i) Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
3.2.1.Dịch chiết nước
Dịch nước thu được sau khi chiết các dung môi hữu cơ: n-hexan, clorofom có màu vàng, trong, nhạt hơn màu của dịch clorofom, không có kết tủa trong dịch nước.
Thử dịch nước với các thuốc thử Mayer, Wagner cho kết quả sau:
-Thuốc thử Mayer: Khi nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào trong ống nghiệm đựng 3ml dịch nước chiết bằng dung môi hữu cơ thì có kết quả dương tính với thuốc thử. Trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu vàng, kết tủa xuất hiện rất nhanh, nhiều, dung dịch có màu vàng đục.
-Thuốc thử Wagner: Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng dịch nước thì cũng cho được kết quả dương tính. Trong ống nhiệm xuất hiện kết tủa màu nâu, kết tủa xuất hiện nhanh, dịch nước có màu nâu đỏ.
Hình 7: Kết quả thử thuốc thử của dịch nước khi chiết trong dung môi hữu cơ: a) Mayer; b) Wagner
Khi hòa tan 1gam cao etanol vào 100ml nước cất, để yên qua đêm rồi lọc, thu được dịch nước có màu vàng tươi, trong. Cũng nhận biết dịch nước đó bằng các thuốc thử Wagner và Mayer. Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước. Kết quả cho thấy với thuốc thử Mayer thì dung dịch chuyển sang màu trắng đục, nhưng không thấy có kết tủa. Còn với thuốc thử Wagner thì dung dịch có màu nâu đỏ, không có kết tủa xuất hiện. Kết quả đó cho thấy, có một hàm lượng rất nhỏ Ankaloit tan vào trong nước, khó có thể nhận được bằng thuốc thử.
a) b) c)
Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, phản ứng với thuốc thử
a)Dịch nước hòa tan cao etanol, lọc; b) Thuốc thử Mayer; c) Thuốc thử Wagner 3.4.2. Dịch chiết dung dịch axit
Cho vào hai bình tam giác, mỗi bình 1gam cao etanol, sau đó hòa tan cao đó trong 100ml dung dịch HCl 5%. Ngâm qua đêm, lọc. Bình thứ nhất, chiết clorofom. Bình thứ hai, thêm dung dịch Na2CO3 loãng. Thử thuốc thử với những dung dịch trong hai bình: Bình 1 gồm dịch nước và dịch clorofom; bình 2. Hòa tan cao etanol trong dung dịch axit sẽ chuyển Ankaloit có trong mẫu dưới dạng bazơ tự do sang dạng muối clorua tan trong nước. Cao etanol tan nhanh trong dung dịch axit.
Hình 9: Cao etanol hòa tan trong dung dịch HCl 5%
Ở bình 1: Chiết với clorofom thì dịch clorofom thu được không màu. Phản ứng với thuốc thử của dịch axit cho kết quả dương tính. Thuốc thử Mayer cho kết tủa vàng, rất rõ, thời gian xuất hiện kết tủa nhanh. Thuốc thử Wagner, dung dịch thu được có màu nâu xuất hiện nhanh, lượng kết tủa nhiều.
Ở bình 2: Thêm dung dịch Na2CO3 vào trong dung dịch chứa muối của Ankaloit thì bazơ mạnh sẽ đẩy bazơ yếu ra khỏi muối, đưa Ankaloit về lại dạng bazơ tự do. Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử thì ở thuốc thử Mayer cho kết quả dung dịch màu vàng đục, nhưng nhạt hơn so với dung dịch ở bình 1; thuốc thử Wagner cho dung dịch màu nâu đỏ đục, nhạt hơn ở bình 1, nhưng cả hai đều không thấy kết tủa xuất hiện.
3.3. Thành phần Ancaloit trong dịch chiết n-hexan
3.3.1. Hàm lượng
Etanol là dung môi ít phân cực, có thể hòa tan những hợp chất có tính phân cực hoặc không phân cực như các hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa. Một số chất tan kém trong nước nhưng tan tốt trong ancol như metanol hay etanol. Mục đích của việc sử dụng etanol là hòa tan gần như toàn bộ chất hữu cơ có trong mẫu hoa sữa khô, mặt khác thì etanol ít độc hơn metanol. Chiết với cao etanol, mẫu hoa sữa tươi có khối lượng là 700g, sau khi phơi khô có khối lượng là 80g (chiếm 11,43% khối lượng mẫu tươi). Sau khi ngâm, chiết với etanol, cô đuổi, thu hồi dung môi thu được cao etanol có khối lượng là 14,74g (chiếm 18,425% khối lượng mẫu khô; 2,11% khối lượng mẫu tươi). Khi ngâm, chiết với etanol thì những hợp chất không phân cực hoặc phân cực ít, đa số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa sẽ tan
trong dung môi etanol. Cao tổng này chứa thành phần là toàn bộ hợp chất hữu cơ trong đó có Ankaloit, flavonoid,...
Chiết với dung môi n-hexan, hòa tan cao với nước cất thì cao không tan hết, dịch nước có màu vàng, nhưng khi thêm n-hexan thì phần lớn cao đã di chuyển lên phần dịch n-hexan. n-hexan là dung môi không phân cực, nó hòa tan rất tốt những hợp chất hữu cơ không phân cực. Sau khi chiết n-hexan, cô đuổi, thu hồi dung môi ở nhiệt độ khoảng 60oC thu được cao n-hexan.
3.3.2. Trạng thái vật lý
Cao n-hexan có màu xanh thẫm. Hòa tan vào lại một ít trong n-hexan thu được dịch chiết, không thấy có kết tủa.
Hình 10: Dịch chiết n-hexan
3.3.3. Phản ứng với thuốc thử
Thử dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer và Wagner: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết n-hexan, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử.
-Thuốc thử Wagner: Dịch chiết n-hexan có kết quả dương tính với thuốc thử Wagner. Thời gian để xuất hiện kết tủa khoảng 15 phút sau khi nhỏ thuốc thử vào dịch chiết.Kết tủa trong dung dịch nhiều, bám dính ở đáy ống nghiệm, có màu nâu sẫm.
Hình 11: Dịch n-hexan phản ứng với thuốc thử Wagner
-Thuốc thử Mayer: Dịch chiết n-hexan cũng cho kết quả dương tính với thuốc thử Wagner. Chất lỏng trong ống nghiệm tách lớp, lớp dưới không màu, lớp
trên xanh đen.Trong dịch màu xanh đen có xuất hiện kết tủa nhưng với một lượng rất nhỏ.
Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer
Trong dịch chiết n-hexan có chứa thành phần Ankaloit, với hàm lượng nhỏ, có thể nhận biết nhờ sử dụng thuốc thử Mayer, Wagner.
3.4. Thành phần trong dịch chiết clorofom
3.4.1. Hàm lượng
a. Chiết bằng dung môi hữu cơ:
Sau khi chiết với n-hexan, dịch nước thu được chiết với CHCl3, quá trình chiết xảy ra nhanh chỉ sau 3 lần chiết đã có thể thu được dịch clorofom không màu. Dịch clorofom thu được sau khi chiết, thực hiện cô đuổi, thu hồi dung môi ở nhiệt độ khoảng 50 - 60oC. Từ 75ml dịch clorofom thu được 5ml dịch clorofom đậm đặc.
b. Chiết bằng dung dịch axit:
Khi hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm, lọc bỏ bã, chiết bằng clorofom thì dịch CHCl3 thu được không màu.
3.4.2. Trạng thái vật lý
a. Chiết bằng dung môi hữu cơ:
Dịch chiết clorofom có màu vàng, dịch chiết clorofom đậm đặc có màu vàng nâu. Không có tủa xuất hiện trong dịch chiết clorofom.
Hình 13: Dịch chiết clorofom
b. Chiết trong dung dịch axit:
Dịch chiết clorofom không màu, không có kết tủa trong dịch đó. Mặc dù không có màu nhưng có thể clorofom hòa tan được những hợp chất hữu cơ mà tan tốt trong CHCl3 hơn trong axit.
3.4.3. Phản ứng với thuốc thử
a. Chiết bằng dung môi hữu cơ
Khi thử thuốc thử Mayer và Wagner với dịch chiết clorofom thì phản ứng cho kết quả khác nhau. Ở thuốc thử Wagner, có kết tủa nâu xuất hiện sau thời gian khoảng 30 phút, dung dịch tách lớp không rõ ràng, bởi vì thuốc thử Wagner là I2/KI, I2 bị hòa tan trong dung môi kém phân cực như clorofom nên sự tách lớp xảy ra không rõ ràng.
Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer
Thuốc thử Mayer thì xảy ra sự tách lớp rõ ràng, nhưng không có kết tủa xuất hiện.Lớp dưới màu vàng đậm là dịch chiết clorofom, lớp trên là thuốc thử Mayer. Lớp chứa dịch chiết clorofom sẫm màu hơn so với khi chưa thử thuốc thử.
Trong dịch chiết clorofom có chứa ít Ankaloit, hoặc không có. b. Chiết bằng dung dịch axit
Hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm rồi chiết với clorofom, thu được dịch clorofom. Phản ứng của thuốc thử với dịch clorofom cho kết quả âm tính, dịch clorofom không màu khi phản ứng với thuốc thử Mayer thì
nhưng không có kết tủa xuất hiện; với thuốc thử Wagner thì dung dịch có màu nâu đỏ, không có sự tách lớp rõ ràng. Nguyên nhân của sự tách lớp trong phản ứng với thuốc thử của dịch clorofom do trong thuốc thử Mayer là dung dịch của hai muối KI, HgCl2, đây là những chất phân cực, sẽ không tan trong dung môi kém phân cực như CHCl3; còn trong thuốc thử Wagner là hỗn hợp I2/KI, I2 vừa tan trong KI lại vừa tan trong CHCl3 nên xảy ra sự tách lớp không rõ ràng đó.
