thời vận gây Từ thực tiễn dụng tiến trên, thực khoa học đề tài nhằm góp nghiên cứu, đại hố phần làm sáng tỏ chế dạng bào chế với mong tác dụng muốn giữ tác dụng thuốc có chứa nhân sâm, vốn có thuốc để có sở bảo tồn Thành phần có hoạt tính phát huy vốn quý chủ yếu nhân sâm y dược học Cổ hỗn hợp > 30 triterpenoid truyền Việt Nam, góp saponin thường gọi phần đáp ứng nhu cầu sử ginsenoside, chúng dụng thuốc nhân dân có tác dụng sinh học đa dạng, có tác dụng chống oxy hố, bảo vệ tế bào gan tránh khỏi tổn thương tác nhân ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU hoá chất, gốc tự 19 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Coomassie (Bradford), 2, - dinitrophenylhydrazin Đối tượng, nguyên (2,4-DNPH guanidinchlorid vật liệu nghiên cứu - Pantogin dựa thiobarbituric sâm, nhung hươu, sữa 0,5%) - Động vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng (đực) giống DDY, trọng lượng 22 ± g (5 - tuần tuổi), Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cung cấp - Ngun liệu, hố chất khảo sát tính chống oxy hố: 20 6M (pH6,5) (Merck), acid công thức gồm: nhân ong chúa 0,2%), (Merck), trichloroacetic (TBA acid (TCA 20%) (Unichem), carbon tetrachloride (Unichem), chuẩn chất Malonaldehyde bis (Sigma - Aldrich), chất chuẩn BSA (bovine serum albumin) (Sigma) Đo phổ hấp thu UV mẫu thử máy U- UV/VIS protein toàn phần 1900 Specphotomether 200 V mẫu thử nghiệm, thực (Hitachi), máy nghiền theo quy trình thử đồng thể Sonicator 3080 công bố (USA) * Xác định hàm lượng Phương nghiên cứu pháp TBA-RS: TBA-RS Đánh giá hoạt tính sản phẩm trung gian chống oxy hố dựa theo q trình peroxy hóa phương pháp xây dựng lipid màng tế bào, đường chuẩn MDA, cho phản ứng với acid protein toàn phần, định thiobarbituric, phân lượng thiobarbituric acid tử TBA-RS phản ứng với reacted substances (TBA- hai phân tử thiobarbituric RS) định lượng PC tạo phức màu hồng hấp (protein carbonyl) Tính thu cực đại bước sóng tốn kết theo lượng 532 nm Phản ứng 21 thực môi trường gian khác nhau: thử pH - 3, nhiệt độ 90 - nghiệm phòng ngừa 100oC vòng 60 ngày gây độc gan, 10 phút Đo cường độ màu ngày gây độc gan, 14 phức suy lượng ngày gây độc gan Tất TBA-RS có mẫu chuột giết, lấy gan Nếu lượng TBA-RS cho thử nghiệm mô học giảm so với mẫu chứng, hố sinh: lơ mẫu xác định có (chứng): nước cất, dầu hoạt tính chống oxy hóa ôliu; lô 2: nước cất, CCl4; Cách tiến hành: chia lô 3: thuốc thử, CCl4 chuột thành lô, lơ Cân lấy 50 mg gan (vì 10 uống nước cất tính tốn dựa vào lượng (0,1 ml/10 g), dầu ơliu protein tồn phần) (0,4 ml/kg, SC), CCl4 nghiền mô tạo dịch đồng (0,025 ml/kg, SC) Thử thể 5% máy nghiền nghiệm thuốc với thời đồng thể dung dịch 22 đệm phosphat buffer Tất giai đoạn từ saline (PBS, pH 7,4) Ly lấy mẫu, cân tâm (lượng protein nghiền mẫu được loại hết) lấy 200 µl tiến hành