Phân tíh các vitamin nhóm b trong sữa bột trẻ em bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Hiện nay các loại sữa dành cho trẻ em được bổ sung một lượng đáng kể các vitamin là các hợp chất hữu cơ có trong thực phẩm và là nguồn vi chất quan trọng cho quá trình trao đổi chất và d

VŨ THỊ THU HƯƠNG

PHÂN TÍCH CÁC VITAMIN NHÓM B TRONG SỮA BỘT TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

-

VŨ THỊ THU HƯƠNG

PHÂN TÍCH CÁC VITAMIN NHÓM B TRONG SỮA BỘT TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

NGÀNH HÓA CƠ BẢN

MÃ SỐ:

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Tạ Thị Thảo

HÀ NỘI - 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này do bản thân tôi thực hiện, những kết quả nghiên cứu được đưa ra trong luận văn này là của bản thân tôi và chưa từng được ai nghiên cứu, sử dụng và công bố trên các tạp chí khoa học trước đây, các số liệu và kết quả nghiên cứu được thực hiện một cách trung thực và chính xác

LỜI CẢM ƠN

 

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Tạ Thị Thảo - Khoa Hóa - Đại học

môn, phương pháp nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và

tập và thực hiện đề tài thuận lợi

Xin trân trọng cảm ơn các bạn đồng nghiệp Ds Trần Cao Sơn, CN Vũ Thị

Trang, Ban giám đốc, lãnh đạo và cán bộ Labo Hóa độc thực phẩm - Viện Kiểm

trong quá ìtr nh triển khai nghiên cứu đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, và các bạn

năm học tập và quá trình làm luận văn

Hà Nội, ngày 5 tháng 9 năm 2009

Vũ Thị Thu Hương

MỤC LỤ C

LỜI CAM ĐOAN 2

LỜI CẢM ƠN 3

MỤC LỤC 4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 8

DANH MỤC CÁC BẢNG 9

DANH MỤC CÁC HÌNH, PHỤ Ụ L C 9

MỞ ĐẦU 12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 14

1.1 Sữa và thành phần của sữa 14

1.1.1 Nước 14

1.1.2 Cacbohydrat 14

1.1.3 Chất béo 15

1.1.4 Protein 16

1.1.5 Vitamin, khoáng chất và enzym 17

1.1.5.1 Vitamin A 17

1.1.5.2 Vitamin C 18

1.1.5.3 Vitamin D 18

1.1.5.4 Vitamin E 18

1.1.5.5 Vitamin K 18

1.1.5.6 Các khoáng chất 18

1.1.5.7 Enzymes 19

1.2 Vitamin nhóm B trong sữa 20

1.2.1 Tên gọi, cấu trúc, công thức cấu tạo của các vitamin nhóm B 20

1.2.2 Vai trò của các vitamin nhóm B trong sữ a 21

1.2.3 Tính chất các vitamin nhóm B trong sữa 22

1.2.3.1 Thiamine (vitamin B1) 22

1.2.3.2 Riboflavin (vitamin B2) 22

1.2.3.3 Niacin (vitamin PP) 22

1.2.3.4 Pantothenic acid (vitamin B5) 23

1.2.3.5 Pyridoxine (vitamin B6) 23

1.2.3.6 Muối folat (vitamin B9) 23

1.2.3.7 Cyanocobalamin (vitamin B12) 23

1.2.4 Độc tính của các vitamin nhóm B 23

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC một công cụ ứng dụng– 25

hữu hiệu để phân tích các thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm 25

1.3.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC 25

1.3.2 Pha tĩnh trong HPLC 26

1.3.3 Pha động trong HPLC 27

1.3.4 C ác loại detector trong HPLC 28

1.3.5 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 29

1.3.6 P hân tích định tính bằng HPLC 31

1.3.7 P hân tích định lượng bằng HPLC 32

1.3.8 Phương pháp sắc ký lỏng hấp phụ pha ngược RP- HPLC 32

1.3.9 Các phương pháp xác định các vitamin nhóm B trong thực phẩm 33

1.4 Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong phân tích

các vitamin tan trong nước nhóm B trong sữa 34

1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP HPLC) sử dụng detector PDA -

(Photo – diode - array) 34

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion sử dụng cột tách pha ngược RP - LC, detector UV 35 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang 36

1.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA với chế độ chạy

rửa giải gradient 36

1 4.5 Các phương pháp xử lý mẫu 37

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 41

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 40

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 40

2.1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 40

2.2 Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 41

2.2.1 Chất chuẩn, hóa chất và thuốc thử 41

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 42

2.2.3 Mẫu phân tích 43

2.3 Phương pháp nghiên cứu 43

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu sữa 43

2.3.2 Phương pháp phân tích và các điều kiện chạy sắc ký 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích 45

3.1.1 Tối ưu hoá các điều kiện xác định các Vitamin nhóm B bằng HPLC 45

3.1.1.1 Chọn van bơm mẫu 45

3.1.1.2 Chọn cột tách 46

3.1.1.3 Chọn Detector 46

3.1.1.4 Chọn bước sóng phát hiện 47

3.1.1.5 Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 48

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu 58

3.1.2.1 Khảo sát dung dịch chiết mẫu 58

3.1.2.2 Độ thu hồi của phương pháp 59

3.1.2.3 Độ lệch chuẩn 61

3.2 Nghiên cứu đánh giá phương pháp phân tích 63

3.2.1 Khảo sát lập đường chuẩn 63

3.2.2 Giới hạn phát hiện LOD 67

3.2.3 Giới hạn định lượng LOQ 71

3.2.4 Giới hạn tuyến tí nh (LOL) 71

3.2.5 Khoảng tuyến tính 71

3.2.6 Độ chính xác của phương pháp 72

3.2.6.1 Độ đúng 72

3.2.6.2 Độ chụm 73

3.2.6.3 Độ chính xác 75

3.2.7 Độ tái lặp của phương pháp (Đánh giá độ chính xác của phương pháp

giữa các phòng thí nghiệm) 77

3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 80

3.3.1 Quy trình xử lý mẫu 80

3.3.2 Kết quả phân tích thực tế 82

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88

TÓM TẮT NGHIÊN CỨU 90

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

PHỤ LỤC 98

Phụ lục 1: Một số sắc đồ khảo sát tối ưu hóa các điều kiện sắc ký 98

Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát lập đường chuẩn 100

Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát các điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu 103

Phụ lục 4: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực 105

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

UV/VIS Ultraviolet-visible spectrophotometry Quang phổ tử ngoại khả kiến

phương pháp

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

RSDH Relative Standard Deviation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thông tin chung về một số vitamin nhóm B

Bảng 1 Mức hấp thụ cho phép đối với một số vitamin2

Bảng 3.1.Thời gian lưu và bước sóng hấp thụ cực đại của các vitamin tan trong nước nhóm B

Bảng 3.2 Thời gian lưu của các vitamin ở các thành phần pha động khác nhauBảng 3.3 Thành phần pha động

