Nghiên cứu tối ưu hoá gene để biểu hiện đồng thời trong escherichia coli và bacillus subtilis

TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Họ tên NCS: VÕ TRÍ NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Ngành: Vi sinh vật học Mã số ngành: 62420107 Khóa học năm: 2014 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đức Hoàng GS TS Trần Linh Thước Tp HCM, tháng 06 năm 2015 TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM Tên đề tài luận án Tên đề tài: Nghiên cứu tối ưu hoá gene để biểu đồng thời Escherichia coli Bacillus subtilis Mục đích nghiên cứu Mục đích đề tài nghiên cứu tối ưu hóa gene hai hệ thống biểu E coli B subtilis nhằm xây dựng chương trình tối ưu hóa gene Các nội dung nghiên cứu sau: Dự đoán HEG Đề tài sử dụng thuật toán đề xuất Pere Puigbò (2007) [3] để tiến hành dự đoán gene biểu cao cho E coli B subtilis Ngoài ra, đề tài sử dụng hai thuật toán đề xuất dựa thuật toán phân cụm k-mean thuật toán phân cụm dựa bán kính để tiến hành dự đoán Nghiên cứu hàm tính điểm để tối ưu hóa gen Đề tài sử dụng hàm tính điểm tuyến tính hàm tính điểm phi tuyến xây dựng mạng noron nhân tạo để làm hàm tính điểm cho trình tối ưu hoá gene Trong đó, hàm tính điểm tuyến tính hàm thường dùng chương trình tối ưu hoá gene Hàm phi tuyến đề tài tiến hành khảo sát xây dựng Xây dựng chương trình tối ưu hóa gene Chương trình xây dựng dựa hàm tính điểm xây dựng cho phép tối ưu hoá tiêu chí sau: (i) tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu hiện, (ii) tối ưu hóa gene đồng thời cho hai hệ thống biểu E coli B subtilis, (iii) tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu B subtilis đồng thời giảm biểu E coli Các tiêu chí tối ưu hóa chương trình bao gồm: (i) Xu hướng sử dụng codon, (ii) Thành phần GC, (iii) Trình tự lặp lại, (iv) Cấu trúc poly-nucleotide, poly-codon, (v) Trình tự Shine-Dalgarno, (vi) Mã kết thúc ẩn, (vii) Cấu trúc bậc hai mRNA, (viii) Trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM Kiểm chứng chương trình Chương trình sau xây dựng đánh giá so sánh với chương trình tối ưu hóa gene khác dựa khả tối ưu tiêu chí xem xét, đồng thời tiến hành tối ưu hóa gene thị kiểm tra thực nghiệm gene tự nhiên gene sau tối ưu hóa hai hệ thống biểu E coli B subtilis để kiểm chứng kết Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần đây, kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống biểu sinh học ngày phát triển ứng dụng rộng rãi Các protein tái tổ hợp dùng nghiên cứu thuộc lĩnh vực sinh học y học chẩn đoán y học lâm sàng, tổng hợp vắcxin, protein cần thiết điều trị bệnh insulin, yếu tố đông máu… đặc biệt ứng dụng việc sản xuất enzyme công nghiệp quan trọng Ngoài ra, protein tái tổ hợp dùng trong nông nghiệp để cải thiện giống trồng, tạo thực vật động vật chuyển gene… Tuy nhiên, việc sử dụng gene tự nhiên vào trình sản xuất thường cho kết biểu thấp Các gene thu nhận từ sinh vật ban đầu, sau đưa vào hệ thống biểu xuất không tương thích xu hướng sử dụng codon hay thành phần GC gene, trình tự lặp lại,…từ làm giảm khả biểu protein mục tiêu Những hạn chế đặt yêu cầu cần phải thiết kế gene, hay gọi tối ưu hóa biểu gene trước đưa vào hệ thống biểu Các nghiên cứu nhóm Hugo G Menzella cộng năm 2011 [1] hay Agnieszka Zylicz-Stachula cộng năm 2014 [2] chứng minh khả gia tăng mức độ biểu gene mục tiêu sau tối ưu hóa so với gene tự nhiên ban đầu Trong chương trình tối ưu hóa gene có giới, xu hướng sử dụng codon (codon usage) xem tiêu chí quan Một amino acid có khả mã hóa hay nhiều codon khác nhau, nhiên loài sinh vật lại có xu hướng sử dụng codon định để mã hóa cho amino acid Một phương pháp nhằm tăng hiệu biểu gene hệ thống biểu đề sử dụng codon “ưa thích” hệ thống biểu Tiêu chí thứ hai xem xét đến sau xu hướng sử dụng codon thành phần GC gene Việc điều chình thành phần GC gene giá trị phù hợp với máy di truyền hệ thống biểu nâng cao hiệu suất TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM trình phiên mã dịch mã gene mục tiêu Các tiêu chí khác tối ưu hóa kể đến xuất trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn, trình tự Shine-Dalgarno, trình tự lặp lại, poly-nucleotide, poly-codon hay mã kết thúc ẩn Các tiêu chí đề nhằm tăng khả phiên mã, dịch mã gene hệ thống biểu tạo thuận lợi trình thu nhận tạo dòng gene [3][4] Một tiêu chí khác có ảnh hưởng nhiều đến khả biểu protein mục tiêu cấu trúc bậc hai mRNA Mặc dù chưa chương trình tối ưu hóa đưa vào ảnh hưởng tiêu chí này, đặc biệt vùng mã hóa cho 10-15 amino acid phân tử protein chứng minh[2] Trong hệ thống biểu protein tái tổ hợp nay, Escherichia coli sử dụng nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp từ sớm phổ biến nhiều năm qua nhờ ưu điểm như: i) dễ nuôi cấy; ii) tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh; iii) khả biểu gene