Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố đồng hới trong dung môi n hexan và clorofom

LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thành kiến thức kĩ mà em thu sau năm ngồi ghế giảng đường đại học. Thành riêng em làm được, nhờ công ơn dạy dỗ, kinh nghiệm quý báu mà thầy cô truyền đạt lại cho em năm học qua, quan tâm, ủng hộ gia đình bạn bè. Để hoàn thành khóa luận em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy suốt trình học tập, nghiên cứu, rèn luyện Trường Đại học Quảng Bình, thầy cô giáo tổ môn Hóa, Khoa Khoa học tự nhiên. Đặc biệt em chân thành cảm ơn cô giáo hướng dẫn Thạc sĩ Lý Thị Thu Hoài tận tình hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Mặc dù có nhiều cố gắng để thực đề tài cách hoàn chỉnh song điều kiện thực tế hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm nên thân em có sai sót mà thân không thấy được, mong đóng góp ý kiến quý thầy cô bạn để khóa luận hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Đồng Hới, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Tuyết Trinh MỤC LỤC Trang DANH MỤC . i MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài 2. Mục đích nghiên cứu . 3. Đối tượng phạm vi nghiên cứu . 4. Giả thuyết khoa học 5. Nhiệm vụ nghiên cứu 6. Các phương pháp nghiên cứu 7. Bố cục khóa luận . NỘI DUNG . Chương 1: TỔNG QUAN . 1.1. Giới thiệu hoa sữa i) Sơ lược nguồn gốc hoa sữa giới thực vật . ii) Cây hoa sữa . 1.2. Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoa sữa . 1.3. Hợp chất Ancaloit . i) Khái niệm ii) Thành phần nguyên tố cấu tạo Ancaloit iii) Phân loại Ancaloit . iv) Tính chất chung Ancaloit v) Sự tạo thành Ancaloit vi) Thuốc thử Ancaloit . 1.4. Flavonoit 10 i) Đại cương flavonoit . 10 ii) Hợp chất flavonoit có hoa sữa . 12 1.5. Phương pháp tách số hợp chất hữu có hoa sữa 12 i) Phương pháp chưng cất lôi nước 12 ii) Phương pháp chiết 13 iii) Phương pháp sắc ký . 17 iv) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) . 20 Chươ ng 2: NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM . 22 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 22 2.1.1. Nguyên liệu 22 2.1.2. Thu mẫu hoa phương pháp xử lý . 22 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ hóa chất 22 2.2. Quy trình nghiên cứu . 22 2.2.1. Tách, chiết tinh dầu 22 2.2.2. Tách, chiết dung môi hữu 24 2.2.3. Tách, chiết dung dịch axit . 26 2.2.4. Pha thuốc thử . 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28 3.1. Hàm lượng tinh dầu . 28 3.2. Thành phần dịch chiết nước, chiết dung dịch axit 28 3.2.1. Dịch chiết nước 28 3.2.2. Dịch chiết dung dịch axit 29 3.3. Thành phần Ancaloit dịch chiết n-hexan 30 3.3.1. Hàm lượng . 30 3.3.2. Trạng thái vật lý . 31 3.3.3. Phản ứng với thuốc thử 31 3.4. Thành phần dịch chiết clorofom . 32 3.4.1. Hàm lượng . 32 3.4.2. Trạng thái vật lý . 32 3.4.3. Phản ứng với thuốc thử 33 3.5. Kết khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 34 3.5.1. Kết lựa chọn thuốc thử . 34 3.5.2. Kết lựa chọn dung môi chiết 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 1. Kết luận 36 2. Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Các loại pha động pha tĩnh thường sử dụng kỹ thuật sắc ký 18 Bảng 2: Tóm tắt cấu hình sắc ký khác . 19 Bảng 3: Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử . 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây hoa sữa thành phố Đồng Hới . Hình 2: Hoa sữa . Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi nước . 13 Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi nước Hoa sữa phòng thí nghiệm 23 Hình 5: Chiết n-hexan 25 Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 27 Hình 7: Kết thử thuốc thử dịch nước chiết dung môi hữu 28 Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, thử thuốc thử . 29 Hình 9: Cao etanol hòa tan dung dịch HCl 5% . 30 Hình 10: Dịch chiết n-hexan . 31 Hình 11: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Wagner 31 Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer 32 Hình 13: Dịch chiết clorofom . 