Bảng 3.4 Chương trình rửa giải gradient của pha động

Bảng 3.5 Các loại tốc độ dòng được lựa chọn tương ứng cho từng loại cột tách Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tốc độ dòng

Bảng 3.7 Diện tích pic của các vitamin tại các nồng độ TCA khác nhau

Bảng 3.8 Độ thu hồi của phương pháp xác định các vitamin trong mẫu sữa bột M8 tại 03 mức thêm chuẩn khác nhau

Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp xác định các vitamin trong mẫu sữa bột DDP1tại 03 mức thêm chuẩn khác nhau

Bảng 3.10.Độ lệch chuẩn của phương pháp xác định các vitamin tan trong nước nhóm B trong các mẫu sữa bột

Bảng 3.11.Sự phụ thuộc giữa nồng độ các vitamin và diện tích pic tương ứng Bảng 3.1 Độ tuyến tính của đường chuẩn các vitamin tan trong nước nhóm B2Bảng 3.1 Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp3

Bảng 3.1 Giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo 4 phương trình đường chuẩn

Bảng 53.1 Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

Bảng 3.16 Khoảng tuyến tính của các vitamin tan trong nước nhóm B

Bảng 3.17 Độ đúng của phương pháp xác định các vitamin trong

Bảng 3.21 Kết quả xác định các vitamin nhóm B trong các mẫu sữa bột, sử dụng

chuẩn t hai phía để đánh giá sai số hệ thống của phương pháp

Bảng 3.2 Độ tái lặp của phương pháp xác định các vitamin trong 2

Bảng 3.2 So sánh kết quả xác đinh hàm lượng các vitamin với các giá trị trên 5

nhãn trong 09 mẫu sữa bột trẻ em

Bảng 3.26 Phân tích hồi quy so sánh hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm

B xác định được bằng phương pháp nghiên cứu với hàm lượng trên

nhãn sản phẩm (µ)

DANH MỤC CÁC HÌNH, PHỤ Ụ L C

Hình 1.1 Sơ đồ ấu tạo của hệ thống HPLCc

Hình 3.2 Sắc ký đồ chạy chuẩn hỗn hợp 6 vitamin tại thành phần pha động : đệm photphat (pH 3) : ACN = 90 : 10

Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 06 vitamin theo chương trình chạy gradient

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến diện tích pic

Hình 3.5 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ các vitamin

Hình 3.6 Đường chuẩn của các vitamin trong khoảng tuyến tính

Hình 3.7 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B (B1-106ppb; B2 100ppb; B3-111 ppb; B6:100 ppb; B9: 200 ppb; B12: 178 ppb)

Phụ lục 1 Một số sắc đồ khảo sát tối ưu hóa các điều kiện sắc ký

Phụ lục 2 Sắc đồ khảo sát lập đường chuẩn

Phụ ụ l c 3 Sắc đồ khảo sát các điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu

Phụ lục 4.Một số sắc đồ phân tích mẫu thực

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm hiện nay đang là mối quan tâm của toàn xã hội vì thực phẩm có ảnh hưởng trực tiếp không chỉ đến sự phát triển ở trẻ nhỏ nói riêng

mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của toàn cộng đồng nói chung

Hiện nay sữa là mặt hàng đang được tiêu thụ với nhu cầu ngày càng tăng đặc biệt là sữa cho trẻ em Khi cơn bão melamine trong sữa xảy ra ở Việt Nam đã làm ảnh hưởng không nhỏ đến thị trường sữa, tình hình kinh doanh của các công ty sản xuất sữa trong nước và tâm lý lo lắng của người tiêu dùng Các đợt thanh kiểm tra thị trường sữa của cơ quan quản lý nhà nước cũng cho thấy hầu hết hàm lượng các thành phần dinh dưỡng công bố trên nhãn sản phẩm sữa đều không đúng, đặc biệt với các vitamin và khoáng chất là các thành phần dinh dưỡng rất quan trọng trong quá trình phát triển của trẻ nhỏ Thực tế đó cho thấy tình hình quản lý chất lượng sữa trên thị trường hiện nay vẫn còn bị buông lỏng, thiếu sự giám sát chặt chẽ của các cơ quan quản lý nhà nước

Hiện nay các loại sữa dành cho trẻ em được bổ sung một lượng đáng kể các vitamin là các hợp chất hữu cơ có trong thực phẩm và là nguồn vi chất quan trọng cho quá trình trao đổi chất và duy trì các hoạt động của cơ thể Có 13 loại vitamin rất quan trọng với cơ thể trong đó có 8 vitamin nhóm B tan trong nước như: thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxin, axit folic Các vitamin nhóm B đóng vai trò rất quan trọng cho quá trình trao đổi chất cũng như tái tạo năng lượng và tổng hợp các tế bào máu cho cơ thể Việc xác định được chính xác các hàm lượng vitamin được bổ sung vào sữa sẽ góp phần quản lý chất lượng sữa trên thị trường cũng như đảm bảo được quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng

Dựa trên tình hình thực ế và t nhu cầu câp thiết về lĩnh vực quản lý chất

lượng sữa, chúng tôi thực hiện xây dựng phương pháp nghiên cứu phân tích hàm

lượng các vitamin nhóm B trong sữa bột trẻ em bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

hàm lượng các vitamin trong các mẫu sữa, giúp đánh giá chính xác thông tin của

hàm lượng thành phần các vitamin trong sữa so với các giá trị công bốtrên nhãn sản phẩm và quản lý đ c tốtượ n chất lượng sữa trên thị trườnghơ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Sữa và thành phần của sữa [38]

Về mặt trạng thái, sữa là một chất lỏng màu trắng đụcđược tạo ra bởi động vật

có vú và là nguồn cung cấp dinh dưỡng đầu tiên cho trẻ sơ sinh cũng như các động vật có vú trước khi có thể tiêu hóa được các loại thực phẩm khác Sữa được tiết ra ở thời kỳ đầu tiên được gọi là sữa non trong đó có chứa kháng thể của người mẹ để bảo vệ trẻ, nhờ có chất này có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh ở trẻ nhỏ Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gồm có: nước, cacbohydrat, chất béo, protein, các vitamin và khoáng chất, enzym…

