3.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1. Tối ưu hoá các điều kiện xác định các Vitamin nhóm B bằng HPLC
3.1.1.5. Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động
Trong các phương pháp phân tích HPLC, việc lựa chọn thành phần pha động rất quan trọng, vì thành phần pha động cũng ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký. Thành phần pha động khác nhau thì độ phân cực cũng khác nhau. Chúng tôi đưa ra hai phương pháp khảo sát thành phần pha động:
- Tăng dần tỉ lệ acetonitril (ACN) trong thành phần pha động cho đến khi các vitamin nhóm B ra sớm nhất
- Sử dụng phương pháp chạy tách rửa gradient để tối ưu điều kiện rửa giải các vitamin nhóm B.
- Khảo sát chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) theo tỷ lệ tăng dần ACN trong thành phần pha động
Trong sắc ký lỏng HPLC, chế độ chạy điều kiện isocratic thư ng đườ ợc sử dụng, nhờ đó thành phần pha đ ng đư c duy trì không độ ợ ổi. Toàn bộ ệ h thống và cột tách được cân bằng trong suốt thời gian chạy và không bị ảnh hưởng bởi các thay đổi nhanh c a hóa chủ ất. Tuy nhiên, các đòi hỏi nghiêm ng t cặ ủa phương pháp phân tích HPLC ngày càng tăng và các mẫu phân tích thì có thành phần ngày càng phức tạp, các hệthống phân tích HPLC được cải tiến vào trong các hệ máy có độtin cậy và bền, và các cột tách được chế ạ t o để thực hiện đư c hàng nghìn lư t bơm mợ ợ ẫu [33].
Cố định các điều kiện chạy sắc ký của hệ HPLC:
• Cột Symestry Water C18 (150mm ì 5mm ì 4,6àm)
• Tốc độ dòng: 1ml/phút
• Pha động: kênh A : Đệm photphat KH2PO4 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat ; kênh B : ACN
• Nhiệt độ cột: 40oC
• Detector: PDA đặt ở các bước sóng định lượng như đã khảo sát ở trên
• Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn các vitamin nhóm B
Khi thay đổi tỷ lệ thể tích các thành phần pha động khác nhau, sắc đồ khi phân tích hỗn hợp 6 vitamin với tỷ lệ đệm photphat: ACN= 90:10 thu được ở hình 3.2 (sắc đồ của các tỷ lệ khác được ghi trong phụ lục) và kết quả thời gian lưu các vitamin thu được như ở bảng 3.2:
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Minutes17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0
mAU
0 100 200 300 400 500
mAU
0 100 200 300 400 500
(PP)
(B9) (B6) (B12) (B2) (B1)
PDA-246nm B Na me Retention Time Area Height
Hình 3.2: Sắc ký đồ chạy chuẩn hỗn hợp 6 vitamin tại thành phần pha động : đệm photphat (pH = 3) : ACN = 90 : 10
Bảng 3.2: Thời gian lưu của các vitamin ở các thành phần pha động khác nhau
Vitamin Thành phần pha động
Thời gian lưu
(ph út) 95%A : 5%B 90%A : 10%B 80%A : 20% B
Thiamine
(Vitamin B1) ND 32,0 3,3
Riboflavine
(Vitamin B2) ND 10,15 ND
Nicotinamide
(Vitamin B3) 5, 0 1,6 2,0
Pyridoxamine
(Vitamin B6) 20 3 , 3,0 1,5
Axit folic
(Vitamin B9) 6,2 2,42 2,1
Cyanocobalamine
(Vitamin B12) ND 6,8 ND
Ghi chú: ND: Dưới giới hạn phát hiện của phương pháp
Các thí nghiệm khảo sát việc áp dụng điều kiện isocratic cho pha động cho thấy các vitamin B là các chất tan tốt trong nước nên khi tăng tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ
của chất phân tích trên cột tăng dẫn đến các vitamin được tách ra muộn gây doãng chân pic và làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích. Ở khảo sát trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy với tỷ lệ A: B = 90:10 thì các chất được tách ra hoàn toàn nhưng các pic thường bị doãng chân pic và thời gian lưu tổng cộng để tách hoàn toàn các vitamin là 32 phút. Bên cạnh đó khi giảm tỉ lệ ACN thì tuy thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột giảm, các vitamin được tách ra sớm, chiều cao pic tăng nhưng không tách được hoàn toàn các vitamin, dễ lẫn với pic của nền mẫu, cụ thể với tỉ lệ A : B = 95 : 5 thì có 3 vitamin không tách ra được là B1, B2 và B12;
với tỷ lệ A : B = 80 : 20 thì chỉ tách được 4/6 vitamin (không tách được vitamin B12 và B2).
