Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hạt cam thảo dây Quế Sơn - Quảng Nam

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHẠM THỊ CẨM LAI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT HẠT CAM THẢO DÂY QUẾ SƠN-QUẢNG NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số : 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng – Năm 2013 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN MẠNH LỤC Phản biện 1: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Phản biện 2: PGS.TS Lê Tự Hải Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 31 tháng năm 2013 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam n m v ng nhiệt đới c thảm thực vật phong ph , nhiều loài thuộc chi Abrus thuộc họ Fabaceae d ng đ bào ch thuốc ch a nhiều bệnh M c d nh ng loài thuộc c c chi k c nhiều gi trị sử dụng c c công trình nghiên c u thành ph n ho học, hoạt t nh c a c c thuộc chi n i chưa hoàn toàn đ y đ c t nh hệ thống Việc nghiên c u chi t t ch, c định thành ph n h a học, ng dụng c c phương ph p đại đ c định cấu tr c nghiên c u hoạt t nh sinh học c a số hợp chất c c loài thuộc c c chi Việt Nam hướng nghiên c u c nhiều tri n vọng, c nghĩa khoa học thực ti n cao Cây cam thảo dây c tên khoa học Abrus precatorius L thuộc họ Đậu (Fabaceae) Cam thảo dây nh ng vị thuốc Ðông y lâu đời nhất; s ch "Th n nông thảo" th kỷ th trước công nguyên n i đ n cam thảo Nhìn chung c c s ch thảo (s ch n i dược) Ðông y cho r ng Cam thảo vị t nh bình, c t c dụng bổ trung ch kh , giải co thắt giảm đau, nhuận ph giảm kh t, nhiệt giải độc, giải độc thuốc th c ăn, điều hòa t nh vị c a c c vị thuốc kh c Vì vậy, ch ng chọn đề tài: “Nghiên cứu t n p n cdc c t ạt c m t ảo dây Qu Sơn- Quảng N m” làm luận văn Thạc sĩ Mục đích nghiên cứu - Tìm c c điều kiện chi t t ch th ch hợp c c chất t hạt cam thảo dây b ng c c dung môi kh c Footer Page of 126 Header Page of 126 - X c định thành ph n h a học c c chất t dịch chi t hạt cam thảo dây - Thăm dò hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước c a hạt cam thảo dây Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Hạt cam thảo dây Qu Sơn-Quảng Nam 3.2 Phạm vi nghiên cứu Thành ph n hóa học c a số dịch chi t hạt cam thảo dây Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết + Thu thập, tổng hợp, phân t ch c c tài liệu, tư liệu nguồn nguyên liệu, thành ph n h a học ng dụng c a hạt cam thảo dây + Tổng hợp tài liệu phương ph p lấy mẫu, chi t t ch c đinh thành ph n h a học c c chất t thực vật 4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm + X c định độ m b ng phương ph p trọng lượng + X c định hàm lượng kim loại b ng phương ph p quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) + Chi t t ch c c chất b ng c c dung môi kh c theo phương ph p ngấm kiệt + K t hợp gi a thực nghiệm ho học với việc sử dụng c c thi t bị đại c c phương ph p HPLC, GC-MS LC-MS đ định danh c c chất dịch chi t + Thử nghiệm hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước Footer Page of 126 Header Page of 126 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Nh ng k t nghiên c u công trình g p ph n cung cấp c c thông tin c nghĩa khoa học thành ph n c c hoạt t nh sinh học chi t t ch t loài Abrus precatorius qua đ g p ph n nâng cao gi trị ng dụng c a ch ng ngành dược liệu Bố cục luận văn Luận văn bao gồm trang, 14 bảng, 10 hình, 52 tài liệu