Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố đồng hới trong dung môi n hexan và clorofom

Việc thực hiện nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung môi n-hexan và clorofom là hướng nghiên cứu tách chiết mới các hợp chất thiên nhiên.. Mục đích nghiên cứu - X

LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp là thành quả kiến thức cũng như kĩ năng mà em thu được sau 4 năm ngồi trên ghế giảng đường đại học Thành quả này không thể chỉ riêng một mình em có thể làm được, đó là nhờ công ơn dạy dỗ, những kinh nghiệm quý báu mà thầy cô đã truyền đạt lại cho em trong những năm học qua, cũng như sự quan tâm, ủng hộ của gia đình và bạn bè Để hoàn thành khóa luận này em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, rèn luyện ở Trường Đại học Quảng Bình, nhất là những thầy cô giáo ở tổ bộ môn Hóa, Khoa Khoa học tự nhiên Đặc biệt

em chân thành cảm ơn cô giáo hướng dẫn Thạc sĩ Lý Thị Thu Hoài đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Mặc dù đã có nhiều cố gắng

để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất song do điều kiện thực tế cũng như hạn chế về mặt kiến thức và kinh nghiệm nên bản thân em có thể có những sai sót

mà bản thân không thấy được, rất mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để khóa luận có thể hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Tuyết Trinh

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC i

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

4 Giả thuyết khoa học 1

5 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

6 Các phương pháp nghiên cứu 2

7 Bố cục khóa luận 2

NỘI DUNG 3

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây hoa sữa 3

i) Sơ lược nguồn gốc cây hoa sữa trong giới thực vật 3

ii) Cây hoa sữa 4

1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây hoa sữa 6

1.3 Hợp chất Ancaloit 6

i) Khái niệm 6

ii) Thành phần nguyên tố và cấu tạo của Ancaloit 7

iii) Phân loại Ancaloit 7

iv) Tính chất chung của Ancaloit 8

v) Sự tạo thành Ancaloit trong cây 9

vi) Thuốc thử Ancaloit 9

1.4 Flavonoit 10

i) Đại cương về flavonoit 10

ii) Hợp chất flavonoit có trong cây hoa sữa 12

1.5 Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa 12

i) Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 12

ii) Phương pháp chiết 13

iii) Phương pháp sắc ký 17

Chươ ng 2: NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 22

2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 22

2.1.1 Nguyên liệu chính 22

2.1.2 Thu mẫu hoa và phương pháp xử lý 22

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 22

2.2 Quy trình nghiên cứu 22

2.2.1 Tách, chiết tinh dầu 22

2.2.2 Tách, chiết bằng dung môi hữu cơ 24

2.2.3 Tách, chiết bằng dung dịch axit 26

2.2.4 Pha thuốc thử 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1. Hàm lượng tinh dầu 28

3.2. Thành phần trong dịch chiết nước, chiết bằng dung dịch axit 28

3.2.1 Dịch chiết nước 28

3.2.2 Dịch chiết dung dịch axit 29

3.3. Thành phần Ancaloit trong dịch chiết n-hexan 30

3.3.1 Hàm lượng 30

3.3.2 Trạng thái vật lý 31

3.3.3 Phản ứng với thuốc thử 31

3.4. Thành phần trong dịch chiết clorofom 32

3.4.1 Hàm lượng 32

3.4.2 Trạng thái vật lý 32

3.4.3 Phản ứng với thuốc thử 33

3.5. Kết quả khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 34

3.5.1. Kết quả lựa chọn thuốc thử 34

3.5.2. Kết quả lựa chọn dung môi chiết 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

1 Kết luận 36

2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1: Các loại pha động và pha tĩnh thường được sử dụng

trong kỹ thuật sắc ký 18

Bảng 2: Tóm tắt các cấu hình sắc ký khác nhau 19

Bảng 3: Kết quả khi thử sản phẩm chiết với thuốc thử 34

DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây hoa sữa ở thành phố Đồng Hới 4

Hình 2: Hoa sữa 5

Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 13

Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước Hoa sữa trong phòng thí nghiệm 23