Như vậy việc áp dụng phương pháp chạy chế độ isocratic để tách và định lượng 06 vitamin không phải là phương pháp thuận lợi và cho độ tin cậy cao, do đó chúng tôi chuyển sang khảo sát chế độ gradient.
- Khảo sát phương pháp chạy chế độ gradient để tối ưu điều kiện rửa giải các vitamin nhóm B
Kết quả thực nghiệm ở trên cũng như các công trình nghiên cứu cho thấy khi quá trình tách sắc ký chưa xác định được, chúng ta thường sử dụng phương pháp tách đơn giản rửa giải gradient để biết rõ các đặc tính kỵ nước của hợp chất chưa biết [9]. Vì vậy, trong những năm g n đây đa sầ ố các ch ch y sắc ký đã đượế độ ạ c d a ự trên chế độ chạy thành phần gradient trong pha động.
Trong chương trình chạy gradient, nồng độ ủ c a dung môi đư c tăng dợ ần theo thời gian chạy sắc ký. Trong s c ký lắ ỏng pha ngược thành ph n cầ ủa pha động t i ạ thời điểm bắt đầu chạy thì tỉ ệ l nước chiếm ưu thế và thành phần phần trăm của dung môi hữu cơ bổ sung (như methanol hay acetonitril) đư c tăng dợ ần theo th i ờ gian, theo cách này nồng độ dung môi tách tăng dần. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hệ dung môi pha động như ở bảng 3.3, các điều kiện khác giữ nguyên không đổi.
Bảng 3.3: Thành phần pha động
Thành phần
Kênh A Kênh B
Đệm photphat 0.01M (pH 3)
+ 5 mM natri heptan sulfonat ACN
Cố định các điều kiện chạy sắc ký của hệ HPLC:
• Cột Symestry Water C18 (150mm ì 5mm ì 4,6àm)
• Tốc độ dòng: 1ml/phút
• Pha động: - kênh A :Đệm photphat KH2PO4 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat ; kênh B : ACN
• Nhiệt độ cột: 40oC
• Detector: PDA đặt ở các bước sóng định lượng như đãkhảo sát ở trên
• Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn các vitamin nhóm B
Thành phần % kênh vàA % kênh B trong quá trình tách gradient theo thời gian tách được thể hiện trong bảng 3.4 dưới đây:
Bảng 3.4: Chương trình rửa giải gradient của pha động
Thời gian (phút) % A % B
0, 01 100 0
1 95 5
3 95 5
15 80 20
20 80 20
22 100 0
25 100 0
Trong bảng trên thành phần của pha động thay đổi như sau:
• Thời đi m ban để ầu là 100% kênh A
• Tiếp đó b t đ u thay đắ ầ ổi thành ph n liên tầ ục trong 1 phút để đạ ế ỉt đ n t l ệthành phần là 95:5 (đệm photphat/ natri heptan sulfonat:ACN)
• Giữ thành phần pha đ ng này không đ i trong 3 phút độ ổ ể ử r a ra ngoài toàn bộ các thành phần tách r a mử ạnh nhất
• Tiếp đó b t đ u thay đắ ầ ổi thành phần đ u đ n trong 12 phút đề ặ ể đạ ết đ n t l ỉ ệ thành phần là 80:20 (đệm photphat/ natri heptan sulfonat: ACN), đây là thành phần tách r a gi i m nh nhử ả ạ ất trong phương pháp này.
• Giữ thành phần pha đ ng này không độ ổi trong 5,5 phút để ử r a ra ngoài toàn bộ các thành ph n tách r a mầ ử ạnh nhất
• T t ừ ừ (thường là 5 phút và đôi khi là ngắn hơn, trong trường h p này ợ là 3 phút) đ đưa trể ở ề v các điều kiện ban đầu.