tham khảo phụ lục Cấu tr c luận văn sau: Mở đ u (3 trang) Chương Tổng quan (20 trang) Chương Nguyên liệu phương ph p nghiên c u (12 trang) Chương K t thảo luận (21 trang) K t luận ki n nghị (3 trang) Tài liệu tham khảo (5 trang) CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT 1.1.1 Đặc điểm chung chi Abrus 1.1.2 Giới thiệu cam thảo dây a Tên g b P ân loạ k o c c P ân bố d Đặc đ ểm t ực vật 1.2 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY CAM THẢO DÂY 1.2.1 Dùng làm thuốc chữa bệnh Footer Page of 126 Header Page of 126 1.2.2 Dùng làm trang sức 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY CAM THẢO DÂY 1.4 TÁC DỤNG DƢỢC LÍ CỦA HẠT CAM THẢO DÂY 1.4.1 Tính chất abrin 1.4.2 Cơ chế hoạt động abrin CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên c u hạt cam thảo dây thu hái vào tháng 4/2012 huyện Qu Sơn, tỉnh Quảng Nam (Hình 2.1), c định tên khoa học thuộc loài Abrus precatorius L Hình 2.1 Cây cam thảo dây 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp xác định thông số hóa lý a P ương p áp tr ng lượng b P ương p áp vật lý Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2.2 Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích định danh thành phần hóa học dịch chiết 2.2.4 Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 2.3 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.3.1 Sơ đồ thực nghiệm Thu nguyên liệu X c định độ m, hàm lượng h u n-hexane X c định hàm lượng kim loại Xử l thành dạng bột Chlorofo m Etylaxeta t methanol Nước n Khảo s t điều kiện tối ưu: thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng Định danh b ng c c phương ph p GC-MS, LCMS, HPLC Hình 2.2 Sơ đồ thực nghiệm 2.3.2 Xử lí nguyên liệu Nguyên liệu hạt cam thảo dây thu hái vào tháng 4/2012 huyện Qu Sơn, tỉnh Quảng Nam Chọn h i nh ng chín, già Footer Page of 126 Header Page of 126 Sau đ b c đ thu lấy hạt Hạt hình tr ng, nhẵn b ng, to b ng hạt đậu gạo, màu đỏ ch i, c đốm đen rộng bao quanh t , độc, dài khoảng 0,5 cm Hạt cam thảo sau h i, loại bỏ nh ng hạt bị hư, sâu, rửa đ khô tự nhiên Lấy ph n khảo s t độ m, ph n lại đem phơi khô đem ay nhỏ, bảo quản bình k n Hình 2.3 Nguyên liệu hạt cam thảo dây tươi bột khô 2.3.3 Xác định thông số hóa lí nguyên liệu a Xác đ n độ ẩm b Xác đ n m lượng tro c Xác đ n m lượng số k m loạ nặng 2.3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình tách chất a K ảo sát ản ưởng củ loạ dung mô b K ảo sát t g n c K ảo sát ản ưởng củ tỉ lệ R/L 2.3.5 Chiết tách xác định thành phần hóa học dịch chiết hạt cam thảo dây * Trong dung môi h u thông thường: Cho 20g nguyên liệu bột khô ngâm chi t bốn dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate methanol ba l n với Footer Page of 126 Header Page of 126 l n 200 ml dung môi nhiệt độ phòng thời gian ngày, thu lấy dịch chi t Lấy dịch chi t khoảng ml đ đem phân t ch GC – MS c định thành ph n hàm lượng c c cấu tử c dịch chi t Hệ thống GC-MS với cột t ch mao quản DB-5MS, khí mang He 10psi, th t ch tiêm mẫu 1μl (split 10:1), ghép máy MS EI+ kèm ngân hàng d liệu theo chương trình gradient nhiệt độ: t 500C đ n 3000C (5 phút); injector 2500C detector 500, ch độ quét Fullscan * Qu trình chi t abrin b ng nước: Bột hạt cam thảo dây cho vào cốc, cho nước đ n th t ch gấp đôi ph n bột, đun sôi nh , khuấy đ n th t ch ph n nước ph a ấp ỉ ph n bột nhão ng ng đun Đ nguội, gạn lấy dung dịch