1.1.1 Nước

Trong sữa chứa khoảng 87% là nước, nên sữa là nguồn thực phẩm tốt cho người

ăn kiêng Nước không mang lại ích lợi về mặt dinh dưỡng như protein hay các vitamin Tuy nhiên nước lại rất quan trọng trong trao đổi chất ở người, nước là thành phần chủ yếu của cơ thể, duy trì lượng máu trong cơ thể, vận chuyển dinh dưỡng như glucose và oxi đến các tế bào và bộ phận của cơ thể, cũng như vận chuyển các chất thải khỏi các tể bào và các bộ phận do cơ thể thải ra, giúp duy trì nhiệt độ của cơ thể thông qua việc đổ mồ hôi qua da Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, thiếu hụt nước trong cơ thể sẽ dẫn đến mệt mỏi, suy giảm tinh thần, làm giảm khả năng vận động, chuột rút, nghiêm trọng hơn có thể đe doạ đến mạng sống Ví

dụ, trong thành phần chủ yếu của sữa bò Mỹ, lượng nước chiếm 87,7%, 4,9% là

đường lactoza (cacbohydrat), 3,3% chất béo, 0,7% chất khoáng Thành phần của sữa thay đổi tùy thuộc vào các loại động vật được nuôi để lấy sữa (bò, dê, cừu), thức ăn cho gia súc hay giai đoạn vật nuôi cho sữa

bột có từ các nguồn khác nhau trong ngũ cốc như bột mỳ hay ngô, đều có chung các tính chất hoạt động duy nhất

Trong sữa chứa xấp xỉ 4,9% lượng cacbohydrat mà chiếm ưu thế là đường lactose với một lượng nhỏ của monosacarit và oligosacarit và là nguồn năng lượng quan trọng đầu tiên cung cấp cho các hoạt động của cơ thể Cacbohydrat rất quan trọng trong việc điều tiết hormone trong cơ thể Việc thiếu đường glucoza quá mức trong máu và lượng glucoza dự trữ sẽ dẫn đến mệt mỏi cơ và gây mất tập trung Dưới đây là cấu trúc của glucoza và lactoza:

1.1.3 Chất béo

Chất béo chiếm khoảng 4% trong sữa là một tổ hợp cấu trúc của màng tế bào và hormon, các chất béo là nguồn năng lượng chủ yếu cung cấp cho cơ thể khi cơ thể

có cường độ hoạt động kém hay khi vận động trên 90 phút và là dạng năng lượng

dự trữ cho cơ thể Có 2 loại axit béo chủ yếu cơ thể không thể tự sản sinh ra mà phải thông qua thực phẩm ăn vào, đó là axit béo linoleic (18: 2) và linolenic (18: 3) Hai axit béo này được sử dụng để tổng hợp chuỗi axit béo là axit arachidonic (AA), docopentaenoic acid (DPA , eicosapentaenoic (EPA) và docohexanoic aicd (DHA) ), các axit béo này rất quan trọng trong việc tổng hợp hormone như prostaglandin, thromboxan và thromboxan, leukotrien Các hormone này có vai trò trong một số trường hợp như: co thắt cơ, đông máu, và đáp ứng miễn dịch Các axit béo trong sữa thì có khoảng 65% là axit béo no, 29% béo không no và 6% đa béo không no Các axit đa béo không no trong sữa béo gồm có một lượng nhỏ chủ yêu axit béo linoleic và linolenic, còn lại khoảng 5% trans fatty axit Một trans fatty axit quan

trọng trong sữa béo là conjugated linoleic acid (CLA, 18:2) Có nhiều cấu hình khác nhau của CLA trong sữa đã chứng minh là có khả năng ngăn ngừa được ung thư và giúp duy trì trọng lượng của cơ thể đồng thời vẫn giảm được lượng béo Trong sữa colextêrôn cũng là một thành phần quan trọng của màng tế bào, thường được xem như là một chất đầu tiên tham gia vào quá trình tạo thành muối và hormon steroit

Sự có mặt của colextêrôn trong cơ thể nhằm đảm bảo rằng một tỷ lệ colextêrôn phù hợp là rất cần thiết và có lợi cho hoạt động của cơ thể Tuy nhiên, với hàm lượng colextêrôn quá cao sẽ làm tăng nguy cơ về bệnh tim mạch Lượng colextêrôn cao hay thấp phụ thuộc vào hàm lượng chất béo, tỷ lệ này sẽ thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần chất béo có trong các sản phẩm sữa

1.1.4 Protein

Sữa có khoảng 3,3% protein và chứa tất cả các amino axit chủ yếu, trong đó protein là thành phần quan trong cho các bộ phận cơ thể như cơ, da, tóc và các thành phần tế bào Protein cần thiết để giúp cho hoạt động của các cơ, giúp phục hồi lại các cơ bị tổn thương, protein đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của cơ thể như enzym, hormon, và kháng thể Chín amino axit cần phải hấp thụ từ thực phẩm và được xem như là 9 amino axit quan trọng bao gồm: leucin, isoleucin, valin, phenylalamin, tryptophan, histidin, threonin, methionin và lysin Protein có mặt đầy

đủ chín amino axit này thì thường được gọi là protein “đầy đủ” Protein có nguồn gốc từ động vật và đậu tương là các protein đầy đủ, trong khi đó các protein từ hạt

và rau quả thì thiếu một hay một số amino axit quan trọng, điều này có nghĩa là người tiêu dùng cần phải ăn đầy đủ các thực phẩm để có thể hấp thụ được đầy đủ tất

cả các amino acid quan trọng Protein của sữa được hình thành từ khoảng 82% casein và 18% whey protein (chất lỏng), cả casein và whey protein đều có mặt trong sữa, sữa chua và kem Hầu hết các casein của bơ là dạng huyền phù tạo thành cục và phần whey thì được làm khô chỉ còn lại một lượng nhỏ của whey protein trong bơ Whey protein trở thành thành phần phổ biến trong thực phẩm như là nguồn protein bổ sung hay có lợi cho các hoạt động của cơ thể Ví dụ, whey protein được sử dụng như là nguồn protein có hàm lượng cao trong đồ uống giải khát và là

nguồn năng lượng quan trọng cho môn thể thao điền kinh, hay một vài ví dụ khác

về việc sử dụng whey protein để kết hợp với nước trong thịt và các sản phẩm nước sốt, tạo mầu vỏ cho bánh trong các sản phẩm bánh Trong whey protein có chứa immunoglobulin, một chất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể, ngoài ra trong whey protein có chứa các amino axit mạch nhánh (leucin, isoleucin, valin) và được xem là có lợi cho việc phục hồi các cơ trong môn điền kinh, ngăn sự mệt mỏi tinh thần

1.1.5 Vitamin, khoáng chất và enzym

Các vitamin có rất nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể bao gồm: các cơ chế đồng nhân tố, vận chuyển oxy và chống oxihoa, giúp cho cơ thể sử dụng cacbonhydrat, protein và béo Các vitamin được chia thành 02 nhóm:

+ Nhóm vitamin tan trong nước: thiamin – Vitamin B1, riboflavin B2, – niacin – B3, axit pantothenic – B5; pyridoxine – B6, cyanocobalamin – B12, Vitamin C, axit olic f – B9 Các vitamin quan trọng là B1, B2 và B12, các vitamin khác có trong thành phần sữa với hàm lượng nhỏ như B3, B5, B6, C, B9

+ Nhóm vitamin tan trong dầu: A, D, K, E Hàm lượng của các vitamin tan trong dầu trong các sản phẩm sữa phụ thuộc vào hàm lượng chất béo của sản phẩm

Các vitamin có nhiều vai trò trong cơ thể bao gồm các cơ chế sau: trao đổi chất, vận chuyển oxi, chống oxi hoá Vai trò của một số các vitamine như sau:

Trong sữa có chứa retinol, retinyl esters và caroten, các sản phẩm sữa là nguồn cung cấp vitamin A quan trọng, mặc dù hàm lượng vitamin A sẽ thay đổi tuỳ thuộc vào hàm lượng chất béo của sản phẩm.