Hình 5: Chiết n-hexan 25

Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 27

Hình 7: Kết quả thử thuốc thử của dịch nước khi chiết trong dung môi hữu cơ 28

Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, thử thuốc thử 29

Hình 9: Cao etanol hòa tan trong dung dịch HCl 5% 30

Hình 10: Dịch chiết n-hexan 31

Hình 11: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Wagner 31

Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer 32

Hình 13: Dịch chiết clorofom 33

Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer 33

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hoa sữa là cây khá phổ biến ở Việt Nam Cây thường được trồng lấy bóng mát ở nhiều địa phương Từ xa xưa ông cha ta đã biết dùng vỏ cây hoa sữa làm thuốc chữa bệnh Các nghiên cứu gần đây chủ yếu là nghiên cứu về thành phần của vỏ cây hoa sữa và cho thấy vỏ của chúng chứa Ancaloit có tác dụng dược lý Một bộ phận khác của cây là hoa thì lại được ít nghiên cứu đề cập đến Hoa sữa là loài hoa có mùi thơm nồng nên nghiên cứu xác định thành phần có trong hoa có thể làm phong phú thêm nguồn hương liệu phục vụ công nghiệp sản xuất Mặt khác, ngoài vỏ cây có tác dụng dược lý thì hoa cũng có thể chứa thành phần tương

tự, xác định được thành phần đó làm phong phú thêm nguồn dược liệu phục vụ trong y học Ở địa bàn thành phố Đồng Hới là nơi có nhiều hoa sữa, làm nguồn

nguyên liệu phong phú phục vụ cho quá trình nghiên cứu và ứng dụng

Việc thực hiện nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung môi n-hexan và clorofom là hướng nghiên cứu tách chiết mới các hợp chất thiên

nhiên Vì vậy, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa

sữa tại thành phố Đồng Hới trong dung môi n-Hexan và Clorofom”

2 Mục đích nghiên cứu

- Xác định thành phần hoá học các hợp chất trong dịch chiết hoa sữa bằng dung môi n-Hexan và Clorofom

- Xây dựng qui trình chiết tách Ancaloit trong hoa sữa

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Cây hoa sữa, được chọn một cách ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố Đồng Hới

- Hoa của cây hoa sữa lấy trong khoảng thời gian tháng 11/2014 - 01/2015

4 Giả thuyết khoa học

- Hoa sữa là cây thuộc họ trúc đào, là cây có hàm lượng Ancaloit lớn trong tự nhiên Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy thành phần vỏ cây chứa Ancaloit, mà trong thực vật Ancaloit không chỉ tập trung ở một bộ phận mà phân bố ở nhiều bộ

phân khác của cây Hoa của cây hoa sữa có thể chứa thành phần Ancaloit

- Hoa sữa đã được sử dụng nhiều trong y dược, vì vậy nó có hợp chất có tác

dụng dược lý

- Đề tài này xác định thành phần có trong dịch chiết hoa sữa để biết rõ những

hợp chất có trong dịch chiết n-Hexan và Clorofom

5 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xây dựng hệ thống lý thuyết về tách chiết các hợp chất trong các dung môi làm cơ sở cho thực nghiệm

- Tìm hiểu đối tượng cần nghiên cứu là hoa sữa

- Lập kế hoạch, quy trình nghiên cứu thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung môi n-hexan và clorofom

- Tổ chức thực hiện kiểm chứng lại giả thuyết đã nêu

6 Các phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết

- Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

+ Phương pháp chọn mẫu

+ Chiết bằng các dung môi n-hexan và clorofom

+ Xác định thành phần các hợp chất trong dịch chiết từ vỏ hoa sữa trong dung môi chiết bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS

+ Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm

+ Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

- Phần kết luận và kiến nghị

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây hoa sữa

1.1.1 Sơ lược nguồn gốc cây hoa sữa trong giới thực vật

Hoa sữa, hay còn gọi là mò cua, mù cua (danh pháp khoa học Alstonia

scholaris (L.) R.Br) là một loài thực vật nhiệt đới thuộc chi Hoa sữa, họ Trúc đào,

bộ Hoa vặn (Contortae) hay bộ Long đởm (Gentianales)