vào cốc Sau đ ti p tục cho vào lượng nước cất c th t ch gấp đôi lượng dung dịch v a gạn đun ti p cho đ n th t ch ph n dung dịch t ch ph a ấp ỉ ph n bột nhão ng ng đun Đ nguội gạn lấy dung dịch cho vào cốc Ti p tục làm l n n a đem lọc lấy ph n dung dịch b ng ph u lọc p suất thấp (k ph n lọc gạn ban đ u) Gộp chung tất c c dung dịch v a lọc đem cô cạn bớt Đ nguội, lọc lại cho vào ethanol khan, đ yên cho k t t a uất Lọc lấy k t t a, rửa b ng cồn Tinh ch b ng c ch hòa tan k t t a nước n ng, k t t a lại b ng cồn, lọc lấy k t t a đem thử hoạt t nh gây độc t bào CHƢƠNG Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 3.1.1 Độ ẩm Độ m trung bình c a hạt cam thảo dây 13.85 % Độ m trung bình c a nguyên liệu bột 9.36 % Qua k t ta thấy độ m trung bình c a hạt cam thảo dây c a nguyên liệu bột chênh lệch không nhiều Hạt cam thảo dây loài hạt khô nên độ m c a hạt tương đối thấp Với độ m này, ch ng bảo quản nguyên liệu thời gian dài không bị mốc, nguyên liệu c độ ổn định tốt 3.1.2 Hàm lƣợng tro Hàm lượng tro trung bình hạt cam thảo dây 0.883% Điều dự b o hàm lượng kim loại c hạt cam thảo dây 3.1.3 Hàm lƣợng kim loại Bảng 3.4 Hàm lượng kim loại hạt cam thảo dây K t Phương ph p thử loại (AAS) Pb TCVN 6193:1996 0.0094 0.094 2 Cu TCVN 6193:1996 0.2755 2.755 30 Zn TCVN 6193:1996 1.079 10.79 40 As TCVN 6826:2000 0.0018 0.018 TT (mg/l) K t Hàm lượng Kim (mg/kg) cho phép (mg/kg) [1]  Nhận xét: Thành ph n kim loại n ng c hạt cam thảo dây thấp Đây nh ng số quan trọng đ đ nh gi việc sử dụng hạt Footer Page 10 of 126 Header Page 12 of 126 10 phân cực Vì vậy, ch ng sử dụng loại dung môi ti n hành t ch chất b ng phương ph p chi t ngâm d m 3.2.2 Kết khảo sát thời gian, tỉ lệ R/L trình chiết tách thành phần hóa học dịch chiết a Trong dung môi n-hexane * K t k ảo sát t g n, tỉ lệ R/L trìn c t tách: Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian ngâm chiết thể tích n-hexane đến khối lượng cao chiết Thời gian Th t ch 100 n-hexane (ml) 125 150 175 200 chi t (ngày) Khối lượng cao chi t (gam) 0.139 0.148 0.168 0.169 0.175 0.148 0.159 0.165 0.173 0.183 0.149 0.164 0.186 0.187 0.188 0.149 0.168 0.183 0.188 0.189 10  N ận xét: Qua bảng 3.6 hình 3.2 ta thấy, thời gian chi t t ngày đ n 10 ngày th t ch dung môi t 100 ml đ n 200 ml khối lượng cao chi t tăng lên đạt khối lượng cao thời gian chi t ngày với tỉ lệ R/L 10/150 0.186g Vậy thời gian chi t tối ưu ngày tỉ lệ R/L th ch hợp 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150ml dung môi n-hexane *T n p n c d c c t n-hexane: Bảng 3.7 Thành phần hóa học dịch chiết n-hexane ST RT T Area Name Formula % 3.64 0.74 Footer Page 12 of 126 p-xylene C8H10 Header Page 13 of 126 11 3.76 2.22 m-xylene C8H10 4.06 1.57 Styrene C8H8 5.27 4.91 2,2,4,6,6-pentamethylheptane C12H26 5.41 0.92 n-decane C10H22 5.85 0.59 2,2,4,4-tetramethyloctane C12H26 6.9 1.29 n-undecane C11H24 8.38 0.81 n-dodecane C12H26 11.14 0.85 n-tetradecane C14H30 10 15.84 26.82 Chưa c định 11 16.12 16.02 Chưa c định 12 16.83 21.23 n-heptacosane 13 17.83 10.46 Palmitic acid, ethyl ester 14 20.34 6.79 Phenanthrene, 7-isopropyl-1- C27H56 C18H36O2 C18H18 methyl 15 21.40 6.78 Adipic acid, bis(2-ethylhexyl) C22H42O4 ester  Nhận xét: T k t bảng 3.7 cho thấy phương ph p GC-MS định danh 15 cấu tử dịch chi t n-he ane t hạt cam thảo dây Thành ph n h a học dịch chi t n-he ane ch y u nh ng cấu tử c độ phân cực y u