β-1.1.5.2 Vitamin C

Vitamin C là một vitamin tan trong nước, trong sữa có một lượng rất nhỏ vitamin C và là một chất chống oxi hoá quan trọng có vai trò trong việc tạo thành collagen trong việc kết nối giữa các mô tế bào và giúp hấp thụ sắt và làm lành các vết thương

1.1.5.3 Vitamin D

Vtamin D là một vitamin tan trong dầu, là thành phần quan trọng trong sữa

và là một vitamin quan trọng trong việc duy trì lượng canxi trong máu và cân bằng photpho, cũng như giúp cho cơ chế trao đổi canxi

1.1.5.4 Vitamin E

Vitamin E là một vitamin tan trong dầu, có chức năng hoạt động như một chất chống oxi hoá Sữa có chứa một lượng nhỏ vitamin E, tuy nhiên hàm lượng vitamin E có nhiều trong các sản phẩm sữa có hàm lượng béo cao.Các hợp chất của vitamin E là tocopherol và tocotrienols

1.1.5.5 Vitamin K

Vitamin K là một vitamin tan trong dầu, liên quan đến việc nghẽn mạch máu,

cơ chế trao đổi chất ở xương và tổng hợp protein Sữa chứa một lượng nhỏ vitamin

K, hàm lượng vitamin K trong sữa tăng hay giảm phụ thuộc vào hàm lượng chất béo có trong các sản phẩm sữa

1.1.5.6 Các khoáng chất

Các khoáng chất đóng một vai trò quan trọng trong cơ thể bao gồm các hoạt động như: enzym, phát triển xương, duy trì cân bằng nước trong cơ thể và vận chuyển ôxi Sữa là nguồn cung cấp quan trọng các khoáng chất như canxi, mag , ê

photpho, kali, selen, và kẽm trong đó rất nhiều chất khoáng trong sữa có mối liên hệ mật thiết với nhau tồn tại dưới dạng muối, như muối canxi photphat Trong sữa có khoảng 67% canxi, 35% mag , 44 % photphat tồn tại dưới dạng muối với casein êmicelle và tan trong pha lỏng Các chất khoáng giúp cơ thể sử dụng tốt các thành phần: cacbohydrat, protein và béo

1.1.5.7 Enzym

Các enzym là các protein có chức năng sinh học, enzym trong sữa có từ các nguồn khác nhau như: có trong sữa, nhiễm vi khuẩn trong không khí, vi sinh vật được cho vào để lên men, hay các tế bào thể soma có trong sữa Mỗi enzym có vai trò đặc trưng riêng phụ thuộc vào đối tượng mục tiêu phân tử của enzym, và các điều kiện tối ưu (như: pH và nhiệt độ) Có một số lượng lớn các enzym trong sữa và hiện nay

chức năng của nhiều enzym vẫn chưa xác định được, người ta cho rằng các enzymtrong sữa không thực hiện vai trò chính yếu vào quá trình tiêu hóa sữa ở người, mà quá trình tiêu hóa này được thực hiện bởi các enzym trong dạ dày và ruột non Tại các nước phương Tây sữa bò được sản xuất trên quy mô công nghiệp, các trang trại sản xuất bơ sữa thương mại sử dụng thiết bị tách sữa tự động hóa để sản xuất sữa trên quy mô lớn Các loại gia súc như Holstein được chăn nuôi nhằm làm tăng sản lượng sữa trong đó 90% sản phẩm sữa bò ở Mỹ và 85% ở Anh là sữa sản xuất

từ giống Holstein Các thành phần cuả sữa tùy thuộc vào các loại sữa khác nhau, thành phần chủ yếu là protein, tỷ lệ protein, béo, đường, tỷ lệ giữa các vitamin và khoáng chất khác nhau, kích thước của các hạt mỡ béo và mức độ đông vón của thành phần béo cũng sẽ thay đổi tùy thuộc vào từng loại sữa Ví dụ:

- Sữa người chứa trưng bình 1,1% protein, 4,2 % béo, 7% đường lactoza, và cung cấp một lượng năng lượng là 72 kcal trên 100 g sữa

- Sữa bò chứa trung bình 3,4% protein, 3,6% béo, 4,6 % đường lactoza, 0,7% các khoáng chất và cung cấp một lượng năng lượng 66 kcal trên 100g sữa

- Sữa lừa và sữa ngựa có hàm lượng béo thấp nhất trong khi sữa của hải cẩu và

cá voi thì lại chứa hơn 50% hàm lượng béo Hàm lượng béo cao trong sữa

không chỉ có duy nhất ở các loài động vật biển mà còn có tỷ lệ cao ở chuột lang với hàm lượng là 46%

1.2 Vitamin nhóm B trong sữa

1.2.1 Tên gọi, cấu trúc, công thức cấu tạo của các vitamin nhóm B

Một số vitamin nhóm B tan trong nước có các tính chất vật lý, cấu trúc hóa học, công thức cấu tạo được trình bày trong bảng 1.1dưới đây:

Bảng 1.1: Thông tin chung về một số vitamin nhóm B

phân tử

M (g/mol) Cấu trúc hóa học

Vitamin B9 Axit folic C19H19N7O6 441.40

Vitamin

B12 Cobalamin C63H88CoN14O14P 1355.37

1.2.2 Vai trò của các vitamin nhóm B trong sữa [38]

Vitamin nhóm B bao gồm các loại: B1, B2, B3, B5, B6, B7, B8, B9, B12.Nhìn chung, vitamin nhóm B đều có tác dụng hỗ trợ quá trình sản xuất năng lượng trong cơ thể cũng như trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng trong tế bào

Các vitamin rất cần thiết cho việc duy trì sức khỏe của con người và tăng trưởng ở trẻ, việc thiếu đáng kể một trong các vitamin có thể gây ra các bệnh nghiêm trọng (1), vì vậy sự có mặt đầy đủ các vitamin trong các sản phẩm sữa và các thực phẩm dinh dưỡng khác cho trẻ em là rất quan trọng

Mặt khác, trong chế độ ăn của con người không phải lúc nào cũng có một lượng vitamin cần thiết cho sự phát triển bình thường và duy trì các chức năng hoạt động của cơ thể Vì lý do này một số sản phẩm thực phẩm được bổ sung thêm các vitamin, đặc biệt được bổ sung trực tiếp vào thực phẩm cho trẻ em, hơn nữa quá trình chế biến thực phẩm và quá trình bảo quản thực phẩm kéo dài cũng làm mất đi một lượng các vitamin Việc bổ sung các vitamin trong sữa trẻ em rất được quan tâm để bù lại lượng vitamin đã bị mất do xử lý nhiệt trong quá trình chế biến thực phẩm Các vitamin nhóm B tan trong nước bao gồm nhiều hợp chất có cấu trúc hóa học khác nhau và giữ vai trò sinh học, rất quan trọng đối với sức khỏe của trẻ nhỏ

So sánh với nhu cầu về sữa của người lớn thì trẻ nhỏ cần một nhu cầu về sữa rất lớn cho quá trình phát triển bình thường của trẻ, việc mất nhiều vitamin trong quá trình sản xuất và bảo quản, và trong thực phẩm bổ sung cũng làm ảnh hưởng đến các sản

phẩm dinh dưỡng Do các vitamin có vai trò rất lớn trong việc đảm bảo chất lượng của các sản phẩm sữa không phải là sữa mẹ và sữa bột cho trẻ, nên các sản phẩm sữa đòi hỏi ngặt nghèo về quản lý chất lượng phân tích Một số sản phẩm thực phẩm cho trẻ nhỏ được sản xuất dựa trên ngũ cốc và hoa quả

Vitamin nhóm B còn góp phần điều hòa tâm sinh lý, giúp chống lại những tâm trạng tiêu cực, mệt mỏi, ủ rũ và căng thẳng Có thể nói vitamin nhóm B đóng vai trò to lớn đối với sự phát triển của trẻ em cả về thể chất lẫn trí tuệ, trên thực tế vitamin nhóm B không tồn tại nhiều trong thực phẩm tự nhiên và dễ bị phân hủy trong nước, do đó không dễ dàng bổ sung vitamin nhóm B cho trẻ, nhất là với trẻ biếng ăn hoặc gặp rắc rối với đường tiêu hóa

Bên cạnh chức năng chung của nhóm, mỗi loại vitamin B có những vai trò riêng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của trẻ nhỏ Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết cho các hoạt động chức năng của con người

1.2.3 Tính chất các vitamin nhóm B trong sữa [38]

1.2.3.1 Thiamine (vitamin B1)

Thiamine (vitamin B1) trong sữa là một vitamin tan trong nước, đồng thời cũng

là một nhân tố enzym liên quan đến cơ chế trao đổi chất của cacbohydrat và các amino axit mạch nhánh

1.2.3.2 Riboflavin (vitamin B2)

Riboflavin (vitamin B2) trong sữa là một vitamin tan trong nước, đồng thời cũng là một nhân tố enzym liên quan đến các phản ứng vận chuyển electron Sữa được xem là nguồn cung cấp riboflavine quan trọng trong cuộc sống hàng ngày của con người

1.2.3.3 Niacin (vitamin B3)

Nicacin (vitamin B3) trong sữa là một vitamin tan trong nước, đồng thời cũng là một nhân tố enzym liên quan đến các phản ứng vận chuyển electron cần

thiết cho năng lượng thực hiện trao đổi chất.Thực tế trong sữa chỉ có một lượng nhỏ hàm lượng niacin

1.2.3.4 Axit Pantothenic (vitamin B5)

Axit pantothenic (vitamin B5) trong sữa là một vitamin tan trong nước, đồng thời cũng là một nhân tố enzym liên quan đến cơ chế trao đổi chất của các axit béo,

và sữa là nguồn cung cấp quan trọng axit pantothenic

1.2.3.5 Pyridoxine (vitamin B6)

Pyridoxine (vitamin B6) trong sữa là một vitamin tan trong nước có liên quan đến cơ chế trao đổi chất của protein và glycogen (năng lượng tích trữ trong gan và cơ) và trong cơ chế trao đổi chất của sphingolipi trong hệ thần kinh.t

1.2.3.6 Muối folat (vitamin B9)

Folat là một vitamin tan trong nước thuộc vitamin nhóm B Trong sữa có một lượng nhỏ folat và là một chất đồng enzym quan trọng trong cơ chế trao đổi chất của protein và axit nucleic và các hoạt động của máu

Folat tham gia quá trình tạo ra tế bào mới và duy trì sự tồn tại của chúng, nó đặc biệt quan trọng trong giai đoạn phân chia và lớn lên nhanh của tế bào như ở trẻ

sơ sinh và phụ nữ mang thai Chất này cần thiết trong việc nhân đôi ADN và giúp tránh quá trình đột biến ADN (vốn là một yếu tố gây ung thư)

1.2.3.7 yanocC obalamin (vitamin B12)

Cyanocobalamin (vitamin B12) trong sữa là một vitamin tan trong nước có liên quan đến cơ chế trao đổi chất của protein và các hoạt động của máu và sữa là nguồn cung cấp quan trọng vitamin B12

1.2.4 Độc tính của các vitamin nhóm B

Mặc dù các vitamin nhóm B là tan trong nước và thường xuyên được thải qua đường nước tiểu, tuy nhiên một số vitamin sẽ có hại cho cơ thể nếu được sử

dụng với một lượng lớn [39] Bảng 1.2 dưới đây liệt kê mức độ hấp thụ cho phép

đối với một số vitamin:

Bảng 1.2: Mức hấp thụ cho phép đối với một số vitamin

Vitamin Tên Mức hấp thụ tối đa

trong 01 ngày Tác dụng phụ

Vitamin B1 Thiamine Không giới hạn

Không gây độc cấp khi

sử dụng qua đường uống Có một số bài báo đề cập đến hiện tượng anaphylaxis xảy

ra do tiêm trực tiếp thiamin liều cao vào thành mạch hoặc bắp Tuy nhiên, liều lượng này lớn hơn lượng cơ thể có thể hấp thụ cơ học qua đường uống (25)

Vitamin B3

(hay PP) Nicacin

35 mg/ngày từ thuốc bổ sung vtamin hoặc từ thực phẩm chức năng

Mẩn đỏ (nổi đỏ da, mẩn ngứa) Hấp thụ 3000 mg/ ngày nicotinamide và 1500 mg/ ngày gây buồn nôn, nôn mửa, có triệu trứng ngộ độc gan (26) Vitamin B5 Axit

Pantothenic Không giới hạn Không gây độc cấp

Vitamin B6 Pyridoxine

100 mg/ ngày từ thuốc bổ sung vtamin hoặc từ thực phẩm chức năng

Giác quan thần kinh, tổn thương da (12) Vitamin B7 Biotin Không giới hạn Không gây độc cấp

Vitamin B9 Axit folic 1 mg/ ngày

Thiếu hụt trường diễn vitamin B12, có thể dẫn đến tổn thương hệ thần kinh ở phụ nữ mang thai (27

Vitamin

B12

Cyanocoba- lamin Không giới hạn

Chưa có thông tin

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – một công cụ ứng dụng hữu hiệu để phân tích các thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm

1.3.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách - dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Hình 1.1 mô tả sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC như sau:

Hình 1.1: Sơ đồ Cấu tạo của hệ thống HPLC

Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích (solvent: dung môi pha động + mẫu phân tích; pump: hệ thống bơm)

- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ (HPLC Column: cột tách; injector autosampler: bơm mẫu tự động)

- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu (detector: phát hiện chất phân tích; data: bộ phận máy tính xử lý số liệu; waste: dung môi thải ra)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc

ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi -nhất là sắc ký lỏng pha liên kết

kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC)

• Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluen…Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực

• Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động là dung môi phân cực như nước, methanol, axetonitril…Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực [5]

1.3.3 Pha động trong HPLC [4]

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với tướng tĩnh

- Bền vững và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao

- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

- Không quá đắt

Một pha động phù hợp (về độ phân cực, về detector cũng như các tính chất cần thiết khác như: khả năng tạo phức là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi …)

sẽ góp phần tốt nhất có thể được vào qua trình tách

Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp:

+ pha động có độ phân cực cao, có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha đảo

+ pha động có độ phân cực thấp là các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải,nênngười ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích các hỗn hợp mẫu phức tạp Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thờ i gian, trường hợp này gọi là rửa giải gradient nồng độ

1.3.4 Các loại detector trong HPLC [37]

Detector là bộ phận quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp phân tích; tuỳ thuộc bản chất lý hoá của chất phân tích mà chúng ta đưa ra lựa chọn detector phù hợp:

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử vùng tử ngoại, khả kiến (UV VIS , - )detector photodiot-aray (PDA : áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ )ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

- Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp…

Ngày nay các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như: diot-aray, MS,

nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích Ngoài ra do kỹ thuật tin

học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích

1.3.5 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC

• Thời gian lưu

Khi được bơm vào cột sắc ký các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định, đó chính là thời gian lưu của chất phân tích tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại:

tRi = to + t’Ri

Trong đó: to là thời gian chết (thời gian chất phân tích nằm trong pha động)

t’Rilà thời gian lưu giữ thực của chất phân tích trên cột tách

• Số đĩa lí thuyết[35]

Hiệu lực của cột tách được đo bằng số đĩa lí thuyết N của cột

2

2 2

1/2

2 2

i

) (

2W

.54,5W

).(

16

A

tht

tt

Trong đó: tRi: thời gian lưu của chất phân tích i trên cột tách

to: thời gian không lưu giữ

Wi: chiều rộng đáy chân pic

W1/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic

h: chiều caopic

A: diện tích pic

khi giá trị N quá nhỏ thì các chất phân tích không được tách tốt hoặc quá trình tách xảy ra không hoàn toàn, ngược lại khi giá trị N quá lớn thì sẽ làm các pic của các chất sẽ cách nhau quá xa khiến việc rửa giải tốn nhiều dung môi Thực tế với các mẫu của HPLC thường N nằm trong khoảng từ 4000 ÷ 7500 là vừa đủ

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong

phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Ta cũng có thể đánh giá tính cân xứng theo công thức:

B: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng

cong phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic

- Điều kiện cần thiết để 2 chất A và B tách ra khỏi nhau là: α ≠ 1

α càng lớn hai chất tách khỏi nhau càng rõ ràng

- Khi α = 1 thì hai chất không có sự tách do lúc này chúng cùng nằm trong một pic

- Khi α ≈ 1 thì hai chất có pic chung một vùng, tức là pic bị chập nhau, cũng không thể tách ra thành hai pic riêng biệt đặc trưng

• Độ phân giải R [5]

Độ phân giải R nói lên mức độ tách ra khỏi nhau của hai chất A và B

B

A WW

)''.(

2+

−

= t RA tRBR

Ở đây: t’RA và t’RBlà thời gian lưu thực của các chất A và B

WA và WBlà chiều rộng đáy pic của A và B

Theo qui luật phân bố của Gaoxo và Rayley, điều kiện tối thiểu để cho 2 chất

A và B tách ra khỏi nhau thì cực tiểu của pic A nằm gần nhất vị trí cực đại của B, và

để tách hoàn toàn rõ ràng thì cực tiểu của pic phía sau B phải kề với cực tiểu phía sau pic A, tức là RAB = WA + WB

1.3.6 Phân tích định tính bằng HPLC [7]

Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một

hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau

và cố định Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu

Vì vậy sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ Sau đó, so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào

1.3.7 Phân tích định lượng bằng HPLC [7]

Trong HPLC có thể dùng một trong hai phương pháp là: phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng Việc dùng phương pháp nào trong hai phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích Phương trình đường chuẩn có dạng :

1.3.8 Phương pháp sắc ký lỏng hấp phụ pha ngược RP-HPLC [3]

Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ thường phân chia ra làm 2 loại theo cơ chế bản chất của pha tĩnh Hấp phụ pha thường (NP-HPLC) và hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) Sự phân chia này là do tính chất của pha tĩnh quyết định

Đối với hệ NP HPLC pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là các dung môi không phân cực và kém phân cực Ngược lại, trong hệ RP HPLC pha tĩ- nh kém phân cực, thông thường pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan và alkyl hóa bề mặt tạo thành các vật liệu nhồi kém phân cực Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực Do bản chất và hiệu quả tách của các quá trình trên nên ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng nhiều hơn

-1.3.9 Các phương pháp xác định các vitamin nhóm B trong thực phẩm

Trên thực tế, trong vòng 20 năm trở lại đây phương pháp HPLC đã được sử

dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong nước, trong các loại thực phẩm và

thực phẩm giàu dinh dưỡng Phương pháp HPLC sử dụng detector UV đã được sử

dụng thành công trong việc phân tích thiamin và riboflavin trong các mẫu ngũ cốc

và các sản phẩm ngũ cốc [19], thiamin, riboflavin, niacin trong gạo và sản phẩm

gạo [34] Trong đối tượng thực phẩm là thịt, thiamin và riboflavin được xác định

bằng việc sử dụng detector huỳnh quang [11] Các loại thực phẩm khác nhau rất

quan trọng đối với quá trình phân tích do bản chất và hàm lượng của các thành phần

khác nhau trong các đối tượng thực phẩm sẽ ảnh hưởng đến tính hiệu quả của

phương pháp tách Esva Barma và cộng sự đãthiết lập một phương pháp HPLC phù

hợp với detector UV sau một quá trình rửa cột để xác định thiamin và riboflavin

trong các mẫu thịt và gan, hay F.Arella và cộng sự đã dùng phương pháp sắc ký

lỏng pha ngược sử dụng detector huỳnh quang để xác định thiamin và riboflavin

trong thực phẩm

Năm 1979, Toma và Tabekhia [34], áp dụng phương pháp phân tích RP-LC

với sắc ký lỏng sử dụng cặp ion trong pha động và cột tách pha ngược, đã thu được

các kết quả tốt trong việc phân tích thiamine, riboflavin và niacin Kể từ đó, nhiều

phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP-LC) sử dụng cặp ion đã được triển khai