33 Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer 33 MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài Hoa sữa phổ biến Việt Nam. Cây thường trồng lấy bóng mát nhiều địa phương. Từ xa xưa ông cha ta biết dùng vỏ hoa sữa làm thuốc chữa bệnh. Các nghiên cứu gần chủ yếu nghiên cứu thành phần vỏ hoa sữa cho thấy vỏ chúng chứa Ancaloit có tác dụng dược lý. Một phận khác hoa lại nghiên cứu đề cập đến. Hoa sữa loài hoa có mùi thơm nồng nên nghiên cứu xác định thành phần có hoa làm phong phú thêm nguồn hương liệu phục vụ công nghiệp sản xuất. Mặt khác, vỏ có tác dụng dược lý hoa chứa thành phần tương tự, xác định thành phần làm phong phú thêm nguồn dược liệu phục vụ y học. Ở địa bàn thành phố Đồng Hới nơi có nhiều hoa sữa, làm nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho trình nghiên cứu ứng dụng. Việc thực nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa dung môi n-hexan clorofom hướng nghiên cứu tách chiết hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa thành phố Đồng Hới dung môi n-Hexan Clorofom”. 2. Mục đích nghiên cứu - Xác định thành phần hoá học hợp chất dịch chiết hoa sữa dung môi n-Hexan Clorofom. - Xây dựng qui trình chiết tách Ancaloit hoa sữa. 3. Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Cây hoa sữa, chọn cách ngẫu nhiên địa bàn thành phố Đồng Hới. - Hoa hoa sữa lấy khoảng thời gian tháng 11/2014 - 01/2015. 4. Giả thuyết khoa học - Hoa sữa thuộc họ trúc đào, có hàm lượng Ancaloit lớn tự nhiên. Theo nghiên cứu trước cho thấy thành phần vỏ chứa Ancaloit, mà thực vật Ancaloit không tập trung phận mà phân bố nhiều phân khác cây. Hoa hoa sữa chứa thành phần Ancaloit. - Hoa sữa sử dụng nhiều y dược, có hợp chất có tác dụng dược lý. - Đề tài xác định thành phần có dịch chiết hoa sữa để biết rõ hợp chất có dịch chiết n-Hexan Clorofom. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu - Xây dựng hệ thống lý thuyết tách chiết hợp chất dung môi làm sở cho thực nghiệm. - Tìm hiểu đối tượng cần nghiên cứu hoa sữa. - Lập kế hoạch, quy trình nghiên cứu thành phần dịch chiết hoa sữa dung môi n-hexan clorofom. - Tổ chức thực kiểm chứng lại giả thuyết nêu. 6. Các phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết - Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: + Phương pháp chọn mẫu + Chiết dung môi n-hexan clorofom + Xác định thành phần hợp chất dịch chiết từ vỏ hoa sữa dung môi chiết phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS. 7. Bố cục khóa luận Đề tài có cấu trúc gồm có phần: - Phần mở đầu - Phần nội dung + Chương 1: Tổng quan + Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm + Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận - Phần kết luận kiến nghị NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu hoa sữa 1.1.1. Sơ lược nguồn gốc hoa sữa giới thực vật Hoa sữa, hay gọi mò cua, mù cua (danh pháp khoa học Alstonia scholaris (L.) R.Br) loài thực vật nhiệt đới thuộc chi Hoa sữa, họ Trúc đào, Hoa vặn (Contortae) hay Long đởm (Gentianales). Họ Trúc đào - Apocynaceae, gỗ hay nhỏ, nhiều phận có nhựa mủ trắng. Lá thường mọc đối mọc vòng, mọc cách, kèm. Hoa đơn độc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hay cụm hoa xim. Hoa trừ nhụy gồm noãn (đôi 3-5). Hoa đều, tràng hợp hình ống, thường có phần phụ dạng vảy lông bên ống tràng, thùy tràng xếp vặn. Số nhị số cánh hoa, dính vào ống tràng, bao phấn hình mũi tên, trung đới mang phần phụ lông dài, hạt phấn rời nhau. Bầu trên, thường rời phân thùy, vòi đầu nhụy. Đầu nhụy thường loe rộng, hình nón cụt bao phấn thường dính vào đó. Trong noãn ô bầu có từ đến nhiều noãn đảo. Quả thường gồm đại, có hạch. Hạt có cánh hay chùm lông tơ, dễ phát tán. Phôi nhỏ có nội nhủ. [1] Trúc đào họ lớn, có tới gần 200 chi 2000 loài, phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt đới. Ở nước ta tìm thấy khoảng 50 chi 170 loài, thường mọc đồi rừng thưa, có số loài trồng. Chất nhựa mủ họ Trúc đào thường có tính độc (như chi Nerium, Strophanthus), có vị đắng, y học dùng làm thuốc. Ở số cây, chất nhựa mủ lại có tính đàn hồi cao su. Trong cây, sợi libe vững chắc, dùng lấy sợi. Một số quen thuộc họ Trúc đào như: - Dây huỳnh (Allamanda cathartica L.): Cây bụi leo mọc vòng một, hoa to, màu vàng. Cây trồng làm cảnh. - Trúc đào (Nerium odrorum L.): Cây nhỏ, mọc vòng một, màu lục thẩm, dai cứng. Hoa thường có cánh kép, màu đỏ hồng hay trắng. Lá có chất độc, chứa neriolin, dùng để chữa bệnh tim. Cây trồng làm cảnh. - Đại (Plumeria rubra L. var. acutifolia (Ait.) Woods.): Cây nhỡ, cành khỏe, lớn mọc cách, để lại vết sẹo sau rụng. Hoa lớn, màu