đ n không phân cực, bao gồm c c hidrocacbon mạch dài 10C ÷ 27C hidrocacbon thơm C c cấu tử c hàm lượng cao > 5% n-heptacosane (21.23%), palmitic acid, ethyl ester (10.46%), phenenthrene, 7-isopropyl-1methyl (6.79%), adipic acid, bis(2-ethylhe yl) ester (6.78%) C c cấu tử lại c hàm lượng thấp < 5%, bao gồm hidrocacbon no hidrocacbon thơm Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 12 Trong dịch chi t n-hexane, palmitic acid ethyl ester monoesters béo, chất độc độc t nh thấp Retene (7-isopropyl1-methyl phenanthrene) hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) gây độc t nh như dio in, tăng tỷ lệ tử vong, khuy t tật Adipic acid,bis(2ethylhexyl)ester (DEHA) gây u n ung thư bi u mô gan chuột, không cho chất gây ung thư cho người theo quan ung thư quốc t b Trong dung môi ethyl acetate * K t k ảo sát t g n, tỉ lệ R/L trìn c t tách: Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian ngâm chiết thể tích EtOAc đến khối lượng cao chiết Th t ch EtOAc (ml) Khối lượng cao chi t (gam) Thời gian 100 125 150 175 200 chi t (ngày) 0.323 0.374 0.435 0.464 0.496 0.395 0.456 0.497 0.508 0.523 0.401 0.447 0.534 0.549 0.574 0.435 0.516 0.605 0.613 0.621 10  N ận xét: Qua bảng 3.8 hình 3.4 ta thấy, th t ch dung môi tăng thời gian khảo s t tăng khối lượng cao chi t tăng d n Ở tỉ lệ 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi ethyl acetate thời gian 10 ngày, khối lượng cao chi t thu 0.605g cao khối lượng cao chi t tỉ lệ 10g mẫu/ 125ml 0.516g nhỏ so với khối lượng cắn tỉ lệ 10g mẫu/ 175ml 0.613g không đ ng k , đồng thời cao hẳn so với chi t c ng tỉ lệ R/L thời gian ngày 0.534g Vậy tỉ lệ R/L Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 13 th ch hợp đ chi t hạt cam thảo dây 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi ethyl acetate thời gian 10 ngày * Thàn p n c d c c t ethyl acetate: Bảng 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate ST RT T Area Name Formula C12H26 % 5.27 1.37 2,2,4,6,6- pentamethylheptane 6.98 1.72 Acetin, monoacetate C5H10O4 7.32 2.03 Maltol C6H6O3 9.07 1.78 Acetin, diacetate C7H12O5 14.56 5.13 3-o-methyl-d-glucose C7H14O6 15.9 1.41 4-o-methylmannose C7H14O6 16.22 1.40 2-o-methyl-d-mannopyranosa C7H14O6 17.54 0.34 Hexadecanoic acid C16H32O2 17.82 0.84 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2 10 17.92 0.17 2-[1-(4-cyano-1,2,3,4- C14H14N2 tetrahydronaphthyl)]propanen itrile 11 17.99 0.40 3-[1-(4-cyano-1,2,3,4- C14H14N2 tetrahydronaphthyl)]propanen itrile 12 18.88 0.51 Oleic acid, methyl ester C19H36O2 13 19.29 1.05 Methyl 4- C19H38O3 hydroxyoctadecanoate 14 19.46 2.16 Ethyl oleate 15 20.87 3.01 Decanamide, N-(2hydroxyethyl)- Footer Page 15 of 126 C20H38O2 C12H25NO2 Header Page 16 of 126 14 16 21.37 17.90 Hexanedioic acid, bis(2- C22H42O4 ethylhexyl) ester 17 23.85 3.95 Olein, 1-mono- C21H40O4 18 24.57 2.14 Squalene 19 26.58 5.70 γ-Tocopherol C28H48O2 20 28.78 5.01 Campesterol C28H48O 21 29.09 32.13 Stigmasterol C29H48O 22 29.94 9.86 β-Sitosterol C29H50O C30H50  Nhận xét: T k t bảng 3.9 cho thấy phương ph p GC-MS định danh 22 cấu tử dịch chi t ethyl acetate t hạt cam thảo dây Thành ph n h a học dịch chi t ch y u nh ng cấu tử c độ phân cực trung bình y u c c acid h u tồn ch y u dạng tự este, c cấu tr c tương tự nên c c cấu tử d dàng phân bố vào pha dung môi ethyl acetate, có dẫn uất phenol C c cấu tử c hàm lượng