tái tổ hợp mạnh; iv) có khả biểu nhiều gene có nguồn gốc Prokaryote Eukaryote; v) nguồn thông tin di truyền hiểu rõ; vi) có hệ thống vector biểu phong phú [5] Bên cạnh đó, Bacillus subtilis ứng dụng ngày rộng rãi sản xuất protein tái tổ hợp nhờ ưu điểm bật như: i) chủng vi sinh vật an toàn dùng thực phẩm, tổ chức FAD đánh giá vi sinh vật thuộc nhóm GRAS; ii) có khả lên men mật độ cao; iii) có khả tiết hiệu protein ngoại bào, giúp cho việc tinh chế protein mục tiêu dễ dàng; iv) thông tin di truyền hiểu rõ Hầu hết chương trình tối ưu hóa gene GeMS [6], GeneOptimizer [7], Eugene [8], Jcat [9], Dnaworks [10]… có tích hợp chức tối ưu hóa gene cho hai hệ thống biểu Tuy nhiên, chương trình tối ưu hóa gene dừng lại việc tối ưu hóa biểu gene hệ thống biểu riêng lẻ Mặc dù việc tối ưu hóa gene cho hai hệ thống biểu giúp tiết kiệm nhiều công sức, thời gian tài nguyên cho nghiên cứu chức chưa chương trình đưa vào phát triển Một gene sau tối ưu hóa cho hai hệ thống biểu hiện, dòng hóa vào vector biểu kép hai hệ thống biểu thay làm hai trình tự tối ưu hóa khác TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM Cũng vi khuẩn Gram dương khác, B subtilis có vách tế bào dày, gây khó khăn cho việc phá vỡ tế bào quy trình biến nạp phức tạp Do đó, việc dòng hóa tế bào B subtilis không dễ dàng Thay vào đó, tế bào E coli sử dụng cho bước dòng hóa, vector sau tạo thành biểu tế bào B subtilis Qui trình áp dụng rộng rãi giúp nâng cao hiệu dòng hóa biểu B subtilis Tuy nhiên, yêu cầu đặt quy trình phải kiểm soát khả biểu E coli Vì gene mục tiêu biểu cao E coli làm giảm sức sống chúng đặc biệt trường hợp protein mục tiêu có khả gây độc cho E coli Do đó, mục tiêu đặt gene phải tối ưu hóa để biểu cao B subtilis đồng thời biểu thấp E coli Các chương trình tối ưu hóa gene dừng lại việc tối ưu hóa hệ thống biểu E coli B subtilis mà chưa thực mục tiêu vừa trình bày Từ nhận định trên, mục tiêu luận án đề nghiên cứu tối ưu hoá gene đồng thời hai hệ thống biểu E coli B subtilis tiến tới xây dựng chương trình tối ưu hoá gene với chức sau: i) Tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu ii) Tối ưu hóa gene đồng thời cho hai hệ thống biểu E coli B subtilis iii) Tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu B subtilis đồng thời giảm tối ưu hệ thống biểu E coli Tài liệu tham khảo [1] Menzella H.G, (2011), “Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli”, Microbial cell factories, 10:15 TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM [2] Agnieszka Zylicz-Stachula (2014), “Modified ‘one amino acid-one codon’ engineering of high GC content TaqII-coding gene from thermophilic Thermus aquaticus results in radical expression increase”, Microbial Cell Factories 2014, 13:7 [3] Pere Puigbò, Eduard Guzmán, Antoni Romeu, Santiago Garcia-Vallvé (2007), “OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences”, Nucleic Acids Research, Vol 35, Web Server issue [4] Shubhra Gupta (2003), “Project report Codon optimization”, CBS 521, Computational Bioscience Arizona State University [5] Lee, S.Y, (2009), Systems biology and biotechnology of Escherichia coli, Springer [6] Sebastian Jayaraj, Ralph Reid, Daniel V Santi (2005), “GeMS: an advanced software package for designing synthetic genes”, Nucleic Acids Research, Vol 33, No 3011– 3016 [7] David Raab, Marcus Graf, Frank Notka (2010), “The GeneOptimizer Algorithm: using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multiparameter DNA sequence optimization”, Syst Synth Biol 4:215–225 [8] Paulo Gaspar, Jose´ Luı´s Oliveira (2012), “EuGene: maximizing synthetic gene design for heterologous expression”, Bioinformatics Applications Note, Vol 28 no 20, pages 2683–2684 [9] Grote, A,, Hiller, K,, Scheer, M,, Munch, R,, Nortemann, B,, Hempel, D,C, and Jahn, D, (2005), “JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host”, Nucleic Acids Research, 33(Web Server), W526–W531, [10] David M Hoover, Jacek Lubkowski (2002), Dnaworks an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis, Nucleic Acids Research, Vol 30, No 10 e43 TÓM TẮT LUẬN ÁN VÕ TRÍ NAM Xác nhận cán hướng dẫn TS Nguyễn Đức Hoàng ... Tên đề tài: Nghiên cứu tối ưu hoá gene để biểu đồng thời Escherichia coli Bacillus subtilis Mục đích nghiên cứu Mục đích đề tài nghiên cứu tối ưu hóa gene hai hệ thống biểu E coli B subtilis nhằm... đề nghiên cứu tối ưu hoá gene đồng thời hai hệ thống biểu E coli B subtilis tiến tới xây dựng chương trình tối ưu hoá gene với chức sau: i) Tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu ii) Tối ưu hóa gene. .. phép tối ưu hoá tiêu chí sau: (i) tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu hiện, (ii) tối ưu hóa gene đồng thời cho hai hệ thống biểu E coli B subtilis, (iii) tối ưu hóa gene cho hệ thống biểu B subtilis