• T – ừ23 25 phút chuyển về100% kênh A, giữ ở các điều kiện ban đầu trong suốt một kho ng thả ời gian này mà trong đó ít nhất 5 th tích cể ủa cột sẽ chuyển dịch qua cộ đểt thiết lập lại trạng thái cân bằng và đạt được m c s n sàng cho lứ ẵ ần bơm tiếp theo [33].
Các thí nghiệm chúng tôi đã thực hiện đã chứng minh rằng 100% các vitamin nhóm B được tách rửa hoàn toàn với việc sử dụng cột tách pha ngược Symestry Water C18 và dung môi pha động acetonitrile.
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU 050100 mAU
0 50 100
PP 9.973937350 B9 14.944460436 B6 15.883212326 B12 16.437 459296 B2 16.885 1266783 B1 20.1491353348
4: 246 nm, 8 nm B mix B 04.dat
NameRetention Time Area
Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 06 vitamin theo chương trình chạy gradient
Kết quả khảo sát sắc đồ hỗn hợp 6 vitamin nhóm B theo thành phần pha động trong phương pháp rửa giải gradient (hình 3.3) cho thấy quá trình tách giữa các vitamin khá tốt, các vitamin tách lần lượt trong khoảng thời gian lưu từ 10 đến 20 phút, các pic có độ đối xứng tốt và không xảy ra hiện tượng doãng chân pic.
- Lựa chọn chương trình chạy cho pha động Qua các thí nghiệm khảo sát chúng tôi nhận thấy:
- Khi thực hiện chương trình chạy cho pha động bằng cách chạy điều kiện isocratic theo đó thay đổi tỉ lệ ACN trong thành phần pha động cho đến khi các vitamin nhóm B ra sớm nhất thì do các vitamin là các chất tan tốt trong nước hay nói cách khác là những chất hữu cơ phân cực mạnh nên khi tăng tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ của chất phân tích trên cột tăng dẫn đến các vitamin được tách ra muộn gây doãng chân pic và làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích. Ở khảo sát trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy với tỷ lệ A: B = 90 : 10 thì các chất được tách ra hoàn toàn nhưng các pic thường bị doãng chân pic và thời gian lưu tổng cộng để tách hoàn toàn các vitamin là 32 phút. Bên cạnh đó khi giảm tỉ lệ ACN thì tuy thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột giảm, các vitamin được tách ra sớm, chiều cao pic tăng nhưng không tách được hoàn toàn các vitamin, cụ thể với tỉ lệ A : B = 95 : 5 thì chỉ tách được 3/6 vitamin; với tỷ lệ A : B = 80 : 20 thì chỉ tách được 4/6 vitamin.
- Khi thực hiện chạy chế độ gradient để tối ưu điều kiện rửa giải ra các vitamin nhóm B chúng tôi nhận thấy các vitamin được tách ra hoàn toàn với thời gian lưu tổng cộng là khoảng 20 phút, các pic có độ đối xứng tốt và không xảy ra hiện tượng doãng chân pic.Từ các thực nghiệm trên chúng tôi quyết định chọn chạy chế độ gradient để tối ưu điều kiện rửa giải ra các vitamin nhóm B và giữ không đổi trong các lần khảo sát sau.
- Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chạy sắc ký HPLC vì nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha
động. Khi tốc độ pha động nhỏ chất phân tích ra muộn gây doãng chân pic, giảm độ nhạy và tốn dung môi. Ngược lại, khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu chưa kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng pic và gây áp suất lớn trong bơm [9].
Qua các thí nghiệm thực tế, các nhà nghiên cứu đã đưa ra một số tốc độ dòng tối ưu để đối chứng và tham khảo theo đó việc lựa chọn các tốc độ dòng khác nhau phụ thuộc vào kích thước đường kính của cột tách. Ngoài ra chúng ta cũng có thể sử dụng công thức tính toán theo tài liệu [9] để đạt được tốc độ dòng phù hợp với cột tách chúng ta sử dụng. Theo Andrew Guzzetta[9], bảng 3.5 dưới đây là một số tốc độ dòng được lựa chọn cho từng loại cột tách tương ứng:
Bảng 3.5: Các loại tốc độ dòng được lựa chọn tương ứng cho từng loại cột tách
Đường kính trong của cột tách (mm)
Tốc độ dòng chuẩn (ml/phút)
4,6 1
2,1 0,2
1,0 0, 05
0, 30 0,004
0, 15 0,001
Chúng tôi tiến hành khảo sát dòng pha động ở các tốc độ: 0,8 ; 0,9 ; 1 và 1,2 ml/phút và cố định các điều kiện tách sắc ký như đã khảo sát ở trên gồm có:
Cố định các điều kiện chạy sắc ký của hệ HPLC:
• Cột Symestry Water C18 (150mm ì 5mm ì 4,6àm)
• Pha động: - kênh A :Đệm photphat KH2PO4 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat ; kênh B : ACN
• Nhiệt độ cột: 40oC
• Detector: PDA đặt ở các bước sóng định lượng như đã khảo sát ở trên
• Chế độ chạy sắc ký pha động là chế độ rửa giải gradient
• Mẫu phân tích: dung dịch chuẩncác vitamin nhóm B
Kết quả khảo sát tốc độ dòng cho thấy:
• Về ảnh hưởng của tốc độ dòng đến chu kỳ thời gian tách
- Khi tăng tốc độ dòng thì thời gian tách của quá trình gradient giảm
- Chu kỳ thời gian tách các chất giảm sẽ làm tăng khả năng bơm các mẫu vào cột trong khoảng thời gian xác định.
• Về ảnh hưởng của tốc độ dòng đến khả năng tách
- Quá trình tách đạt được tối ưu khi có sự kết hợp của chế độ chạy gradient và thời gian tách giảm hợp lý.
- Quá trình tách đạt được tối ưu khi tốc độ dòng được lựa chọn nằm dao động trong khoảng từ 1 - 2 ml/phút
Khi tốc độ dòng tăng áp suất lớn đẩy chất phân tích ra sớm dần, diện tích pic và chiều cao pic giảm dần. Thực tế cho thấy với tốc độ dòng là 0.8; 0.9 và 1.0 ml/phút, các vitamin được tách ra hoàn toàn, tuy nhiên ở tốc độ dòng 0.8 ml/phút thì các pic có độ cân xứng không tốt, có hiện tượng doãng chân pic ở một số vitamin.
Tại tốc độ dòng 1.0 ml/phút thì các pic có độ cân xứng tốt và không xảy ra hiện tượng doãng chân pic. Điều này cũng phù hợp với lí thuyết [1] rằng: tại tốc độ 1ml/phút độ cân xứng của pic là tốt, các trường hợp còn lại pic có độ cân xứng kém.
Dựa trên các khảo sát nói trên, chúng tôi quyết định chọn tốc độ dòng 1 ml/phút cho các quá trình sắc ký. Kết quả khảo sát tốc độ dòng được thể hiện chi tiết trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tốc độ dòng
Vitamin Tốc độ dòng
(ml/phút)
Diện tích pic (mAU)
Thời gian lưu (phút) Thiamin – B1
0,8
1709108 21,69
Riboflavin – B2 1505645 18
Nicotinamid – B3 1162201 11,5
Pyridoxamine – B6 230839 17
Axitfolic – B9 467568 15,5
Cyanocobalamine – B12 506134 17,3
Thiamin – B1
0,9
1499870 20,4
Riboflavin – B2 1225447 16,8
Nicotinamid – B3 1068062 10,8
Pyridoxamine – B6 208958 15,7
Axit folic – B9 526161 14,8
Cyanocobalamine – B12 555487 16,4
Thiamin – B1
1,0
1353348 20,1
Riboflavin – B2 1266783 16,8
Nicotinamid – B3 937350 9,9
Pyridoxamine – B6 212326 15,8
Axit folic – B9 460436 14,9
Cyanocobalamine – B12 459296 16,4
Thiamin – B1
1,2
1157309 17,99
Riboflavin – B2 ND ND
Nicotinamid – B3 804538 8,41
Pyridoxamine – B6 195014 13,1
Axit folic – B9 209891 13,1
Cyanocobalamine – B12 ND ND
Ghi chú: ND – Dưới giới hạn phát hiện của phương pháp