cao hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (17.90%), γ-tocopherol (5.70%), campesterol (5.01%), stigmasterol (32.13%) b-sitosterol (9.86%) Trong dịch chi t ethyl acetate, phytosterol c hàm lượng cao Nhiều nghiên c u r ng c c hợp chất phytosterol c ch việc c ch ung thư phổi, dày, buồng tr ng ung thư v C c nghiên c u r ng phytosterol c th c ch hấp thụ cholesterol, làm giảm nồng độ cholesterol máu giảm nguy bệnh tim mạch Stigmasterol h u ch việc ngăn ng a số bệnh ung thư, bao gồm buồng tr ng, n tiền liệt, vú ung thư ruột k t Stigmasterol ch ng minh r ng c th Footer Page 16 of 126 c ch suy Header Page 17 of 126 15 thoái viêm ương khớp thoái hóa sụn chất chống o y hóa mạnh Cũng stigmasterol, β-sitosterol sử dụng cho người c bệnh tim cholesterol cao β-sitosterol d ng đ th c đ y hệ thống mi n dịch ngăn ng a ung thư ruột k t, sỏi mật, phổ bi n cảm lạnh c m, HIV / AIDS, viêm khớp dạng thấp, bệnh lao, bệnh v y n n, dị ng, ung thư cổ tử cung, đau cơ, hen suy n, rụng t c, viêm ph quản, ch ng đau nửa đ u đau đ u, hội ch ng mệt mỏi mãn t nh Campesterol loại phytosterol, c t c dụng c ch hấp thu cholesterol ruột, chống viêm Dịch chi t c ch a c c hợp chất đ ng quan tâm γ-tocopherol squalene Γ-tocopherol dạng c a vitamin E, c khả chống o y ho cao đ ngăn ng a c c bệnh liên quan đ n gốc tự ung thư, bệnh tim mạch Squalene triterpen, chất chống o y h a, ngăn ng a nh ng t c hại c a pero y lipid, ngăn ch n tổn thương o y h a t tia tử ngoại t c nhân chống ung thư c Trong dung môi chloroform * K t k ảo sát t g n, tỉ lệ R/L trìn c tách: Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian ngâm chiết thể tích chloroform đến khối lượng cao chiết Th t ch chloroform Thời gian 100 125 150 175 200 (ml) Khối lượng chi t (ngày) 0.329 Footer Page 17 of 126 0.399 0.418 0.426 0.439 t Header Page 18 of 126 16 cao chi t (gam) 0.335 0.397 0.443 0.437 0.448 0.376 0.445 0.484 0.488 0.491 0.381 0.449 0.486 0.492 0.492 10  N ận xét: T bảng 3.10 hình 3.6 ta thấy tăng d n th t ch dung môi thời gian chi t, khối lượng cao chi t thu tăng d n Khối lượng cao chi t chi t thời gian 8, 10 ngày cao đ ng k so với thời gian 4, ngày; đồng thời c c tỉ lệ R/L tăng lên Ở tỉ lệ 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi chloroform thời gian ngày, khối lượng cao chi t thu 0.484g nhỏ so với khối lượng cao chi t tỉ lệ 10g mẫu/ 175ml 0.488g cao khối lượng cao chi t tỉ lệ 10g mẫu/ 125ml 0.376g, đồng thời nhỏ c ng tỉ lệ thời gian 10 ngày không đ ng k Vậy tỉ lệ R/L th ch hợp 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi chloroform thời gian ngày *T n p n c d c c t chloroform: Bảng 3.11 Thành phần hóa học dịch chiết chloroform ST RT T Area Name Formula % 3.14 2.79 Ethylidene acetone C5H8O 4.42 0.40 Butyrolactone C4H6O2 5.27 0.79 2,2,4,6,6-pentamethylheptane C12H26 7.32 4.70 Maltol C6H6O3 9.40 0.95 2-butyl-1-octanol C12H26O 12.38 0.40 4,6-dimethyl2(1H)pyridone,3(phenylmethylenamino) Footer Page 18 of 126 C14H14N2O Header Page 19 of 126 17 14.5 1.45 Tricyclopentadeca-3,7- C15H22 dien[8.4.0.1(11,14)] 15.84 0.56 Fornamide,N-{4-[2-(1,1,- C12H21NO4 dimethylethyl)-5-oxo-1,3dioxolan-4-yl]butyl} 17.81 1.06 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2 10 17.99 0.41 4-(1-cyanoethyl)-1,2,3,4- C14H14N2 tetrahydro-1naphthalenecarbonitrile 11 18.87 0.67 Methyl (10E)-10- C19H36O2 octadecenoete 12 19.47 1.61 Ethyl