3.5. Kết quả khảo sát điều kiện chiết Ancaloit
3.5.1. Kết quả lựa chọn thuốc thử
Kết quả khi thử sản phẩm chiết với thuốc thử được tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 3: Kết quả khi thử sản phẩm chiết với thuốc thử
Phương pháp chiết Dịch chiết Thuốc thử Hiện tượng Dung môi hữu cơ
n-hexan Mayer Kết tủa màu nâu sẫm Wagner Kết tủa màu nâu đen Clorofom Mayer Không có kết tủa
Wagner Kết tủa nâu (sau một thời gian) Dịch nước Mayer Kết tủa vàng rõ rệt
Wagner Kết tủa nâu rõ rệt
Dung dịch HCl 5%
Dịch nước
Mayer Dung dịch trắng đục, không có kết tủa
Wagner Dung dịch nâu đỏ, không có kết tủa
Dịch axit Mayer Kết tủa vàng, rõ rệt Wagner Kết tủa nâu, ít Clorofom Mayer Không có kết tủa
Wagner Không có kết tủa
Dd axit + Na2CO3
Mayer Dung dịch vàng đục, không có kết tủa
Wagner Dung dịch nâu đỏ, không có kết tủa
Kết quả cho thấy khi chiết bằng dung môi hữu cơ, n-hexan đã chiết tốt những hợp chất không phân cực, một số Ancaloit ở dạng bazơ tự do không tan trong nước mà đã tan trong dung môi n-hexan, nên khi phản ứng với thuốc thử thì cho kết quả dương tính, nhưng hàm lượng thì rất ít. Ancaloit trong mẫu cây thì thường tồn tại dưới dạng muối, vì vậy khi chiết bằng các dung môi hữu cơ như n-hexan hay clorofom thì muối đó khó tan trong dung môi hữu cơ, nên dịch nước thu được sau khi chiết bằng dung môi hữu cơ có chứa một hàm lượng rất lớn muối ancaloit, kết quả phản ứng với thuốc thử thấy rất rõ ràng.
Khi chiết bằng dung dịch axit, Ancaloit ở dạng bazơ tự do được chuyển sang dạng muối, muối này tan tốt trong nước, không tan trong dung môi kém phân cực như clorofom, nên khi cô cạn, đuổi nước sẽ thu được Ankaloit dưới dạng muối. Vì vậy khi phản ứng với các thuốc thử xảy ra nhanh. Trong điều kiện pH khác nhau thì khả năng chiết Ancaloit ra khỏi dung dịch cũng khác nhau. Thực nghiệm cho thấy, khi pH = 3, Ancaloit tồn tại ở dạng muối, phản ứng rất nhanh với thuốc thử; ở pH = 10, Ancaloit tồn tại ở dạng bazơ tự do và một số Ancaloit có tính bazơ mạnh không bị đẩy ra khỏi muối, thì phản ứng rất chậm với thuốc thử.
Qua hai phương pháp chiết bằng dung dịch axit và bằng dung môi hữu cơ thì kết quả cho thấy, Ancaloit tồn tại chủ yếu ở dạng muối, tan tốt trong nước. Khi chiết bằng hai phương pháp thì kết quả thu được gần tương đương nhau. Tuy nhiên, để đảm bảo, an toàn và tiết kiệm dung môi thì nên thực hiện phương pháp chiết bằng dung dịch axit, thu được muối, sau đó phân lập các hợp chất.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: -Nghiên cứu được tổng quan về đối tượng nghiên cứu là hoa sữa. Nghiên cứu được tổng quan lý thuyết về tách chiết một sỗ hợp chất thiên nhiên như: Ancaloit, Flavonoit.
-Nghiên cứu được phương pháp tách chiết một số hợp chất có trong hoa sữa. Phương pháp xử lý mẫu, tách chiết tinh dầu trong hoa sữa tươi. Phương pháp tách chiết trong dung môi hữu cơ, trong dung dịch axit.
-Định tính được Ankaloit có trong thành phần dịch chiết.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột để tách được các cấu tử tinh khiết từ hoa sữa, đo GC-MS, LC-MS, cộng hưởng từ để xác định cấu trúc các hợp chất chính. Làm giàu các cấu tử chính, thử hoạt tính sinh học và nghiên cứu các phản ứng chuyển hóa chúng.
-Có thể nghiên cứu mở rộng xác định thành phần các chất có trong lá, rễ của cây hoa sữa so sánh với thành phần các chất có trong hoa sữa. Từ đó, sẽ lựa chọn được nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu các hoạt tính sinh học phục vụ cho y học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Võ Văn Chi (2003); Từđiển thực vật thông dụng, Tập 1; NXB Khoa học và kỹ thuật.
[2]. Lê Văn Đăng (2005); Chuyên đề Một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Thị Thanh Huyền (2011); Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học trong vỏ cây hoa sữa; Luận văn thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Đà Nẵng.
[4]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007); Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ;
NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
[5]. Hoàng Thị Sản (2006); Phân loại học thực vật; NXB Đại học Sư phạm. [6]. Abhijit Dey (2011); Alstonia scholaris R.Br. (Apocynaceae): Phytochemistry and pharmacology: A concise review; Journal of Applied Pharmaceutical Science.
[7]. Bhanu Pratap, G.S.Chakraborthy, Nandini Mogha (2013); Complete Aspects Of Alstonia Scholaris; International Journal of PharmTech Research.