nhiệt độ dịch, thêm 500 µl nước 40C cất, 100 µl SDS 10% Ủ * Xác định hàm lượng hỗn hợp 37oC 30 protein carbonyl: phút Thêm 500 µl HCl Protein carbonyl 0,1 N, lắc kỹ 15 phút Ly sinh trình tâm, dùng micropipette oxy hóa protein, cho hút ml dịch, thêm vào phản ứng với 2,4250 µl TBA 0,5% Đun dinitrophenylhydrazin o cách thủy 95 C (DNPH) tạo tủa, hoà tan 60 phút Để nguội đến tủa guanidinchlorid nhiệt độ phịng Đo cho dung dịch có màu quang phổ bước sóng vàng, đo quang phổ 532 nm bước sóng 370 nm 23 * Cách tiến hành: giết chuột lấy gan (50 mg), nghiền mẫu mô tạo dịch đồng thể 6,7% máy nghiền đồng thể dung dịch đệm PBS pH 6,5 Ly tâm lấy dịch Tất giai đoạn từ lấy THÀNH (µl) 320 nhiệt độ - C 320 20 20 20 20 20 20 20 20 200 200 PHẦN 100 mM PBS (pH 7,2) 80 mM FeSO4.7H2O mẫu, cân nghiền mM mẫu tiến hành FeCl3.6H2O (µl) M KCl Bảng 1: Hỗn hợp phản 0,4 M ứng định lượng protein MgCl2.2H2O Mẫu thử carbonyl Sau phản ứng ỐNG ỐNG NỒNG Nước cất CHỨNG THỬ ĐỘ 24 120 120 (mM hematoxylin-eosin, thực Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP HCM kÕT QUẢ NGHIÊN CỨU * Kết xác định hàm lượng TBA-RS protein carbonyl: 0.6 0.9 y = 0.058x + 0.058 R = 0.9995 0.8 R = 0.9997 0.6 0.3 0.5 A A 0.4 y = 0.027x + 0.0118 0.7 0.5 0.4 0.2 0.3 0.1 0.2 0.1 10 0 10 15 20 25 30 mg/ml Biểu đồ 1: Phương trình đường chuẩn protein tồn phần 35 nmol/ml Biểu đồ 2: Phương trình đường chuẩn TBA-RS 27 Sau có kết đo độ hấp thu, thay vào đường chuẩn để tính tốn hàm lượng TBA-RS (nmol/ml), tương tự thay vào đường chuẩn để tính lượng protein tồn phần (mg/ml) Sau tính tốn lượng TBA-RS theo lượng protein toàn phần Nmol/ml = nmol/mg Mg/ml Bảng 3: Hàm lượng TBA-RS (nmol/mg protein) HÀM LƯỢNG TBA-RS (nmol/mg protein) 28 HTCO(*) (%) Lơ thử nghiệm dự phịng ngày gây độc gan Nước cất + dầu 2,0890 ± 0,2353 ôliu Nước cất + 3,4206 ± 0,3579 CCl4 (1) (2) 1,7279 ± 0,2897 Thuốc + CCl4 (3) 49,49 Lô thử nghiệm dự phòng 10 ngày gây độc gan Nước cất + dầu ôliu Nước cất CCl4 Thuốc + CCl4 + 1,9142 ± 0,2247 3,4341 ± 0,1396 1,647 ± 0,2141 52,04 Lơ thử nghiệm dự phịng 14 ngày gây độc gan 29 Nước cất + dầu ôliu Nước cất + CCl4 Thuốc + CCl4 2,3300 ± 0,1799 3,4740 ± 0,2410 1,3923 ± 0,1323 59,92 HTCO(*) (%): hoạt tính chống oxy hố tính theo TBA-RS 4.5 4.5 4 3.5 3.5 MDA (nmol/mg protein) 0.5 Dầu oliu 30 CCl4 CCl4 + thuốc TBA-RS 1.5 TBA-RS MDA (nmol/mg protein) 2.5 2.5 1.5 0.5 Dầu oliu CCl4 CCl4 + thuốc Biểu đồ 3: Kết Biểu đồ 4: Kết khảo khảo sát hàm lượng sát hàm lượng TBA-RS TBA-RS thử nghiệm thử nghiệm dự phòng dự phòng 10 ngày gây 14 ngày gây độc độc So sánh TBA-RS gan với HTCO(*) (%) tính với nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4 Nếu xem HTCO(*) (%) nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4 0% HTCO(*) (%) thử nghiệm thay đổi sau: - Sau ngày dùng thuốc dự phòng, thuốc thể HTCO(*) (%) 49,49% (p < 0,05) - Sau 10 ngày dùng thuốc dự phòng, HTCO(*) (%) tăng lên 52,04% (p < 0,01) 31 - Sau 14 ngày dùng thuốc dự phòng, thuốc thể HTCO(*) (%) cao (59,92%) (p < 0,001) Bảng 4: Kết xác định hàm lượng protein carbonyl HÀM LƯỢNG LƠ THỬ PC HTCO(*) (%) (µmol/mg protein) Lơ thử nghiệm dự phòng ngày gây độc gan Nước cất + dầu ôliu Nước cất + CCl4 Thuốc + CCl4 32 1,1798 ± 0,1252 1,5214 ± 0,1206 1,0637 ± 30,01 0,1097 Lơ thử nghiệm dự phịng 10 ngày gây độc gan Nước cất + dầu ôliu Nước cất + CCl4 Thuốc + CCl4 1,1627 ± 0,1083 1,49 ± 0,17 0,883 ± 0,0538 40,74 Lô thử nghiệm dự phòng 14 ngày gây độc gan Nước cất + dầu ôliu Nước cất + CCl4 Thuốc + CCl4 1,1571 ± 0,1079 1,5441 ± 0,0893 0,7155 ± 53,66 33 0,0459 1.8 1.6 1.6 PC(nmol/mg protein) PC (nmol/mg protein) 1.8 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Dầu oliu CCl4 CCl4 + thuốc Dầu oliu CCl4 CCl4 + thuốc Biểu đồ 5: Thay ®ổi hàm Biểu đồ 6: Thay ®ổi hàm lượng PC gan thử lượng PC gan thử nghiệm 10 ngày dự nghiệm 14 ngày dự phòng gây độc phòng gây độc So sánh protein carbonyl gan với HTCO(*) (%) với nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4 Nếu xem HTCO(*) (%) nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4 34 0% HTCO(*) (%) lơ thử nghiƯm thay đổi sau: - Sau ngày dùng thuốc dự phòng, thuốc thể HTCO(*) (%) 30,01% (p < 0,05) - Sau 10 ngày dùng thuốc dự phòng, HTCO(*) (%) tăng lên 40,74% (p < 0,01) - Sau 14 ngày dùng thuốc dự phòng, thuốc thể HTCO(*) (%) cao (53,66%) (p < 0,001) Kết khảo sát vai trò bảo vệ tế bào gan viên nang pantogin thử nghiệm 14 ngày dự phòng gây độc (n = 6) lơ: 35 Nhóm chứng tiêm dầu ơliu CCl4/dầu ơliu Nhóm tiêm CCl4/ơliu + thuốc Tế bào gan bình thường thương Nhóm tiêm Tế bào gan bị tổn Tế bào gan bình thường Hình 1: Vai trị viên nang pantogin tổn thương 36 tế bào gan gây CCl4 qua nhuộm HE 37 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 8-2009 - Du ụliu (liều 0,025 ml/kg) không làm thay đổi cấu trúc tế bào gan - Sau 24 gây độc gan CCl4 (liều 0,025 ml/kg) thấy tế bào gan thối hóa - Với nhóm chuột có dùng thuốc ngày, 10 ngày, 14 ngày, thuốc thể khả bảo vệ tế bào gan, tế bào gan bình thường khơng bị tổn thương BÀN LUẬN * Kết chống oxy hóa: Thông qua tiêu hàm lượng TBA-RS protein carbonyl với mơ hình gây viêm gan cấp CCl4 chuột thực nghiệm, kết cho thấy chế phẩm pantogin có khả chống oxy hóa sau ngày dùng thuốc, thời gian dùng thuốc lâu, tác dụng chống oxy hóa rõ (thử nghiệm 10 ngày, 14 ngày) Do thuốc có nguồn gốc từ thảo dược nên cần thời gian đủ dài để thuốc đạt tác dụng bảo vệ tế bào gan Mặt khác, để có tác dụng chống oxy hóa, ginsenoside nhân sâm protein sữa ong chúa phải c chuyn húa to 38 Tạp chí y - d-ợc häc qu©n sù sè 8-2009 chất có tác dụng chống oxy hoá, cải thiện tổn thương tế bào gan CCl4 tạo HTCO(*) (%) tính toán dựa khả làm giảm gia