Họ Trúc đào - Apocynaceae, là cây gỗ hay cây nhỏ, nhiều bộ phận của cây có

nhựa mủ trắng Lá thường mọc đối hoặc mọc vòng, đôi khi mọc cách, không có lá

kèm Hoa đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hay cụm hoa xim Hoa trừ

bộ nhụy gồm 2 lá noãn (đôi khi 3-5) Hoa đều, tràng hợp hình ống, thường có

phần phụ dạng vảy hoặc lông ở bên ống tràng, các thùy tràng xếp vặn Số nhị bằng

số cánh hoa, chỉ dính vào ống tràng, bao phấn hình mũi tên, trung đới có thể mang

phần phụ là lông dài, hạt phấn rời nhau Bầu trên, thường rời hoặc phân thùy, 1

vòi và 1 đầu nhụy Đầu nhụy thường loe rộng, hình nón cụt và các bao phấn

thường dính vào đó Trong mỗi lá noãn hoặc trong mỗi ô của bầu có từ 2 đến

nhiều noãn đảo Quả thường gồm 2 đại, có khi quả hạch Hạt có cánh hay chùm

lông tơ, dễ phát tán Phôi nhỏ và có nội nhủ [1]

Trúc đào là một họ lớn, có tới gần 200 chi và 2000 loài, phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta tìm thấy khoảng 50 chi và 170 loài, thường mọc trên các đồi hoặc rừng thưa, có một số loài cây trồng Chất nhựa mủ ở trong cây họ Trúc đào thường có tính độc (như ở các chi Nerium, Strophanthus), có vị đắng, y học dùng làm thuốc Ở một số ít cây, chất nhựa mủ này lại có tính đàn hồi như cao su Trong cây, sợi libe rất vững chắc, do đó có thể dùng lấy sợi

Một số cây quen thuộc trong họ Trúc đào như:

- Dây huỳnh (Allamanda cathartica L.): Cây bụi leo lá mọc vòng 4 chiếc

một, hoa to, màu vàng Cây trồng làm cảnh

- Trúc đào (Nerium odrorum L.): Cây nhỏ, lá mọc vòng 3 chiếc một, màu lục

thẩm, dai cứng Hoa thường có cánh kép, màu đỏ hồng hay trắng Lá có chất độc, chứa neriolin, có thể dùng để chữa bệnh tim Cây trồng làm cảnh

- Đại (Plumeria rubra L var acutifolia (Ait.) Woods.): Cây nhỡ, cành khỏe,

lá lớn mọc cách, để lại những vết sẹo sau khi rụng Hoa khá lớn, ngoài màu trắng, trong vàng, thơm Một vài bộ phận cây được dùng làm thuốc: vỏ thân và vỏ rể có

tác dụng tẩy mạnh, hoa dùng chữa ho, lá dã đắp chữa sai khớp, bong gân, mụn nhọt, nhựa dùng như vỏ thân nhưng liều thấp hơn, còn dùng chữa chai chân và vết loét Cây thường được trồng ở đình chùa làm cảnh

- Thông thiên (Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum.): Cây nhỡ, lá mọc cách

màu lục bóng Hoa màu vàng, hình chuông Quả màu lục Cây trồng làm cảnh Hạt chứa dầu và một số heterozit trong đó có chất thevetin được dùng chế thuốc chữa bệnh tim Có nơi dùng hạt dã nát làm thuốc trừ sâu Tuy nhiên, việc dùng thuốc chế từ cây này phải hết sức thận trọng vì rất độc

Ở đồi và rừng thưa ta hay gặp các loài như:

- Sừng trâu (Strophantus divaricatus (Lour.) Hook Et Arn.): Cây nhỏ, cao độ

3 - 4m, lá xanh bóng, hoa màu vàng nhạt, quả khô gồm 2 đại dính nhau ở gốc, nom như chiếc sừng trâu Cây độc, hạt dùng chế thuốc chữa bệnh tim

- Thừng mức hay lồng mức (Wrightia annamensis Dub et Eberh.): Cây gỗ

nhỡ, hoa màu trắng hay vàng nhạt, mọc thành xim Gỗ trắng, thớ mịn và nhẹ, dùng làm guốc và khắc dấu Cây mọc nhiều ở rừng thưa và tái sinh khỏe ở các đồi hoang các tỉnh miền Bắc, miền Trung [1]

1.1.2 Cây hoa sữa

Hoa sữa hay mò cua (Alstonia scholaris (L.) R.Br.): Cây to cao khoảng 10 -

20m, vỏ nứt nẻ màu xám Cành mọc vòng Lá mọc vòng 5 - 8 cái, tập trung ở đầu cành; phiến lá dày, hình bầu dục

Hình 1: Cây hoa sữa ở thành phố Đồng Hới

Hoa nhỏ, màu trắng đục, mọc thành xim tán ở nách lá, mùi thơm hắc, nhất là

về đêm Quả gồm hai đại dài và hẹp, chứa nhiều hạt Hạt có mào lông ở hai đầu

Hình 2: Hoa sữa

Loài cổ nhiệt đới, mọc hoang và cũng được trồng khắp ở nước ta Cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh thường mọc ở ven rừng và ở những nơi ẩm như ven sông, ven suối Tái sinh bằng chồi mạnh Có thể trồng bằng cây con hay bằng cành, ra hoa vào tháng 10 - 11 và có quả chính tháng 1 - 2 hàng năm

Gỗ có thể làm gỗ dán và các đồ dùng thông thường Thường được trồng làm cảnh, trồng ven đường phố và quanh các công trình công cộng để lấy bóng mát

Vỏ thân chứa nhiều Ancaloit (0,16 - 0,27%), được dùng nhiều làm thuốc Thường dùng làm thuốc bỗ chữa thiếu máu, kinh nguyệt không đều, sốt rét cấp và mạn tính, đau bụng, ỉa chảy, kiết lỵ, viêm khớp có sưng nóng đỏ đau, bệnh ngoài

da, lở ngứa Vỏ cây sắc đặc dùng ngậm chữa sâu răng Ở nước ta, vỏ cây hoa sữa được dùng làm dược liệu chế rượu bổ Dikatina

Ở Ấn Độ, vỏ được dùng trị sốt rét và cũng dùng trị ỉa chảy, kiết lỵ, và trị rắn cắn; dịch cây đáp các vết loét Ở Thái Lan, vỏ cây dùng trị lỵ, trị cảm và viêm phế quản Ở Trung Quốc, vỏ và lá dùng trị ho gà, viêm khí quản mạn tính, suyễn khan, sốt rét, cảm mạo phát sốt, sưng amygdal, viêm gan cấp tính, phong thấp, đòn ngã, gãy xương, mụn nhọt sưng đỏ [5]

1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây hoa sữa

Hoa sữa là một loài khá phổ biến ở Ấn Độ, vùng Nam Á, Đông Nam Á

vì vậy nhà khoa học trong và ngoài nước đã có các bài báo cáo, nghiên cứu về

nó Các nhà hóa học nghiên cứu về cây hoa sữa chủ yếu là nghiên cứu xác định thành phần hóa học trong các bộ phận của cây Nhiều đề tài chủ yếu nghiên cứu

về thành phần trong vỏ cây, lá Một số nhà khoa học đã phân lập được một số chất có trong đó Những nghiên cứu đó đã chỉ ra rằng trong thành phần hóa học của cây, các bộ phận trong cây có chứa Ancaloit Hoa sữa được biết đến là thực vật giàu Ancaloit và có giá trị trong điều trị bệnh Trong thành phần hóa học có

ở các loài cây thì Ancaloit đóng vai trò quan trọng đến việc phát triển các loài thuốc mới, vì Ancaloit có một loạt cấu trúc hóa học và đã được xác định là quyết định đến tính chất dược lý của cây đó Hầu như tất cả các bộ phận của cây như vỏ, rễ, lá, hoa, quả đều được phát hiện có chứa Ancaloit Từ các bộ phận của cây hoa sữa, các nhà khoa học ở nhiều nước khác nhau trên thế giới

đã phân lập các chất Ancaloit như sau: picirinine; scholaricine; echitamine; clorua echitamine; rhazine; nareline; dihydrocondylocarpine; 19,20-Z-vallesamine; 19,20-E-vallesamine; alschmine và isoalschomine; mataranine A

và B

Ngoài ra trong thành phần hóa học của hoa sữa còn có một số thành phần khác như: linalol; cis và trans oxit linalol; α – tecpineol; tecpinen-4-ol được tìm thấy trong hoa sữa Một số hợp chất như: iridois; coumarin; flavonid; leucoanthocyanis; đường khử; phenolics đơn giản, steroids, saponin và tanin cũng được tìm thấy [6], [7]

1.3 Hợp chất Ancaloit

1.3.1 Khái niệm

Ancaloit là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ, thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật Trên thực tế có rất nhiều loại thực vật có Ancaloit nhưng ở mức độ vết hoặc

tỉ lệ phần vạn Để giới hạn với thực tiễn, một cây được xem là có Ancaloit phải chứa ít nhất 0,05% Ancaloit so với mẫu cây khô Đặc biệt của Ancaloit là có tác dụng hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh Với một lượng nhỏ, có Ancaloit là chất độc gây chết người, nhưng có khi lại

là thần dược trị bệnh đặc hiệu [2]

1.3.2 Thành phần nguyên tố và cấu tạo của Ancaloit

a Thành phần nguyên tố của Ancaloit

Có 3 loại Ancaloit:

- Loại chứa 3 nguyên tố: C, H, N

- Loại chứa 4 nguyên tố: C, H, N, O hoặc C, H, N, S

- Loại chứa 5 nguyên tố: C, H, N, O, S loại này có độc tính rất cao trong các loài nấm độc [2]

b Cấu tạo của Ancaloit

- Các Ancaloit thường có cấu tạo khác nhau, nhưng thường có nhân chứa dị vòng có nitơ như:

- Các Ancaloit trong cùng một cây hoặc cùng một họ thực vật thường có công thức cấu tạo gần giống nhau

- Các Ancaloit trong cây thường kết hợp với các axit như axit oxalic, axit tacric, axit lactic, axit malic để tạo thành dạng muối

- Thành phần của các Ancaloit trong cây phụ thuộc nhiều vào từng vùng, khí hậu, địa lí, các mùa và các năm Ancaloit thường chứa trong môt số bộ phận như:

lá, hạt, rễ, vỏ [4]

1.3.3 Phân loại Ancaloit

Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho

số lượng Ancaloit rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các Ancaloit được chia chia thành ba loại:

- Ancaloit thật: Là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ, thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino axit, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một axit hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, axit aristolochic, Ancaloit tứ cấp Các Ancaloit loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng hơn là theo dị vòng hoàn

- ProtoAncaloit: Được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N-đimetyltryptamin Chúng là những amin đơn giản, được tổng

hợp từ các amino axit, trong đó nguyên tở nitơ không ở trong vòng dị hoàn

- Giả Ancaloit: là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino axit, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là Ancaloit steroid và Ancaloit terpenoid

Hầu hết các Ancaloit hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người

ta cũng thấy Ancaloit trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật Chỉ một đặc điểm chung thường gặp là tên của các Ancaloit thường tận cùng bằng chữ

b Tính bazơ mạnh

- Ancaloit là những hợp chất có tính bazơ yếu, do có sự có mặt của các nguyên tử nitơ Tính bazơ của các Ancaloit cũng khác nhau tùy thùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ

- Các Ancaloit thường có tính bazơ mạnh có thể làm xanh quỳ tím

- Các Ancaloit có thể tạo muối với các axit

- Một số Ancaloit có thể làm kết tủa Fe(OH)3, Al(OH)3 trong dung dịch

- Một số Ancaloit có tính bazơ mạnh đẩy được các bazơ trung bình ra khỏi muối của chúng [2]

d Tác dụng của ánh sáng

Một số Ancaloit không bền ở ngoài ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại; có một số

bị thái hóa khi chiếu tia sáng có bước sóng nhất định [2]

e Hoạt tinh sinh lí cao

Các Ancaloit có tác dụng vào hệ thần kinh rất mạnh và có tác dụng lý hóa đối với cơ thể người và động vật Con người đã sử dụng các Ancaloit với liều lượng nhỏ để chữa bệnh hay giải khát như cacao, cà phê, Nhiều Ancaloit là chất gây nghiện cực kỳ nguy hiểm đối với con người như thuốc phiện, heroin

Các Ancaloit có chứa S thường cố độc tính rất mạnh, người ta thấy các Ancaloit này trong các loài nấm độc [4]

1.3.5 Sự tạo thành Ancaloit trong cây

Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các Ancaloit hay thuộc chất chất của đường kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh ra Ngày nay bằng các phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh được Ancaloit tạo ra từ các axit amin Qua định tính và định lượng Ancaloit trong các bộ phận khác nhau của cây người ta thấy nơi tạo ra Ancaloit không phải luôn luôn là nơi tích tụ Ancaloit Nhiều Ancaloit được tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt [8]

1.3.6 Thuốc thử Ancaloit

Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với Ancaloit, nhưng các thuốc thử này có thể cho kết quả dương tính với các hợp chất như: coumarin, polyphenol, purin, amino axit, protein, axit triterpen, hợp chất có chứa nitơ

Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn có một số thuốc thử khác để phát hiện các loại Ancaloit đăc thù [4]

a Thuốc thử Mayer

Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100ml

Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, nếu

có Ancaloit sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt Cần lưu ý vì tủa tạo thành

sẽ hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử

b Thuốc thử Dragendorff

Hòa tan 8,0 g nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3 30% (d

= 1.18) Hòa tan 28 g KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất Hỗn hợp 2 dung dịch, để yên trong tủ lạnh 5oC cho tủa màu nâu sậm và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml Dung dịch màu cam đỏ được chứa trong chai màu nâu để che ánh sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu được vài tuần

Dung dịch dùng để định tính sự hiện diện của Ancaloit bằng ống nghiệm hoặc để làm dung dịch phun xịt lên bản mỏng

- Để định tính bằng ống nghiệm: Dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit đựng trong ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragandorff vào ống nghiệm nếu có Ancaloit sẽ xuất hiện kết tủa màu cam nâu (Tủa Ancaloit có thể được thu hồi bằng cách xử lý vơi Na2CO3 và chiết với dietyl eter)

Thuốc thử không phản ứng với hợp chất amino axit, nhưng có thể cho kết quả dương tính với hợp chất có nhóm cacbonyl tiếp cách như pyron, cinamadehyd

- Để phun xịt lên tấm bản mỏng: Pha dung dịch phun xịt: trong một bình phun xịt, cho vào lần lượt theo thứ tự: 20ml nước; 5ml HCl 6N; 2 ml dung dịch thuốc thử Dragendorff ở trên và 5 ml NaOH 6 N Dung dịch nếu trữ trong tủ lạnh

có thể để lâu 10 ngày Sử dụng dung dịch này phun xịt lên bản mỏng, nếu có Ancaloit sẽ cho vết màu cam đỏ

c Thuốc thử Wagner

Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 ml nước cất Thêm nước cho đủ 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, nếu có Ancaloit sẽ xuất hiện tủa màu nâu

d Thuốc thử Iodoplatinat (dung dịch để phun xịt lên bản mỏng, phát hiện Ancaloit có nitơ trong vòng dị hoàn)

Dung dịch clorua platin 10% (3ml) và 97 ml nước KI 6 g và 94 ml nước Hỗn hợp hai dung dịch này này lại, trữ dung dịch trong chai lọ màu nâu

1.4 Flavonoit

1.4.1 Đại cương về flavonoit

Flavonoit là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn các flavonoit có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím đỏ, không màu cũng xếp vào nhóm này vì

về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản

Flavonoit có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen

A và B nối nhau qua một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C6 – C3 – C6 Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu

từ dị vòng với dị nguyên tố oxigen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng

B đánh số phụ Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A

Thường flavonoit có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B Các flavonoit có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycosid Các đường thường gặp nhất là đường D-glucose, kế đó là D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và aixt uronic

Chalcon hiện diện ít trong tự nhiên, flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavon và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên Do có nhiều nhóm –OH phenol nên các flavonoit có thể liên kết với nhau để tạo thành phức tạp hơn hoặc tạo với các hợp chất khác có trong cây thí dụ kết hợp với đường để tạo thành glycosid

Các thuốc thử để định tính sự hiện của flavonoit: Có nhiều phương pháp để phát hiện flavonoit

- Phân biệt sơ bộ bằng hơi amoniac: Dưới ánh đèn tử ngoại UV365 và sự hiện diện của hơi amoniac, các flavonoit sẽ thay đổi màu sắc Cao chiết cây được chấm hai chấm riêng biệt lên trên cung cùng một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly Cắt bản mỏng ra làm đôi: một bản để tự nhiên, còn một bản đặt trong bình kính bão hòa bằng hơi bão hòa bằng amoniac và tiếp theo phun xịt bản bởi dung dịch 1% KOH/etanol Lần lượt quan sát màu sắc của các vết trên 2 bản: dưới ánh sáng thường và dưới ánh đèn tở ngoại 365nm Sự khác nhau về màu tùy theo hợp chất flavonoit

- Tác dụng với H2SO4 đậm đặc: Hòa tan hợp chất flavonoit vào H2SO4 đậm đặc; flavon và flavovol cho màu vàng đậm đến màu vàng cam và có phát huỳnh

quang đặc biệt Chalcol, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ Flavanon cho màu từ cam đến đỏ

- Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/etanol: Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoit hòa tan trong etanol, sẽ có màu vàng đến màu cam đỏ Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron cho màu đỏ đến tím

- Tác dụng với dung dịch 1% AlCl3/ etanol: Tùy theo số lượng, vị trí của các nhóm hydroxy - OH, hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen

- Tác dụng với dung dịch axetat chì (có tính kiềm) pha bão hòa trong nước: Phun xịt dung dịch lên bản mỏng, sấy bản 110oC trong 10 phút

- Phản ứng Cyanidin của Wilstatter: Phản ứng khử bột Mg trong HCl/etanol trên các dẫn xuất flavonoit Cách thực hiện như sau: Chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml cao chiết hòa tan trong metanol, ống 1 làm đối chứng Với ống số 2: cho thêm 1ml ancol tert-butyl hoặc ancol isoamyl; 0.5ml HCl đậm đặc;

3 - 5 hạt magie kim loại Đun nhẹ trong vài phút, sẽ xuất hiện màu ở lớp ancol phía trên Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong 2 ống sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím Nếu cao chiết có isoflavon, isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu (kết quả âm tính) Nếu sử dụng bột

Zn thay thế cho bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu đỏ xậm, còn flavanon cho màu hồng nhạt hoặc không màu [4]

1.4.2 Hợp chất flavonoid có trong cây hoa sữa

Nghiên cứu trước đây cho thấy có 8 loại flavonoid trong cây hoa sữa gồm: kaempferol, quercetin, isorhamnetin, kaempferol-3-0-beta-D-galactopyranoside, quercetin-3-0-beta-D-galactopyranoside, isorhamnetin-3-0-beta-D-galactopy-ranoside,kaempferol-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(2-1)-0beta-D-galac-topyranoside, quercetin-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(21)-0-beta-D-galac-topyranoside [3]

1.5 Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa

1.5.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp chất lỏng tan vào nhau được xác định theo

áp suất hơi của các cấu tử riêng theo định luật Raun:

P = P A + P B

Áp suất hơi của hỗn hợp, nếu không tạo thành hỗn hợp đẳng phí, nằm giữa

áp suất hơi của các cấu tử riêng, còn nhiệt độ sôi của hỗn hợp nằm giữa nhiệt độ

sôi của hai cấu tử Ngược lại, nếu hai chất thực tế không hòa tan vào nhau thì chúng không ảnh hưởng gì tới áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp

Áp suất hơi bão hòa P được xác định bằng tổng áp suất hơi của từng cấu tử riêng, nên áp suất hơi của hỗn hợp lớn hơn áp suất hơi của từng cấu tử, còn nhiệt

độ sôi luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng cấu tử

Trường hợp quan trọng nhất là chưng cất lôi cuốn hơi nước (hơi nước lôi cuốn cùng với chất hữu cơ) Chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng để tách biệt hỗn hợp chất, trong đó có một chất dễ bay hơi với nước, để tinh chế chất khỏi chất phụ dạng nhựa, để phân tích hoàn toàn chất dễ bay hơi mà không chưng cất được dưới

áp suất thường Chưng cất lôi cuốn hơi nước có thể tiến hành dưới áp suất thường hay trong chân không Phương pháp này dùng để tách, chiết các hợp chất terpen,

dễ bay hơi có trong hoa sữa

Dụng cụ để cất lôi cuốn hơi nước gồm một bộ phận: bình cầu để tạo hơi nước, bình chứa hỗn hợp chất hữu cơ, bình cầu hứng, ống sinh hàn nước, ống bảo hiểm, ống nối [2]

Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 1.5.2 Phương pháp chiết

Phương pháp chiết là phương pháp thu lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành cấu tử riêng Có thể chiết từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn Phương pháp để chiết các Ancaloit trong hoa sữa là sử dụng chiết chất lỏng

Chiết từ dung dịch là quá trình chuyển từ chất lỏng này sang chất lỏng khác

Sự chuyển đó là tuân theo định luật phân bố chất tan giữa 2 tướng theo định luật phân bố của Nertz:

Dung môi phải chọn là dung môi có khả năng hòa tan lớn chất hơn dung môi

cũ, dễ tách ra khi tinh chế lại thành chất tinh khiết không trộn lẫn vào dung môi

cũ, có sự khác nhau về tỉ khối so với dung môi cũ; ít có khả năng tạo nhũ tương, ít nguy hiểm Nếu chất tan xấu trong nước thì chỉ cần chiết một lần, ngược lại thì phải chiết nhiều lần, có khi phải dùng phương pháp chiết liên tục Sau khi thu được dung dịch chiết, làm khô bằng chất làm khô rồi tinh chế bằng các phương pháp tinh chế thường [2]

Để tách chiết Ancaloit trong cây người ta thường dùng hai phương pháp chủ yếu là chiết tách bằng dung môi hữu cơ và chiết tách bằng dung dịch nước axit

a Chiết với dung dịch axit:

* Nguyên tắc tổng quát: Bột cây được tận chiết với metanol, dung môi rất tốt

có thể chiết hết tất cả các Ancaloit ở dạng baz tự do, Ancaloit dạng tứ cấp N+, dạng N-oxit (N+→O), dạng glycosid, Ancaloit loại phân cực mạnh

* Ưu và nhược điểm của phương pháp:

Khi sử dụng dung môi metanol hoặc etanol, sẽ chiết hết tất cả, nên sẽ khó khăn trong qua trình tách riêng các Ancaloit và các hợp chất hữu cơ

Phương pháp này không chiết tốt các Ancaloit có tính bazơ yếu, vì cần môi trường axit mạnh mới có thể tạo thành muối, tan trong nước [4]

* Quy trình thực hiện:

b Chiết bằng dung môi hữu cơ

* Nguyên tắc tổng quát: Bột cây được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi các Ancaloit ở dạng muối trở thành dạng bazơ tự do; kế tiếp bột cây này được chiết với một trong các loại dung môi hữu cơ như: benzen, dietyl eter, clorofom, etyl axetat

* Ưu nhược điểm của phương pháp

Do tẩm với dung dịch kiềm để biến các muối (N+) thành dạng Ancaloit bazơ

tự do, rồi chiết với clorofom nên phương pháp này không chiết được với những dạng N-oxit (N+→O); dạng N+ tứ cấp Thêm nữa, việc sử dụng dung môi có tính phân cực trung bình như clorofom sẽ không chiết tốt các Ancaloit glycosid, các Ancaloit loại phân cực mạnh

Muốn khắc phục, trước khi chiết tách cần sử dụng bột kẽm Zn/HCl để khử dạng N-oxit thành dạng N tự do hoặc thủy giải Ancaloit glycosid bằng dung dịch axit; hoặc đổi dung môi clorofom bằng loại dung môi khác có tính phân cực mạnh hơn

Việc lựa chọn nồng độ kiềm cho giai đoạn này cần phải nghiên cứu kỹ Việc tẩm bột cây bằng kiềm với nồng độ mạnh/ yếu khác nhau có thể có những ảnh hưởng Đối với Ancaloit có tính baz tương đối mạnh, nếu dùng dung dịch kiềm yếu để kiềm hóa thì có thể không đẩy được Ancaloit ra khỏi muối của nó Đối với Ancaloit chứa nhóm chức ester, amid nếu dùng kiềm nồng độ quá mạnh có thể cắt đứt nối này Đối với

Ancaloit có nhóm –OH phenol như morphin, nếu dùng kiềm mạnh như NaOH, sẽ tạo muối phenolat không tan trong dung môi hữu cơ như clorofom [4]

* Quy trình thực hiện