Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm vi khuẩn lactic

Chuẩn bị dụng cụ-Đĩa: gồm một nắp và một đáy nhỏ hơn được lồng vào nhau, thường được dùng chứa môi trường đặc biệt thạch để cấy vi khuẩn.. Khi đĩa chứa môi trường cần úp ngược đĩa trán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐÔNG Á

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM

Sinh viên: Trịnh Quang Long Mã sinh viên: 20211814

Khoa: Công nghệ thực phẩm Giáo viên: Phan Thị Hồng Thảo

Hà Nội, thứ 5 ngày 17 tháng 11 năm 2022

BÁO CÁO

I Chuẩn bị dụng cụ

-Đĩa: gồm một nắp và một đáy nhỏ hơn được lồng vào nhau, thường được dùng chứa môi trường đặc biệt ( thạch ) để cấy vi khuẩn Khi đĩa chứa môi trường cần úp ngược đĩa tránh bốc hơi nước làm khô môi trường.

-Ống nghiệm: dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn, pha loãng hay lưu trữ vi khuẩn.

-Lọ thủy tinh/ bình tam giác: dùng để chứa hóa chất, môi trường nuôi cấy

-Cốc thủy tinh/ cốc nhựa: dùng để pha môi trường, pha hóa chất

-Đèn cồn: có tác dụng vô trùng khi làm việc với vi khuẩn

-Que cấy vòng: làm bằng kim loại, đầu uốn hơi cong giống như có vòng nhỏ dùng để cấy nấm và xạ khuẩn

-Que trang: thường làm bằng thủy tinh, đầu có hình tam giác hoặc hình chữ L dùng để phân bố dịch chứa vi khuẩn trên mặt môi trường đặc

-Pipet: sử dụng để phân phối chính xác các thể tích chất lỏng siêu nhỏ giữa các đĩa, các ống nhỏ hay khay chứa

 Pipet 20 - 200 µl => dùng đầu côn màu vàng  Pipet 100 - 1000 µl => dùng đầu côn màu xanh

-Cân: cân môi trường, cân hóa chất,

-Máy đo pH: dùng để phá hóa chất và môi trường

-Tủ lạnh/tủ âm: lưu trữ, vi sinh vật, hóa chất , môi trường

-Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt: hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm bằng hơi nước ở áp suất cao.

Một số dụng cụ, thiết bị sử dụng trong phong thí nghiệm

a) Cách làm nút bông:

- Ước lượng miếng bông sao cho đủ với ống nghiệm, bình tam giác

- Dùng tay vuốt miếng bông sao cho mặt bông mịn

- Sau đó, dùng ngón tay ấn miếng bông vào miệng bình tan giác hoặc ống nghiệm

* Yêu cầu:

- Trước khi làm nút mọi người cần rửa tay bằng cồn 90° - Nút được làm độ chặt vừa phải, không lỏng quá

- Lấy ra hay đóng vào dễ dàng b) Cách bao gói dụng cụ:

Tất cả dụng cụ sau khi làm xong nút bông thì đều được bao gói kín bằng giấy rồi đưa đi hấp khử trùng, đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn

II Chuẩn bị môi trường

1 Vi khuẩn lactic

Nguyên tắc căn bản chuẩn bị môi trường

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng của từng loại VSV

- Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào VSV

- Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của VSV

Thành phần môi trường: Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH thích hợp, có độ nhớt nhất định không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng.

Kiểm tra môi trường: môi trường sử dụng là môi trường lỏng và đặc Sau khi tạo môi trường thành công, dùng máy đo pH (pH -metre) hoặc giấy quỳ kiểm tra xem đó là môi trường nào, bazơ hay axit để tạo môi trường phù hợp.

Sau đó chúng ta cần hấp khử trùng môi trường

Cách tiến hanh: Cho môi trường vào các giỏ hấp, xếp lần lượt sao cho không bị ướt vào đổ môi trường trong quá trình hấp Kiểm tra nước trong thiết bị khử trùng, xếp giỏ hấp có chứa môi trường vào nồi hấp khử trùng Đóng nắp nồi khử trùng và đặt chế độ khử trùng (chế độ khử trùng thường là 121oC trong 20 phút và 115oC trong 30 phút)

- Khi kết thúc quá trình khử trùng, khi thiết bị báo đã hoàn thành quá trình là có thể mở lấy môi trường khử trùng (chú ý chỉ có thể mở nắp nồi khử trùng khi nhiệt độ về dưới 100oC và áp lực trong nồi về 0o C Khi đã hấp khử trùng xong chúng ta cần làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa pêtri:

+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc Đặt nghiêng ông nghiệm có chứa môi trường thạch dinh dưỡng với độ

nghiêng 1 góc 30o C, để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng để thạch đông chặt lại là được.

+ Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá ,để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.

+ Đổ thạch vào đĩa pêtri: Môi trường thạch nguội đến khoảng 60oC, nhanh tay hé nắp đĩa và đổ môi trường vào bên trong và xoay nhẹ đĩa để giàn đều môi trường.

2 Nấm men

Là tác nhân cơ bản của quá trình lên men rượu.

III Thao tác phân hợp

1 Vi khuẩn lactic

- Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.

a) Xử lí mẫu

-Mẫu ban đầu ở dạng rắn cần phải nghiền, hoặc đồng hóa mẫu và phải đưa về dạng lỏng (nghiền và hoà tan mẫu trong nước cất vô trùng).

-Mẫu lỏng lấy lượng vừa đủ để thực hiện pha loãng b) Pha loãng mẫu:

Theo phương pháp pha loãng tới hạn đến nồng độ thích hợp.

-Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng: Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãng nêu trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường phân tách rõ Số lượng khuẩn lạc trên đĩa không quá dầy để các khuẩn lạc tách rời nhau (thường số lượng khuẩn lạc trên đĩa nên nằm trong khoảng 3<CFU< 250

c) Phân tách và tách khuẩn lạc riêng rẽ từ các mẫu  Kĩ thuật hộp đổ

-Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 – 55oC vào đĩa petri đã cấy mẫu.

-Xoay nhẹ đĩa Petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy.

- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên d) Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn

-Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật ria liên tục

- Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau: +Việc tạo hộp ria từ một khuẩn lạc đơn của chủng thuần để tạo ra một loại khuẩn lạc duy nhất trên bề mặt môi trường có hình thái giống với khuẩn lạc của chủng ban đầu.

+Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nhau trong quan sát dưới kính hiển vi.

Kĩ thuật hộp ria:

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.

- Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc) Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.

- Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập bằng kiểm tra vết cấy

Môi trường đặc

+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại

+ Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ Thực hành phân lập:

1 Phân lập vi khuẩn Lactic Mẫu vật : tôm chua

Hút 1 ml nước tôm chua, cho vào 1 ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất đã khử trùng Tiếp tục pha loãng đến 10^-6 Hút 0,1 ml các ống pha loãng 10^-4 đến 10^-6 vào các đĩa môi trường MRS đã chuẩn bị.

- Trang nhanh tay trên các đĩa, lật úp đĩa, gói và để tủ ấm ở nhiệt độ 30 - 37 độ C trong 48 - 72h.

- Kết quả:

+ Kiểm tra các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, các khuẩn lạc lactic có kích thước thường nhỏ 1 mm có thể có vòng phân hủy Canxi trên đĩa, tròn, bóng Được đếm và đánh số tách ra trên đĩa môi trường MRS mới bằng phương pháp cấy ria

+ Soi kính hiển vi : Tế bào Vi khuẩn lactic có hình que nhỏ, đầu tròn, kích thước 0,6 – 0,9 - 1,5 - 6 μm, đứng riêng lẻ, xếp thànhm, đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt màu gram (+).

Phân lập vi khuẩn lactic

Môi trường phân lập và nuôi cấy MRS

Hình thái vi khuẩn lactic

2 Phân lập nấm men Mẫu vật: men sữa

Nấm men này khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng Tế bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi Khuẩn lạc cho màu trắng sữa.

-Chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy vào môi trường

IV Kết quả thực hiện

Sau khi hỗn hợp đông đặc hoàn toàn, lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ phù hợp cho vi sinh vật kiểm tra phát triển Vi khuẩn ủ trong 48 giờ Nấm men và mốc ủ trong 3-5 ngày.

+ Đếm khuẩn lạc: Sau giai đoạn ủ, giữ lại các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 đến 300 khuẩn lạc Khi đếm khuẩn lạc, chỉ đếm những khuẩn lạc đặc trưng cho chủng vi sinh đang quan tâm, tránh đếm nhầm bọt khí và các hạt không hòa tan trên mặt thạch

+ Tính toán kết quả theo công thức sau:

Sau thời gian 10 ngày cấy: đĩa 10^-8(thu được 1 nấm men, 4 vi khuẩn bị nhiễm, 1 nấm mốc), đĩa 10^-7 (6 nấm men, 5 vi khuẩn bị nhiễm)

V Kết luận

Sau khi kết thúc phần thực hành thí nghiệm ta tạo đc môi trường dinh dưỡng theo yêu cầu biết thực hiện cơ bản thao tác cấy tuy nhiên chưa thành thạo , do thời gian có hạn nên mỗi bài chỉ làm đc 1 thí nghiệm kết quả thí nghiệm mang tính tương đối.