để xác định các vitamin tan trong nước, áp dụng cho nhiều đối tượng thực phẩm

khác nhau, như gạo [34], tách các hỗn hợp khoáng vitamin [16], sữa [14], trứng

[32] Tuy nhiên, phương pháp sắc ký cột tách pha ngược (RP-LC) với thuốc thử cặp

ion có nhược điểm do sự phức tạp của pha động dẫn đến thời gian ổn định cột lâu

hơn và tổng thời gian phân tích lên tới hơn 50 phút [28]

Ngoài ra, từ năm 1987 phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng cặp ion (RP-LC) cũng được xem là một phương pháp chính thức được áp dụng trong việc

xác định vitamin B1 và B2, trong đó bao gồm cả bước thực hiện dẫn xuất trước cột

cho thiamin thành thiochrome và sử dụng ánh sáng huỳnh quang để phát hiện,

phương pháp này được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực

phẩm tại Pháp Cùng với thời gian, người ta nhận thấy phương pháp này cho hệ số thu hồi thấp, đặc biệt trong xác định vitamin B1 trong thực phẩm có mặt socola Giải thích cho lý do này, người ta cho rằng cần phải hiệu chỉnh lại phương pháp bằng cách kiểm nghiệm trên phạm vi rộng các đối tượng thực phẩm khác nhau thông qua các nghiên cứu hợp tác giữa nhiều phòng thí nghiệm khác nhau [17]

1.4 Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong phân tích các vitamin tan trong nước nhóm B trong sữa

1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP-HPLC) sử dụng detector PDA

(Photo diode array) – -

Trong các nghiên cứu gần đây, kỹ thuật tách 9 vitamin nhóm B: thiamin - B1; Riboflavin B2; nicacin - - B3; pyridoxine B6; pyridoxal (PL); folic acid- -B9; cyanocobalamine-B12 đã được tối ưu hóa bằng việc sử dụng detector PDA (photo-diode - array) Kỹ thuật tách pha ngược không có cặp ion tạo thành kết hợp với một pha tĩnh amide mới với nhóm chức đi kèm của chất trimethylsilyl cũng đã được thực hiện Phương pháp này dựa trên việc kết hợp hai bước: loại bỏ axit và tách enzyme để giải phóng ra protein và xác định các vitamin bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC Phương pháp này đã rất thành công trong việc áp dụng xác định các vitamin nhóm B trong các sản phẩm thực phẩm cho trẻ em như sữa bột trẻ em, sản phẩm nguồn gốc đậu nành, ngũ cốc, các sản phẩm nguồn gốc từ hoa quả Quá trình tách sử dụng cột tách amide là một tiến bộ mới so với các phương pháp đã có do hình dáng của pic khá hẹp và tuổi thọ của cột thì dài hơn do áp dụng pha động đơn giản

Pilar và các cộng sự [29] đã thực hiện tách một số vitamin tan trong nước trong sữa bột trẻ em bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược Quá trình phân tích sử dụng dựa trên pha tĩnh amide mới, việc sử dụng này nhằm tránh phải sử dụng kỹ thuật tách cặp ion, giúp cho chân pic được thu hẹp lại và một pha động đơn giản Kỹ thuật phân tích sử dụng chế độ tách gradient với pha động ACN đệm photphat sử -dụng detector PDA (photo – diode- array) Kết quả cho thấy phương pháp cho độ

tuyến tính, độ chính xác, độ nhạy và hệ số thu hồi tin cậy Phương pháp này áp dụng thành công cho việc xác định các vitamin: thiamine, riboflavin, nicotinamide, pyridoxine, folic axit, cyanobalamine trong các thực phẩm trẻ em khác nhau như: sữa bột trẻ em, ngũ cốc và các sản phẩm hoa quả

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion sử dụng cột tách pha ngược RP-LC , detector UV

Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector UV Vis được ứng dụng nhiều hơn cả [16, 32, 34], mặc dù detector UV vốn đã có độ nhạy thấp hơn so với

-sử dụng detector huỳnh quang, tuy nhiên quá trình xử lý mẫu cho detector UV thì đơn giản hơn nhiều so với sử dụng detector huỳnh quang do khi sử dụng detector huỳnh quang cần phải thực hiện dẫn xuất cho các vitamin để thu được dẫn xuất ánh sáng huỳnh quang tương ứng [17, 21], ngoại trừ trường hợp của vitamin pyridoxine

và riboflavin, hai vitamin vốn có sẵn đáp ứng huỳnh quang tự nhiên Hơn nữa ưu điểm của việc xác định nhiều hợp chất trong chạy sắc ký đơn mang lại cho các nhà phân tích thực phẩm một sức hút khác đối với việc xác định các vitamin

Năm 1997, Soledad Albalá-Hurtado và cộng sự [31] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời 06 vitamin tan trong nước (nicotinamide, thiamin, riboflavin, pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine, cyanocobalamine và axit folic) trong mẫu sữa bột và sữa tươi Sử dụng phương pháp sắc ký cặp ion với cột tách pha ngược C18 Tổng thời gian phân tích cho các vitamin này là 55 phút; pha động methanol nước (15:85), 5 mM octanesulfonic axit -với 0,5 % triethylamine tại pH = 3; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV tại các bước sóng khác nhau Với các điều kiện sắc ký như trên đã cho kết quả tách có độ tin cậy cao về: độ tuyến tính, độ chính xác và độ nhạy của phương pháp Giới hạn phát hiện nằm trong khoảng từ 0 02 đến 0 1 mg/l Giới hạn định lượng nằm trong , ,khoảng từ 0 03 đến 0, ,25 mg/l

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang

Phương pháp này chủ yếu dùng để tách các ion có sẵn ánh sáng tự nhiên huỳnh quang do đa số các vitamin không có ánh sáng huỳnh quãng nên muốn thực hiện tách các vitamin này thì cần thực hiện dẫn xuất trước cột cho các vitamin này

Nhiều bài báo đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang để xác định hàm lượng của vitamin B6 và vitamin B2 là hai vitamin

có ánh sáng huỳnh quang tự nhiên

Theo M Bergaentzlé và cộng sự [23], quá trình tách vitamin B6 trong các mẫu sữa bột, bột dinh dưỡng trẻ em, ngũ cốc… được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cặp ion/detector huỳnh quang; pha động sử dụng kali hidro photphat có chứa sodium octane sulfonat/acetone nitrile, detector huỳnh quang được sử dụng ở bước sóng kích thích là 290 nm và ở bước sóng phát xạ là 395 nm Kết quả phân tích cho thấy: độ lặp lại của phương pháp nằm trong khoảng từ 3 – 18 % và phụ thuộc vào nồng độ của vitamin trong các mẫu khác nhau

Theo F Arella và cộng sự [17], quá trình tách vitamin B1 và B2 trong các mẫu sữa bột, ngũ cốc, sữa chua, bột dinh dưỡng trẻ em…được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược/detector huỳnh quang; pha động methanol 0.05M/natri axetat (30: 70, v/v); tốc độ dòng 1 ml/phút; detector huỳnh quang được sử dụng ở bước sóng kích thích là 366nm và ở bước sóng phát xạ là 435 nm cho vitamin B1 và