trắng, vàng, thơm. Một vài phận dùng làm thuốc: vỏ thân vỏ rể có tác dụng tẩy mạnh, hoa dùng chữa ho, dã đắp chữa sai khớp, bong gân, mụn nhọt, nhựa dùng vỏ thân liều thấp hơn, dùng chữa chai chân vết loét. Cây thường trồng đình chùa làm cảnh. - Thông thiên (Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum.): Cây nhỡ, mọc cách màu lục bóng. Hoa màu vàng, hình chuông. Quả màu lục. Cây trồng làm cảnh. Hạt chứa dầu số heterozit có chất thevetin dùng chế thuốc chữa bệnh tim. Có nơi dùng hạt dã nát làm thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, việc dùng thuốc chế từ phải thận trọng độc. Ở đồi rừng thưa ta hay gặp loài như: - Sừng trâu (Strophantus divaricatus (Lour.) Hook. Et Arn.): Cây nhỏ, cao độ - 4m, xanh bóng, hoa màu vàng nhạt, khô gồm đại dính gốc, nom sừng trâu. Cây độc, hạt dùng chế thuốc chữa bệnh tim. - Thừng mức hay lồng mức (Wrightia annamensis Dub. et Eberh.): Cây gỗ nhỡ, hoa màu trắng hay vàng nhạt, mọc thành xim. Gỗ trắng, thớ mịn nhẹ, dùng làm guốc khắc dấu. Cây mọc nhiều rừng thưa tái sinh khỏe đồi hoang tỉnh miền Bắc, miền Trung. [1] 1.1.2. Cây hoa sữa Hoa sữa hay mò cua (Alstonia scholaris (L.) R.Br.): Cây to cao khoảng 10 20m, vỏ nứt nẻ màu xám. Cành mọc vòng. Lá mọc vòng - cái, tập trung đầu cành; phiến dày, hình bầu dục. Hình 1: Cây hoa sữa thành phố Đồng Hới Hoa nhỏ, màu trắng đục, mọc thành xim tán nách lá, mùi thơm hắc, đêm. Quả gồm hai đại dài hẹp, chứa nhiều hạt. Hạt có mào lông hai đầu. Hình 2: Hoa sữa Loài cổ nhiệt đới, mọc hoang trồng khắp nước ta. Cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh thường mọc ven rừng nơi ẩm ven sông, ven suối. Tái sinh chồi mạnh. Có thể trồng hay cành, hoa vào tháng 10 - 11 có tháng - hàng năm. Gỗ làm gỗ dán đồ dùng thông thường. Thường trồng làm cảnh, trồng ven đường phố quanh công trình công cộng để lấy bóng mát. Vỏ thân chứa nhiều Ancaloit (0,16 - 0,27%), dùng nhiều làm thuốc. Thường dùng làm thuốc bỗ chữa thiếu máu, kinh nguyệt không đều, sốt rét cấp mạn tính, đau bụng, ỉa chảy, kiết lỵ, viêm khớp có sưng nóng đỏ đau, bệnh da, lở ngứa. Vỏ sắc đặc dùng ngậm chữa sâu răng. Ở nước ta, vỏ hoa sữa dùng làm dược liệu chế rượu bổ Dikatina. Ở Ấn Độ, vỏ dùng trị sốt rét dùng trị ỉa chảy, kiết lỵ, trị rắn cắn; dịch đáp vết loét. Ở Thái Lan, vỏ dùng trị lỵ, trị cảm viêm phế quản. Ở Trung Quốc, vỏ dùng trị ho gà, viêm khí quản mạn tính, suyễn khan, sốt rét, cảm mạo phát sốt, sưng amygdal, viêm gan cấp tính, phong thấp, đòn ngã, gãy xương, mụn nhọt sưng đỏ. [5] 1.2. Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoa sữa Hoa sữa loài phổ biến Ấn Độ, vùng Nam Á, Đông Nam Á . nhà khoa học nước có báo cáo, nghiên cứu nó. Các nhà hóa học nghiên cứu hoa sữa chủ yếu nghiên cứu xác định thành phần hóa học phận cây. Nhiều đề tài chủ yếu nghiên cứu thành phần vỏ cây, lá. Một số nhà khoa học phân lập số chất có đó. Những nghiên cứu thành phần hóa học cây, phận có chứa Ancaloit. Hoa sữa biết đến thực vật giàu Ancaloit có giá trị điều trị bệnh. Trong thành phần hóa học có loài Ancaloit đóng vai trò quan trọng đến việc phát triển loài thuốc mới, Ancaloit có loạt cấu trúc hóa học xác định định đến tính chất dược lý đó. Hầu tất phận vỏ, rễ, lá, hoa, phát có chứa Ancaloit. Từ phận hoa sữa, nhà khoa học nhiều nước khác giới phân lập chất Ancaloit sau: picirinine; scholaricine; echitamine; clorua echitamine; rhazine; nareline; dihydrocondylocarpine; 19,20-Zvallesamine; 19,20-E-vallesamine; alschmine isoalschomine; mataranine A B. Ngoài thành phần hóa học hoa sữa có số thành phần khác như: linalol; cis trans oxit linalol; α – tecpineol; tecpinen-4-ol tìm thấy hoa sữa. Một số hợp chất như: iridois; coumarin; flavonid; leucoanthocyanis; đường khử; phenolics đơn giản, steroids, saponin tanin tìm thấy. [6], [7] 1.3. Hợp chất Ancaloit 1.3.1. Khái niệm Ancaloit hợp chất hữu có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ, thường gặp nhiều loài thực vật tìm thấy vài động vật. Trên thực tế có nhiều loại thực vật có Ancaloit mức độ vết tỉ lệ phần vạn. Để giới hạn với thực tiễn, xem có Ancaloit phải chứa 0,05% Ancaloit so với mẫu khô. Đặc biệt Ancaloit có tác dụng hoạt tính sinh lý cao thể người động vật, hệ thần kinh. Với lượng nhỏ, có Ancaloit chất độc gây chết người, có lại thần dược trị bệnh đặc hiệu. [2] 10 CHƯƠNG 2. NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆMA 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu Hoa hoa sữa (cây mò cua, mù cua) lấy địa bàn thành phố Đồng Hới. 2.1.2. Thu mẫu hoa phương pháp xử lý Hoa hoa sữa thu vào tháng 11/2014, 1/2015 đường Hữu Nghị, thành phố Đồng Hới. Mẫu hoa tươi hái vào ngày khô ráo, không mưa. Hoa hái nở, có mùi nồng, loại bỏ hoa bị sâu, rầy, hoa bị khô, hoa tàn. Mẫu hoa sau hái bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh nắng trực tiếp. Một lượng tươi xử lý để chưng cất lôi nước; lượng khác xử lý sấy khô. 