oleate C20H38O2 13 20.87 0.77 Hexadecanedioic acid C16H30O4 14 21.37 30.66 Adipic acid, bis(2- C22H42O4 ethylhexyl) ester 15 28.55 25.53 3-β-myristoylolean-12-en-16- C44H76O3 β-ol 16 29.09 19.63 Stigmasterol C29H48O 17 29.93 7.65 β-sitosterol C29H50O  Nhận xét: T k t bảng 3.11 cho thấy phương ph p GC-MS định danh 17 cấu tử dịch chi t chloroform t hạt cam thảo dây C c chất h u chi m hàm lượng cao c c phytosterol ester như: stigmasterol (19.63%), β-sitosterol (7.65%), adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (30.66%) 3-β-myristoylolean-12-en16-β-ol (25.53%) Hàm lượng c c phytosterol acid dịch chi t chloroform thấp so s nh với dịch chi t etyl acetat; Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 18 dipic acid, bis(2-ethylhe yl) ester lại c hàm lượng cao dịch chi t n-he ane Ngoài ra, dịch chi t chloroform ch a c c thành ph n kh c lacton, ether, ancol ester c a a it béo Ethyl oleate este c a a it béo hình thành ngưng tụ c a axit oleic ethanol sử dụng nhiều ng dụng c c ch ph m dược, thực ph m, mỹ ph m ng dụng s c khỏe sắc đ p, dung môi tốt kem dưỡng m tuyệt vời phù hợp cho việc chăm s c da, chăm s c t c mỹ ph m màu Butyrolactone nh ng chất thường sử dụng thuốc k ch th ch, sử dụng làm thuốc, đ cải thiện hiệu th thao, giấc ng , hoạt động tình dục niềm vui d Trong dung môi methanol * K t k ảo sát t g n, tỉ lệ R/L trìn c t tách: Bảng 3.12 Ảnh hưởng thời gian ngâm chiết thể tích MeOH đến khối lượng cao chiết Th t ch MeOH (ml) Khối lượng cao chi t (gam) Thời gian 100 125 150 175 200 0.652 0.786 0.923 0.953 1.015 0.781 0.993 1.045 1.087 1.155 0.963 1.089 1.098 1.214 1.233 1.022 1.121 1.129 1.232 1.265 10 chi t (ngày)  N ận xét: Qua bảng 3.6 hình 3.2 ta thấy, khối lượng cao chi t tăng lên theo thời gian chi t t ngày đ n 10 ngày th t ch dung môi t 100 ml đ n 200 ml đạt khối lượng cao thời gian chi t ngày với tỉ lệ R/L 10/175 1.214g; thời gian chi t 10 ngày khối lượng cao chi t tăng không đ ng k C th giải Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 19 th ch tăng thời gian chi t c c chất hạt cam thảo dây không hòa tan thêm Vậy thời gian chi t tối ưu ngày tỉ lệ R/L th ch hợp 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 175 ml dung môi methanol với khối lượng cao chi t thu 1.214g *T n p n c d c c t methanol: Bảng 3.13 Thành phần hóa học dịch chiết methanol ST RT T Area Name Formula % 5.06 0.06 Methyl 3,3- C6H12O4 dimethoxypropionate 5.31 0.28 2,4-dihydroxy-2,5-dimethyl- C6H8O4 3(2H)-furan-2-one 6.34 0.35 Acetaldehyde, phenyl- C8H8O 7.33 0.50 Maltol C6H6O3 7.81 0.90 4H-pyran-4-one,2,3-dihydro- C6H8O4 3,5-dihydroxy-6-methyl6 7.96 0.11 Benzoic acid C7H6O2 9.75 0.96 2,4-dihydroxy-2,5-dimethyl- C6H8O4 3(2H)-furan-3-one 10.08 0.10 Indole C8H7N 11.02 21.23 1,2,3-benzenetriol C6H6O3 10 13.62 0.99 3-methylquinoline C10H9N 11 15.23 28.50 3-o-methyl-d-glucose C7H14O6 12 17.04 38.13 Gallic acid, methyl ester C8H8O5 13 17.54 1.09 N-hexadecanoic acid C16H32O2 14 17.9 0.25 N-vinylthio-naphthalene-l- C12H11NS amine Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 20 15 18.35 0.19 10,10- C16H20N2 spirocyclohexanotetrahydrop yrimido[1,2-a]indole 16 18.46 0.13 Indole-3-lactic acid, methyl C12H13NO3 ester 17 18.88 0.33 Tran-13-octadecenoic acid, C19H36O2 methyl ester 18 19.26 0.98 Cis-13-octadecenoic acid C18H34O2 19 19.99 1.90  -carboline, 1,2-dimethyl- C13H12N2 20 20.02 