422 – 522 nm cho vitamin B2 Kết quả phân tích cho thấy: hệ số thu hồi của phương pháp luôn đạt trên 89%

1.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA với chế độ chạy

rửa giải gradient

Các vitamin hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại, sau khi qua cột tách các vitamin được phát hiện bởi detector PDA Dựa trên việc đo độ hấp thụ tỉ lệ với nồng

độ là cơ sở cho sự định lượng các vitamin

Theo Alberto Zafra-Gomez và cộng sự [8] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời 08 vitamin tan trong nước trong

các mẫu sữa bột và sữa tươi Các vitamin này là các vitamin thường có mặt trong nhiều loại thực phẩm bổ sung (sữa bột trẻ em, sữa trẻ em, sữa giàu vitamin) Các vitamin bao gồm: thiamin, riboflavin, pantothenic axit, pyridoxin, folic axit, cyanocobalamin và axit ascobic Quá trình tách các vitamin sử dụng hệ thống HPLC 2695 Alliance (Waters, Milford, MA), detector PDA 2996 , cột tách C18 Waters Spherisorb ODS-2 (25 cm 4.6 mm, 3 × µm); nhiệt độ cột 400C, tốc độ dòng 1ml/phút Quá trình chạy pha động sử dụng hai kênh A và B với đệm photphat và dung môi ethanol Quá trình chạy gradient tổng cộng là 30 phút với tỉ lệ thành phần hai kênh được đặt thay đổi theo thời gian: 94/6 sau 4 phút; 70/30 sau 12 phút; 60/40 sau 17 phút và quay trở lại điều kiện ban đầu sau 22 phút và giữ trong 8 phút để đưa điều kiện cột về trạng thái ban đầu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển một phương pháp phân tích nhanh và có

độ tin cậy cao để xác định đồng thời 06 vitamin tan trong nước nhóm B trong các sản phẩm sữa bột trẻ em Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược RPLC với detector PDA cho phép xác định trong phạm vi rộng với các vitamin tan trong nước tại các bước sóng hấp thụ tối đa: thiamin (Vitamin B1), riboflavin (Vitamin B2), niacin (Vitamin B3), Pyridoxin (Vitamin B6), Folic Axit (Vitamin B9) và Cyanocobalamine (Vitamin B12)

1.4.5 Các phương pháp xử lý mẫu

Hiện có rất nhiều phương pháp được ứng dụng để xử lý mẫu trong quá trình tách chiết các vitamin nhóm B Tuy nhiên, việc tìm ra được một phương pháp hiệu quả, nhanh, tiết kiệm thời gian và cho hệ số thu hồi cao hiện vẫn đang là vấn đề đối với các nhà nghiên cứu Các phương pháp tách chiết vitamin nhóm B trong các đối tượng thực phẩm nói chung và trong các mẫu sữa nói riêng đều có điểm chung là:

xử lý mẫu trong bóng tối do các vitamin dễ bị thủy phân bởi ánh sáng, đều được chiết bằng các axit, và môi trường dịch chiết đều được đưa về pH từ 3,5 đến 4,5 Bên cạnh đó, một số quy trình xử lý mẫu sử dụng enzym thủy phân được sử dụng

để làm tăng hệ số thu hồi và giảm nguy cơ mất mẫu Pilar Vinas và các cộng sự [17]

đã áp dụng phương pháp xử lý mẫu bằng axit chlohydric và enzyme thủy phân sử

dụng axit chlohydric và enzyme thủy phân taka-diastase cùng với phương pháp phân tích [10], còn theo F Arella và cộng sự [17] thì quá trình xử lý mẫu cũng áp dụng phương pháp này, nhưng enzyme thủy phân được thay bằng β-amylase và takadiastase Tuy nhiên việc sử dụng enzyme thủy phân có nhược điểm: chi phí đắt

và thời gian xử lý mẫu lâu Theo Alberto Zafra-Gómez và các cộng sự [8] phương

trình xử lý mẫu để chiết các vitamin nhóm B trong thực phẩm

Ngoài ra, theo M Bergaentzlé và cộng sự [23] và Soledad Albalá-Hurtado

và cộng sự [31] thì phương pháp xử lý mẫu để chiết các vitamin sử dụng axit

glycoxilic hoặc axit Trichloroacetic (TCA) không sử dụng enzyme thủy phân cũng

được ứng dụng trong phân tích các vitamin trong các đối tượng thực phẩm khác nhau Theo Soledad Albalá-Hurtado và cộng sự [31] quá trình xử lý mẫu như sau:

- Đối với mẫu sữa dạng lỏng: cân chính xác 10.5 g mẫu vào ống tuýp li tâm

50 ml (đường kính 30 mm), thêm vào 1 g TCA rắn và cho 1 thanh khuấy từ vào Hốn hợp mẫu được rung trong 10 phút trên máy khuấy từ, sau đó li tâm trong 10 phút ở 1250 vòng để tách giữa pha rắn và pha lỏng Sau đó thêm 3 ml TCA 4% vào phần chất rắn sau khi đã tách lấy lớp chất lỏng, trộn đều và lắc trong 10 phút, sau đó

li tâm trong 10 phút và dịch lọc ở hai lần chiết được gộp lại và định mức đến 10 ml bằng TCA 4%

- Đối với mẫu sữa dạng bột: cân chính xác 8 g mẫu vào ống tuýp li tâm 50

ml (đường kính 30 mm) và thêm 10 ml nước cất, tiếp đó thêm vào 1 g TCA rắn và cho 1 thanh khuấy từ vào Hốn hợp mẫu được rung trong 10 phút trên máy khuấy

từ, sau đó li tâm trong 10 phút ở 1250 vòng để tách giữa pha rắn và pha lỏng Sau

đó thêm 3 ml TCA 4% vào phần chất rắn sau khi đã tách lấy lớp chất lỏng, trộn đều

và lắc trong 10 phút, sau đó li tâm trong 10 phút và dịch lọc ở hai lần chiết được gộp lại và định mức đến 10 ml bằng TCA 4%

Quá trình tách chiết các vitamin trên các đối tượng mẫu sữa thông thường đòi hỏi sử dụng các axit có khả năng tách cao hoặc được thủy phân bằng enzyme, trong nghiên cứu này chúng tôi dựa trên quy trình chiết của Soledad Albalá-Hurtado và

cộng sự (31), với một số yếu tố thay đổi phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thí

nghiệm để có thể tách được đồng thời 06 vitamin trong các mẫu sữa bột trẻ em Thông qua quá trình phân tích để đánh giá hiệu suất thu hồi, và được thực hiện chiết các vitamin bằng axit tricloaxetic (TCA) mà không qua giai đoạn xử lý thủy phân bằng enzyme