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ hóa chất a. Thiết bị, dụng cụ - Bếp điện, đèn cồn - Bình cầu: 250ml - Ống nối - Ống sinh hàn - Bình tam giác (erlen): 250ml, cốc thủy tinh: 100ml, 250ml - Ống nghiệm, pipet, bình thủy tinh b. Hóa chất - Etanol 95o, n-hexan, clorofom - Dd HCl 5%, Na2CO3, HgCl2, I2, KI, nước cất. 2.2. Quy trình nghiên cứu 2.2.1. Tách, chiết tinh dầu * Sơ đồ thực 26 Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi nước Hoa sữa phòng thí nghiệm * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa, thu hái vào tháng 01/2015, hoa hái vào ngày khô ráo, không mưa. Mẫu hoa chọn phải không bị sâu, bẩn, có dấu hiệu lạ. Hoa nở vừa phải, nở đều, có mùi nồng, số lượng hoa tàn hoa chưa nở ít. - Mẫu hoa có khối lượng 74,685 gam, xử lý, cắt nhỏ. Cho vào bình cầu tích 250ml. Thêm nước cất vào bình đến thể tích khoảng 2/3 bình. Lắp hệ thống ảnh 4. - Hệ thống phải đảm bảo kín, tránh cho tinh dầu bay bị thất thoát hợp chất dễ bay hơi. - Đun hỗn hợp nhiệt độ khoảng từ 60 - 80oC khoảng thời gian 40 - 60 phút. 27 2.2.2. Tách, chiết dung môi hữu * Sơ đồ thực hiện: * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa tươi phơi khô, tránh ánh nắng trực tiếp, tránh ẩm mốc, tạp chất làm ảnh hưởng đến chất có thành phần hoa sữa, tránh phản ứng hóa học làm biến đổi chất đó, làm sai lệch ảnh hưởng đến kết nghiên cứu. - Mẫu hoa sau phơi khô, đến độ ẩm khoảng 10%, ngâm ngập etanol 95o. Bình đậy kín. - Lọc dịch etanol, loại bã. Lắp hệ thống cô đuổi, thu hồi dung môi, chưng đuổi dung môi bình cầu thể tích 250ml. Hệ thống tương tự chưng cất lôi nước hoa sữa tươi. Nhiệt độ đặt đuổi dung môi khoảng 60 - 70oC. Đuổi dung môi bình cầu đến thể tích khoảng 1/3 bình, chuyển sang cốc thủy tinh, chưng cất thủy để đuổi hết dung môi. Thu cao etanol; chứa Ancaloit nhiều chất hữu khác. 28 - Chiết n-hexan: Pha cao etanol với nước cất bình tam giác; sau thêm n-hexan, lắc, để yên, chiết. Sử dụng pipet để lấy dịch n-hexan phía trên. Thao tác cẩn thận để không lẫn nước vào dịch chiết. Chiết nhiều lần nhạt màu. Lần đầu tiên, pha cao etanol với 150ml nước cất, thêm 50 ml n-hexan, lắc, để yên, chiết; dịch n-hexaxn phía trên, dịch nước phía dưới, chiết lấy n-hexan. Sau lần chiết thứ nhất, thêm tiếp 50ml nước cất 50 ml n-hexan, lắc, chiết nhexan. Sau lần chiết thứ 2, thêm 50ml n-hexan, chiết tiếp. Thêm tiếp 25ml nhexan cho lần chiết thứ 4, 5, 6. Các dịch chiết nhạt màu dần: dịch nước có màu vàng, dịch n-hexan dần, có màu xanh lục. a) b) Hình 5: Chiết n-hexan: 5-a) Hỗn hợp chiết lần đầu; 5-b) Hỗn hợp chiết lần cuối - Dịch n-hexan sau chiết cô đuổi thu hồi dung môi bình cầu, đun bếp với nhiệt độ 50 – 60oC. Đuổi n-hexan đến thể tích khoảng 1/3 V, sau chưng cách thủy để đuổi hết n-hexan, thu cao n-hexan. - Dịch nước sau chiết n-hexan, lọc, chiết với clorofom. Chiết nhiều lần dịch clorofom nhạt màu. Lần chiết thứ nhất, thêm 25ml clorofom vào dịch nước, lắc chiết lấy clorofom phần dưới, thao tác cẩn thận, để nước không lẫn vào dịch clorofom chiết, dịch clorofom lần chiết có màu vàng. Ở lần chiết thứ 2, thêm tiếp 25ml clorofom, lắc, để yên, chiết dịch clorofom. Cũng tương tự cho lần chiết thứ 3, thêm 25ml CHCl3. Ở lần chiết cuối (lần thứ 3) dịch clorofom không màu.Dịch clorofom thu sau chiết, cô đuổi dung môi thu dịch clorofom đậm đặc. - Thử dịch sau chiết với thuốc thử Mayer, Wagner. 