3-(N,N- C14H14N2 dimethylamino)carbazole 21 23.71 0.38 4-methoxy-l-cacboxaldehyde C13H13N3OS naphthaldehyde thiosemicarbazone 22 24.8 0.39 Ellipticine 23 25.2 1.75 3-allyl-5-(1H-indol-3- C17H14N2 C15H15N3OS ylmethyl)-2-thioxoimidazolidin-4-one 24 29.13 0.52 Phenol,4-(phenylamino) C12H11NO  Nhận xét: T k t bảng 3.12 cho thấy phương ph p GC-MS định danh 24 cấu tử dịch chi t methanol t hạt cam thảo dây Thành ph n h a học dịch chi t ch y u nh ng cấu tử c độ phân cực lớn như: 1,2,3-benzenetriol (21.23%), 3-o-methyl-dglucose (28.50%), Gallic acid, methyl ester (38.13%) 1,2,3benzenetriol a it độc hại, sử dụng sản uất chất màu thuốc nhuộm azo ph t tri n nhi p ảnh Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 21 kh ng sinh đ điều trị c c bệnh da Gallic acid, methyl ester có hoạt động chống o i h a Ngoài ra, dịch chi t methanol ch a c c thành ph n kh c ancaloid, phenol, flavonoid, axit ester c hàm lượng thấp 0.11÷1.90% c nhiều t c dụng đời sống Chẳng hạn 4H-Pyran-4-một, 2,3-dihydro- 3,5-dihydroxy-6-methyl- c hoạt t nh kh ng khu n, kh ng viêm; Cis-13-octadecenoic acid sử dụng t dược dược ph m; ellipticine t c nhân chống ung thư mạnh; benzoic acid c ch ph t tri n c a nấm mốc, nấm men số vi khu n, sử dụng đ điều trị c c bệnh nấm da nấm da, nấm da, benzoic acid sử dụng đ giảm đau, chất khử tr ng đ u th kỷ 20  Nhận xét chung B ng phương ph p GC-MS, số thành ph n h a học c c dịch chi t t hạt cam thảo dây c định Trong đ dịch chi t methanol định danh nhiều cấu tử với 24 cấu tử Trong dịch chi t ethyl acetate chloroform c chung nh ng cấu tử steroid với hàm lượng cao là: stigmasterol β-sitosterol; dịch chi t methanol ethyl acetate c chung cấu tử lacton glucosid maltol 3-o-methyl-d-glucose; dịch chi t n-hexane chloroform c chung cấu tử adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester Tổng k t c định 71 cấu tử kh c c hạt cam thảo dây b ng phương ph p GC-MS bao gồm ankan 10C÷27C, acid h u cơ, ester, dẫn uất phenol, terpene, ancol, ketone amine dị vòng Trong đ , sterol ester c a c c acid h u chi m hàm lượng cao Đồng thời t hình 3.6 dịch chi t b ng n-he ane cho thấy c c pic không cân đối, chân pic c a không rõ ch ng tỏ c c pic c Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 22 tượng chồng pic, hình 3.7, 3.8 hình 3.9 dịch chi t b ng methanol, ethyl acetate chloroform c c pic cân đối độ phân giải cao Như c th nhận ét: c ng điều kiện thực nghiệm phòng th nghiệm c c dung môi chi t c c chất kh c c th ch ng c độ phân cực kh c Stigmasterol squalene trước c định 3.2.3 Chiết xuất abrin thử hoạt tính gây độc tế bào Số TT Bảng 3.14 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào IC50 (µg/ml) Tên mẫu KB LU MCF–7 Hep G2 Mẫu > 128 > 128 > 128 > 128 Mẫu 76.41 125.81 > 128 > 128 Theo k t bảng 3.14 ta thấy, dịch chi t hạt cam thảo dây sau k t t a b ng ethanol có hoạt tính với dòng t bào ung thư thử nghiệm là: KB (ung thư bi u mô) LU (ung thư phổi) với giá trị IC50 l n lượt là: 76.41 µg/ml 125.81 µg/ml Dịch chi t nước hoạt tính c ch dòng t bào ung thư thử nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * Kết luận Qua qu trình nghiên c u, đề tài thu c c k t sau: B ng phương ph p sấy khô, phương ph p tro h a mẫu phương ph p hấp thụ nguyên tử AAS c định độ m, hàm lượng tro hàm lượng kim loại hạt cam thảo dây thu h i Qu Sơn- Quảng Nam cho thấy: Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 