tăng hàm lượng TBA-RS protein carbonyl gan CCl4 gây độc cho gan * Kết mô học: Kết khảo sát khả chống oxy hóa viên nang pantogin dựa tiêu hàm lượng TBA-RS protein carbonyl hoàn toàn phù hợp với kết rút từ khảo sát tổn thương tế bào gan phương pháp nhuộm HE Khả bảo vệ tế bào gan chế phẩm thể hiệu cao việc chống lại q trình oxy hóa gây độc tế bào gan KÕT LUẬN Chế phẩm viên nang pantogin thể vai trò bảo vệ tế bào gan chống lại tác nhân oxy hoá sinh từ carbon tetraclorid, tác nhân gây độc tế bào gan Kết mô học cho thấy khả bảo vệ tế bào gan cao, tế bào gan bình thường, khơng bị tổn thương carbon 39 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 8-2009 tetraclorid (liu 0,025 ml/kg) Kết hoàn toàn phù hợp với khảo sát khả làm giảm hàm lượng TBA-RS protein carbonyl, hai sản phẩm sinh trình oxy hóa tế bào Pantogin phối hợp ba dược liệu: nhân sâm, nhung hươu, sữa ong chúa, có khả chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan chống lại tác nhân gây độc hại carbon tetraclorid Pantogin sản phẩm kế thừa phát huy kinh nghiệm dân gian dạng bào chế đại với mong muốn vừa giữ tác dụng vốn có thuốc, vừa đáp ứng yêu cầu chất lượng dạng bào chế hin i TàI LIU THAM KHảO Trn Phi Hong, Võ Phùng Nguyên Khảo sát tác dụng chống oxy hoá in-vivo số dẫn chất flavon bán tổng hợp từ rutin Y học TP Hồ Chí Minh 2009, 13, tr.157-163 40 Tạp chí y - d-ợc học quân sè 8-2009 Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E Methods for testing antioxidant activity Analyst 2002, pp.183-198 Byung Hoon Han, Myung Hwan Park, Yong Nam Han Studies on the antioxidant components of Korean ginseng The mechanism of antioxidant activity of maltol and phenolic acid Korean Biochem 1985, 18 (4), pp.337-340 David D Kitts, Arosha N Wijewickreme, Chun Hu Antioxidant properties of a North American ginseng extract University of British Columbia 2000 Hang Guo, Yoshiaki Kouzuma, Masami Yonekura Isolation and properties of antioxidative peptides from water-soluble Royal jelly protein hydrolysate Food sci Technol Res 2005, pp.222-230 Michael Antolovich, Paul D Prenzler, Emilios Patsalides, Suzanne McDonald, Kevin Robards Method for testing antioxidant activity Analyst 2002, pp.183198 41 ... chuột thực nghiệm, kết cho th? ?y chế phẩm pantogin có khả chống oxy hóa sau ng? ?y dùng thuốc, thời gian dùng thuốc lâu, tác dụng chống oxy hóa rõ (thử nghiệm 10 ng? ?y, 14 ng? ?y) Do thuốc có nguồn gốc... tác dụng bảo vệ tế bào gan Mặt khác, để có tác dụng chống oxy hóa, ginsenoside nhân sâm protein sữa ong chúa phải chuyển hóa to 38 Tạp chí y - d-ợc học quân sè 8-2009 chất có tác dụng chống oxy. .. cao việc chống lại q trình oxy hóa g? ?y độc tế bào gan KÕT LUẬN Chế phẩm viên nang pantogin thể vai trò bảo vệ tế bào gan chống lại tác nhân oxy hoá sinh từ carbon tetraclorid, tác nhân g? ?y độc tế