29 2.2.3. Tách chiết dung dịch axit * Sơ đồ thực hiện: * Quy trình thực hiện: - Chiết hoa sữa khô với etanol, thu hồi dung môi cách chưng đuổi dung môi lại khoảng 1/3 V; sau chưng cách thủy thu cao etanol. - Hòa tan vào dd axit HCl 5%, đun ấm cho tan tốt nhằm biến đổi tất Ancaloit dạng bazơ tự Ancaloit dạng muối, thành dạng nuối clorua, tan nước. - Thêm nước cất vào dung dịch, khuấy đều. Để yên qua đêm; loạc bỏ cặn. Dung dịch chiết với clorofom nhằm loại bỏ hợp chất hữu Ancaloit. - Dịch nước lại chứa muối Ancaloit, chiết clorofom loại bỏ gần hết hợp chất hữu Ancaloit. - Trong trường hợp tiết kiệm dung môi hữu cơ, thực sau: cao tổng Ancaloit thô hòa vào nước, dùng dung dịch axit để chỉnh pH = 3. Khuấy lọc. Dùng dung dịch kiềm chỉnh pH = 10, để yên qua đêm có tủa. Lọc lấy tủa. Hòa tủa vào nước, chỉnh pH = 3, lại cho kết tủa dung dịch kiềm. Thực vài lần thu Ancaloit thô. Kết tinh lại Ancaloit dung môi. - Thử dịch nước hòa tan cao tổng etanol, dịch axit chứa muối Ancaloit, dịch axit chứa muối Ancaloit dùng Na2CO3 chỉnh pH = 10 với thuốc thử Mayer, Wagner. Quan sát tốc độ phản ứng màu sắc dịch với thuốc thử. 30 2.2.4. Pha thuốc thử a. Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,36 g HgCl2 60 ml nước cất hòa tan g KI 10 ml nước cất. Hỗn hợp hai dung dịch thêm nước cho đủ 100ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết quan sát tượng. b. Thuốc thử Wagner Hòa tan 1,27 g iod I2 g KI 20 ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết quan sát tượng. a) Thuốc thử Mayer b) Thuốc thử Wagner Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. A 3.1. Hàm lượng tinh dầu Các nghiên cứu trước cho thấy hoa sữa có số hợp chất monoterpen: linalool; cis trans oxit linalool; α - tecpineol; tecpinen-4-ol. Tinh dầu hợp chất không tan nước, có mùi thơm, nhiệt độ sôi khoảng 40 -60oC; phương pháp chưng cất lôi nước khoảng thời gian từ 40 - 60 phút thu tinh dầu. Tuy nhiên, điệu kiện phòng thí nghiệm chưa có chứng cất lôi nước, dụng cụ tự lắp đặt (hình 4) thực với mẫu nhỏ, hàm lượng tinh dầu hóa sữa nhỏ, nên thu lượng tinh dầu chưa tiến hành đo GC/MS để xác định thành phần hóa học. 3.2. Thành phần dịch chiết nước dịch chiết dung dịch axit 3.2.1. Dịch chiết nước Dịch nước thu sau chiết dung môi hữu cơ: n-hexan, clorofom có màu vàng, trong, nhạt màu dịch clorofom, kết tủa dịch nước. Thử dịch nước với thuốc thử Mayer, Wagner cho kết sau: - Thuốc thử Mayer: Khi nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước chiết dung môi hữu có kết dương tính với thuốc thử. Trong ống nghiệm xuất kết tủa màu vàng, kết tủa xuất nhanh, nhiều, dung dịch có màu vàng đục. - Thuốc thử Wagner: Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng dịch nước cho kết dương tính. Trong ống nhiệm xuất kết tủa màu nâu, kết tủa xuất nhanh, dịch nước có màu nâu đỏ. Hình 7: Kết thử thuốc thử dịch nước chiết dung môi hữu cơ: a) Mayer; b) Wagner 32 Khi hòa tan 1gam cao etanol vào 100ml nước cất, để yên qua đêm lọc, thu dịch nước có màu vàng tươi, trong. Cũng nhận biết dịch nước thuốc thử Wagner Mayer. Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước. Kết cho thấy với thuốc thử Mayer dung dịch chuyển sang màu trắng đục, không thấy có kết tủa. Còn với thuốc thử Wagner dung dịch có màu nâu đỏ, kết tủa xuất hiện. Kết cho thấy, có hàm lượng nhỏ Ankaloit tan vào nước, khó nhận thuốc thử. a) b) c) Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, phản ứng với thuốc thử a)Dịch nước hòa tan cao etanol, lọc; b) Thuốc thử Mayer; c) Thuốc thử Wagner 3.4.2. Dịch chiết dung dịch axit Cho vào hai bình tam giác, bình 1gam cao etanol, sau hòa tan cao 100ml dung dịch HCl 5%. Ngâm qua đêm, lọc. Bình thứ nhất, chiết clorofom. Bình thứ hai, thêm dung dịch Na2CO3 loãng. Thử thuốc thử với dung dịch hai bình: Bình gồm dịch nước dịch clorofom; bình 2. Hòa tan cao etanol dung dịch axit chuyển Ankaloit có mẫu dạng bazơ tự sang dạng muối clorua tan nước. Cao etanol tan nhanh dung dịch axit. 33 Hình 9: Cao etanol hòa tan dung dịch HCl 5% Ở bình 1: Chiết với clorofom dịch clorofom thu không màu. Phản ứng với thuốc thử dịch axit cho kết dương tính. Thuốc thử Mayer cho kết tủa vàng, rõ, thời gian xuất kết tủa nhanh. Thuốc thử Wagner, dung dịch thu có màu nâu xuất nhanh, lượng kết tủa nhiều. Ở bình 2: Thêm dung dịch Na2CO3 vào dung dịch chứa muối Ankaloit bazơ mạnh đẩy bazơ yếu khỏi muối, đưa Ankaloit lại dạng bazơ tự do. Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử thuốc thử Mayer cho kết dung dịch màu vàng đục, nhạt so với dung dịch bình 1; thuốc thử Wagner cho dung dịch màu nâu đỏ đục, nhạt bình 1, hai không thấy kết tủa xuất hiện. 3.3. Thành phần Ancaloit dịch chiết n-hexan 3.3.1. Hàm lượng Etanol dung môi phân cực, hòa tan hợp chất có tính phân cực không phân cực hợp chất hữu có hoa sữa. Một số chất tan nước tan tốt ancol metanol hay etanol. Mục đích việc sử dụng etanol hòa tan gần toàn chất hữu có mẫu hoa sữa khô, mặt khác etanol độc metanol. Chiết với cao etanol, mẫu hoa sữa tươi có khối lượng 700g, sau phơi khô có khối lượng 80g (chiếm 11,43% khối lượng mẫu tươi). Sau ngâm, chiết với etanol, cô đuổi, thu hồi dung môi thu cao etanol có khối lượng 14,74g (chiếm 18,425% khối lượng mẫu khô; 2,11% khối lượng mẫu tươi). Khi ngâm, chiết với etanol hợp chất không phân cực phân cực ít, đa số hợp chất hữu có hoa sữa tan 34 dung môi etanol. Cao tổng chứa thành phần toàn hợp chất hữu có Ankaloit, flavonoid, . Chiết với dung môi n-hexan, hòa tan cao với nước cất cao không tan hết, dịch nước có màu vàng, thêm n-hexan phần lớn cao di chuyển lên phần dịch n-hexan. n-hexan dung môi không phân cực, hòa tan tốt hợp chất hữu không phân cực. Sau chiết n-hexan, cô đuổi, thu hồi dung môi nhiệt độ khoảng 60oC thu cao n-hexan. 3.3.2. Trạng thái vật lý Cao n-hexan có màu xanh thẫm. Hòa tan vào lại n-hexan thu dịch chiết, không thấy có kết tủa. Hình 10: Dịch chiết n-hexan 3.3.3. Phản ứng với thuốc thử Thử dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer Wagner: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết n-hexan, sau nhỏ vài giọt thuốc thử. - Thuốc thử Wagner: Dịch chiết n-hexan có kết dương tính với thuốc thử Wagner. Thời gian để xuất kết tủa khoảng 15 phút sau nhỏ thuốc thử vào dịch chiết.Kết tủa dung dịch nhiều, bám dính đáy ống nghiệm, có màu nâu sẫm. Hình 11: Dịch n-hexan phản ứng với thuốc thử Wagner - Thuốc thử Mayer: Dịch chiết n-hexan cho kết dương tính với thuốc thử Wagner. Chất lỏng ống nghiệm tách lớp, lớp không màu, lớp 35 xanh đen.Trong dịch màu xanh đen có xuất kết tủa với lượng nhỏ. Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer Trong dịch chiết n-hexan có chứa thành phần Ankaloit, với hàm lượng nhỏ, nhận biết nhờ sử dụng thuốc thử Mayer, Wagner. 3.4. Thành phần dịch chiết clorofom 3.4.1. Hàm lượng a. Chiết dung môi hữu cơ: Sau chiết với n-hexan, dịch nước thu chiết với CHCl3, trình chiết xảy nhanh sau lần chiết thu dịch clorofom không màu. Dịch clorofom thu sau chiết, thực cô đuổi, thu hồi dung môi nhiệt độ khoảng 50 - 60oC. Từ 75ml dịch clorofom thu 5ml dịch clorofom đậm đặc. b. Chiết dung dịch axit: Khi hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm, lọc bỏ bã, chiết clorofom dịch CHCl3 thu không màu. 3.4.2. Trạng thái vật lý a. Chiết dung môi hữu cơ: Dịch chiết clorofom có màu vàng, dịch chiết clorofom đậm đặc có màu vàng nâu. Không có tủa xuất dịch chiết clorofom. 36 Hình 13: Dịch chiết clorofom b. Chiết dung dịch axit: Dịch chiết clorofom không màu, kết tủa dịch đó. Mặc dù màu clorofom hòa tan hợp chất hữu mà tan tốt CHCl3 axit. 3.4.3. Phản ứng với thuốc thử a. Chiết dung môi hữu Khi thử thuốc thử Mayer Wagner với dịch chiết clorofom phản ứng cho kết khác nhau. Ở thuốc thử Wagner, có kết tủa nâu xuất sau thời gian khoảng 30 phút, dung dịch tách lớp không rõ ràng, thuốc thử Wagner I2/KI, I2 bị hòa tan dung môi phân cực clorofom nên tách lớp xảy không rõ ràng. Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer Thuốc thử Mayer xảy tách lớp rõ ràng, kết tủa xuất hiện.Lớp màu vàng đậm dịch chiết clorofom, lớp thuốc thử Mayer. Lớp chứa dịch chiết clorofom sẫm màu so với chưa thử thuốc thử. Trong dịch chiết clorofom có chứa Ankaloit, không có. b. Chiết dung dịch axit Hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm chiết với clorofom, thu dịch clorofom. Phản ứng thuốc thử với dịch clorofom cho kết âm tính, dịch clorofom không màu phản ứng với thuốc thử Mayer dung dịch ống nghiệm tách lớp rõ rệt, hai lớp dung dịch không màu 37 kết tủa xuất hiện; với thuốc thử Wagner dung dịch có màu nâu đỏ, tách lớp rõ ràng. Nguyên nhân tách lớp phản ứng với thuốc thử dịch clorofom thuốc thử Mayer dung dịch hai muối KI, HgCl2, chất phân cực, không tan dung môi phân cực CHCl3; thuốc thử Wagner hỗn hợp I2/KI, I2 vừa tan KI lại vừa tan CHCl3 nên xảy tách lớp không rõ ràng đó. 3.5. Kết khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 3.5.1. Kết lựa chọn thuốc thử Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử tổng hợp bảng sau: Bảng 3: Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử Phương pháp chiết Dịch chiết n-hexan Dung môi hữu Clorofom Dịch nước Dịch nước Dung dịch HCl 5% Dịch axit Clorofom Dd axit + Na2CO3 Thuốc thử Hiện tượng Mayer Kết tủa màu nâu sẫm Wagner Kết tủa màu nâu đen Mayer Không có kết tủa Wagner Kết tủa nâu (sau thời gian) Mayer Kết tủa vàng rõ rệt Wagner Kết tủa nâu rõ rệt Mayer Dung dịch trắng đục, kết tủa Wagner Dung dịch nâu đỏ, kết tủa Mayer Kết tủa vàng, rõ rệt Wagner Kết tủa nâu, Mayer Không có kết tủa Wagner Không có kết tủa Mayer Dung dịch vàng đục, kết tủa Wagner Dung dịch nâu đỏ, kết tủa 3.5.2. Kết lựa chọn dung môi chiết 38 Kết cho thấy chiết dung môi hữu cơ, n-hexan chiết tốt hợp chất không phân cực, số Ancaloit dạng bazơ tự không tan nước mà tan dung môi n-hexan, nên phản ứng với thuốc thử cho kết dương tính, hàm lượng ít. Ancaloit mẫu thường tồn dạng muối, chiết dung môi hữu n-hexan hay clorofom muối khó tan dung môi hữu cơ, nên dịch nước thu sau chiết dung môi hữu có chứa hàm lượng lớn muối ancaloit, kết phản ứng với thuốc thử thấy rõ ràng. Khi chiết dung dịch axit, Ancaloit dạng bazơ tự chuyển sang dạng muối, muối tan tốt nước, không tan dung môi phân cực clorofom, nên cô cạn, đuổi nước thu Ankaloit dạng muối. Vì phản ứng với thuốc thử xảy nhanh. Trong điều kiện pH khác khả chiết Ancaloit khỏi dung dịch khác nhau. Thực nghiệm cho thấy, pH = 3, Ancaloit tồn dạng muối, phản ứng nhanh với thuốc thử; pH = 10, Ancaloit tồn dạng bazơ tự số Ancaloit có tính bazơ mạnh không bị đẩy khỏi muối, phản ứng chậm với thuốc thử. Qua hai phương pháp chiết dung dịch axit dung môi hữu kết cho thấy, Ancaloit tồn chủ yếu dạng muối, tan tốt nước. Khi chiết hai phương pháp kết thu gần tương đương nhau. Tuy nhiên, để đảm bảo, an toàn tiết kiệm dung môi nên thực phương pháp chiết dung dịch axit, thu muối, sau phân lập hợp chất. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, rút số kết luận sau: - Nghiên cứu tổng quan đối tượng nghiên cứu hoa sữa. Nghiên cứu tổng quan lý thuyết tách chiết sỗ hợp chất thiên nhiên như: Ancaloit, Flavonoit. - Nghiên cứu phương pháp tách chiết số hợp chất có hoa sữa. Phương pháp xử lý mẫu, tách chiết tinh dầu hoa sữa tươi. Phương pháp tách chiết dung môi hữu cơ, dung dịch axit. - Định tính Ankaloit có thành phần dịch chiết. 2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột để tách cấu tử tinh khiết từ hoa sữa, đo GC-MS, LC-MS, cộng hưởng từ để xác định cấu trúc hợp chất chính. Làm giàu cấu tử chính, thử hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng. - Có thể nghiên cứu mở rộng xác định thành phần chất có lá, rễ hoa sữa so sánh với thành phần chất có hoa sữa. Từ đó, lựa chọn nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ cho y học. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Võ Văn Chi (2003); Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1; NXB Khoa học kỹ thuật. [2]. Lê Văn Đăng (2005); Chuyên đề Một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. [3]. Nguyễn Thị Thanh Huyền (2011); Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học vỏ hoa sữa; Luận văn thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Đà Nẵng. [4]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007); Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ; NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. [5]. Hoàng Thị Sản (2006); Phân loại học thực vật; NXB Đại học Sư phạm. [6]. Abhijit Dey (2011); Alstonia scholaris R.Br. (Apocynaceae): Phytochemistry and pharmacology: A concise review; Journal of Applied Pharmaceutical Science. [7]. Bhanu Pratap, G.S.Chakraborthy, Nandini Mogha (2013); Complete Aspects Of Alstonia Scholaris; International Journal of PharmTech Research. [8]. Wikipedia tiếng Việt; http://vi.wikipedia.org/wiki/Ancaloit. 41 [...]... có trong hoa sữa sẽ tan 34 trong dung môi etanol Cao tổng n y chứa thành ph n là to n bộ hợp chất hữu cơ trong đó có Ankaloit, flavonoid, Chiết với dung môi n- hexan, hòa tan cao với n ớc cất thì cao không tan hết, dịch n ớc có màu vàng, nhưng khi thêm n- hexan thì ph n l n cao đã di chuy n l n ph n dịch n- hexan n- hexan là dung môi không ph n cực, n hòa tan rất tốt những hợp chất hữu cơ không ph n cực... không màu, lớp 35 tr n xanh đen .Trong dịch màu xanh đen có xuất hi n kết tủa nhưng với một lượng rất nhỏ Hình 12: Dịch chiết n- hexan với thuốc thử Mayer Trong dịch chiết n- hexan có chứa thành ph n Ankaloit, với hàm lượng nhỏ, có thể nh n biết nhờ sử dụng thuốc thử Mayer, Wagner 3.4 Thành ph n trong dịch chiết clorofom 3.4.1 Hàm lượng a Chiết bằng dung môi hữu cơ: Sau khi chiết với n- hexan, dịch n ớc... thực hi n được khi hệ số K khác 1 Chiết chất hữu cơ từ dung dịch (ph n l n là từ n ớc) là lắc dung dịch với dung môi thích hợp không tr n l n với dung môi cũ (thường là n ớc) và có khả n ng hòa tan tốt chất hữu cơ h n dung môi cũ Dung môi phải ch n là dung môi có khả n ng hòa tan l n chất h n dung môi cũ, dễ tách ra khi tinh chế lại thành chất tinh khiết không tr n l n vào dung môi cũ, có sự khác nhau... tr n, dịch n ớc ở phía dưới, chiết lấy n- hexan Sau l n chiết thứ nhất, thêm tiếp 50ml n ớc cất và 50 ml n- hexan, lắc, chiết nhexan Sau l n chiết thứ 2, thêm 50ml n- hexan, chiết tiếp Thêm tiếp 25ml nhexan cho l n chiết thứ 4, 5, 6 Các dịch chiết nhạt màu d n: dịch n ớc d n d n có màu vàng, dịch n- hexan trong d n, có màu xanh lục a) b) Hình 5: Chiết n- hexan: 5-a) H n hợp chiết l n đầu; 5-b) H n hợp chiết. .. tôi thu được lượng tinh dầu quá ít và chưa ti n hành đo GC/MS để xác định thành ph n hóa học 3.2 Thành ph n trong dịch chiết n ớc và dịch chiết bằng dung dịch axit 3.2.1 Dịch chiết n ớc Dịch n ớc thu được sau khi chiết các dung môi hữu cơ: n- hexan, clorofom có màu vàng, trong, nhạt h n màu của dịch clorofom, không có kết tủa trong dịch n ớc Thử dịch n ớc với các thuốc thử Mayer, Wagner cho kết quả... không thấy kết tủa xuất hi n 3.3 Thành ph n Ancaloit trong dịch chiết n- hexan 3.3.1 Hàm lượng Etanol là dung môi ít ph n cực, có thể hòa tan những hợp chất có tính ph n cực hoặc không ph n cực như các hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa Một số chất tan kém trong n ớc nhưng tan tốt trong ancol như metanol hay etanol Mục đích của việc sử dụng etanol là hòa tan g n như to n bộ chất hữu cơ có trong mẫu hoa sữa. .. thử Wagner 3.4.2 Dịch chiết dung dịch axit Cho vào hai bình tam giác, mỗi bình 1gam cao etanol, sau đó hòa tan cao đó trong 100ml dung dịch HCl 5% Ngâm qua đêm, lọc Bình thứ nhất, chiết clorofom Bình thứ hai, thêm dung dịch Na2CO3 loãng Thử thuốc thử với những dung dịch trong hai bình: Bình 1 gồm dịch n ớc và dịch clorofom; bình 2 Hòa tan cao etanol trong dung dịch axit sẽ chuy n Ankaloit có trong mẫu... của chúng [2] c Tính tan - Các Ancaloit tính bazơ yếu thì phải c n môi trường axit mạnh để tạo thành muối, tan trong n ớc - Các Ancaloit ở dạng bazơ tự do hầu như không tan trong n ớc, nhưng thường tan tốt trong các dung môi hữu cơ như clorofom, dietyl eter, alcol bậc thấp Các muối của Ancaloit thì tan trong n ớc, ancol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như clorofom, dietyl eter, benzen Các... cực Sau khi chiết n- hexan, cô đuổi, thu hồi dung môi ở nhiệt độ khoảng 60oC thu được cao n- hexan 3.3.2 Trạng thái vật lý Cao n- hexan có màu xanh thẫm Hòa tan vào lại một ít trong n- hexan thu được dịch chiết, không thấy có kết tủa Hình 10: Dịch chiết n- hexan 3.3.3 Ph n ứng với thuốc thử Thử dịch chiết n- hexan với thuốc thử Mayer và Wagner: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết n- hexan, sau đó nhỏ vài giọt... Mayer: Khi nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào trong ống nghiệm đựng 3ml dịch n ớc chiết bằng dung môi hữu cơ thì có kết quả dương tính với thuốc thử Trong ống nghiệm xuất hi n kết tủa màu vàng, kết tủa xuất hi n rất nhanh, nhiều, dung dịch có màu vàng đục - Thuốc thử Wagner: Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng dịch n ớc thì cũng cho được kết quả dương tính Trong ống nhiệm xuất hi n kết tủa màu n u, . Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố Đồng Hới trong dung môi n-Hexan và Clorofom . 2. Mục đích nghiên cứu - Xác định thành phần hoá học các hợp chất trong dịch chiết. phục vụ cho quá trình nghiên cứu và ứng dụng. Việc thực hiện nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung môi n-hexan và clorofom là hướng nghiên cứu tách chiết mới các hợp chất. dầu 28 3.2. Thành phần trong dịch chiết nước, chiết bằng dung dịch axit 28 3.2.1. Dịch chiết nước 28 3.2.2. Dịch chiết dung dịch axit 29 3.3. Thành phần Ancaloit trong dịch chiết n-hexan 30