23 - Độ m c a hạt cam thảo dây 13.85%, độ m c a nguyên liệu bột khô 9.36% - Hàm lượng tro trung bình hạt cam thảo dây 0.883% - Hàm lượng c c kim loại n ng Cu, Pb, Zn, As n m khoảng cho phép theo quy định Quy t định số 867/1998/QĐ-BYT c a Bộ Y T ngày th ng năm 1998 việc ban hành Danh mục Tiêu chu n vệ sinh lương thực, thực ph m Tìm điều kiện tối ưu cho qu trình chi t t ch số hợp chất t hạt cam thảo dây với c c loại dung môi sau: - Dung môi methanol: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 175 ml dung môi methanol thời gian ngày - Dung môi ethyl acetate: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi ethyl acetate thời gian 10 ngày - Dung môi n-hexane: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150ml dung môi n-hexane thời gian ngày - Dung môi chloroform: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi chloroform thời gian 10 ngày Thành ph n h a học c a dịch chi t hạt cam thảo dây dung môi khác nhau: B ng phương ph p GC-MS c định số thành ph n h a học c c dịch chi t t hạt cam thảo dây T dịch chi t n-he ane định danh 15 cấu tử, bao gồm c c hidrocacbon mạch dài hidrocacbon thơm T dịch chi t ethyl acetate định danh 22 cấu tử, bao gồm acid h u cơ, este, terpen, steroid T dịch chi t methanol định danh 24 cấu tử, bao gồm c c acid h u cơ, ancaloid, phenol, flavonoid ester T dịch chi t chloroform định danh 17 cấu tử, bao gồm lacton, ether, ancol ester c a a it béo Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 24 K t t a thu t dịch chi t nước c a hạt cam thảo dây b ng ethanol có hoạt tính với dòng t bào ung thư thử nghiệm là: KB (ung thư bi u mô) với giá trị IC50 là: 76.41 µg/ml LU (ung thư phổi) với giá trị IC50 là: 125.81 µg/ml * Kiến nghị Trong qu trình nghiên c u, c ki n nghị sau: - Ti p tục nghiên c u phương ph p t ch chất c định cấu tr c c a số cấu tử ch nh c c dịch chi t c a hạt cam thảo dây - M c d hạt cam thảo dây c ch a số chất ảnh hưởng không tốt đ n s c khỏe người như: gallic acid, methyl ester, 1,2,3-benzenetriol, m-xylene, p-xylene, adipic acid,bis(2- ethylhexyl)ester, retene palmitic acid ethyl ester; nhiên n ch a số chất c ng dụng y học như: squalene, γ- tocopherol, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, butyrolactone, c n nghiên c u phương ph p t ch c c cấu tử c t nh chất qu y học thực ph m đ nh m đ p ng nhu c u c a sống Đồng thời thử hoạt t nh sinh học c a c c chất t ch đ c c i nhìn tổng th ho thực vật hoạt t nh sinh học c a hạt cam thảo dây, g p ph n làm tăng gi trị sử dụng ch a bệnh c a hạt cam thảo dây c c thuốc dân gian - Nghiên c u c c phận kh c c a cam thảo dây, đ c biệt l r theo c c thử nghiệm hoạt t nh sinh học công bố dịch chi t t r l c hoạt t nh kh tốt Footer Page 26 of 126 ... 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Hạt cam thảo dây Qu Sơn- Quảng Nam 3.2 Phạm vi nghiên cứu Thành ph n hóa học c a số dịch chi t hạt cam thảo dây Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết... a hạt cam thảo dây c màu vàng chanh, dịch chi t chloroform c a hạt cam thảo dây c màu chanh nhạt, dịch chi t n-he ane c a hạt cam thảo dây c vàng nhạt * N ận xét: Khả hòa tan hạt cam thảo dây. .. 126 - X c định thành ph n h a học c c chất t dịch chi t hạt cam thảo dây - Thăm dò hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước c a hạt cam thảo dây Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu