3.3. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế
3.3.2. Kết quả phân tích thực tế
Phương pháp phân tích sau khi đã chuẩn hóa được ứng dụng để phân tích 06 vitamin tan trong nước nhóm B trong các mẫu sữa bột trẻ em khác nhau. Chương trình chạy sắc ký được thực hiện sau khi bơm các mẫu của các sản phẩm khác nhau và pic của các chất được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của các chất chuẩn và các mẫu thực có thêm các chất chuẩn theo các điều kiện đã được xác định. Sử dụng detector PDA để quét phổ UV Vis trong khi chất - tan chuyển qua flow cell và đo tỉ lệ hấp thụ tại bước sóng 246 nm. Khi có kết quả - phổ hấp thụ từ các pic khác nhau thu được đối với các chất chuẩn thì kết quả sắc đồ phổ của các mẫu phân tích sữa bột DL/GOLD step 2 - M8 và mẫu sữa liên phòng DDP-1 được so sánh đối chứng với các mẫu chất chuẩn. Kết quả cho thấy các kết quả phân tích cho kết quả rất tin cậy và có sự đồng nhất cao về độ tinh khiết giữa các mẫu.
Bên cạnh đó, một trong các điều kiện được sử dụng để đánh giá độ nhiễu của chất nền hay độ nhiễu của nền mẫu là dựa trên sự cân đối của pic giữa phổ tại đỉnh của p c và phổ tại mỗi điểm trên pic. Ni ếu có bất kỳ phần nào trên đường cong phổ mà trên đó đường cong lệch về phía âm thì sự không tinh khiết của mẫu được xem như tồn tại tại ở phần này của đường cong phổ. Đường cong pic tương ứng với sự có mặt của các vitamin trong các mẫu sữa bột trẻ em chỉ ra rằng không có sự nhiễm bẩn được rửa giải ra cùng với các pic của các vitamin cần phân tích. Các giá trị trung bình (trung bình ± SD) về chỉ số độ tinh khiết của pic tính tại 03 điểm trên đường cong phổ chỉ ra rằng độ tinh khiết của pic là thỏa mãn theo bảng 3.22 dưới đây:
Bảng 3.22: Giá trị chỉ số độ tinh khiết của pic tính tại 03 điểm trên đường cong phổ trên 03 mẫu khác nhau
Tên mẫu Vitamin Số lần
lặp N
Chỉ số độ tinh khiết của pic (Giá trị trung bình ±SD)
Sữa bột DL/GOLD step 2
- M8 + thêm chuẩn
Thiamin 6 0,982 ± 004 0,
Riboflavin 6 0,997 ± 05 0,
Niacin 6 0,997 ± 01 0,
Pyridoxine 6 0,900 ± 06 0,
Axit folic 6 0,995 ± 005 0,
Cyanocobalamine 6 0,996 ± 002 0,
Sữa bột DL/GOLD step 2
- M8
Thiamin 6 0,945 ±0,0 05
Riboflavin 6 0,995 ±0,033
Niacin 6 0,994 ±0,013
Pyridoxine 6 0,996 0,05 ±
Axit folic 6 0,964 ±0,007
Cyanocobalamine 6 ND
Sữa bột DDP-1
Thiamin 6 0,935 ±0,003
Riboflavin 6 0,90 ±0,021
Niacin 6 0,993 ±0,024
Pyridoxine 6 0,995 0,03 ±
Axit folic 6 0,98 ±0,004
Cyanocobalamine 6 ND
Ghi chú: ND - Dưới giới hạn phát hiện của phương pháp
Sau khi xác định được hàm lượng các vitamin và kết quả khẳng định không có ảnh hưởng của nền mẫu, chúng tôi tiến hành phân tích 20 mẫu sữa bột trẻ em khác nhau, mỗi mẫu làm lặp lại 6 lần và lấy kết quả trung bình. Bảng 18 chỉ ra các kết quả thu được trên các mẫu sữa, chúng tôi thực hiện nghiên cứu thống kê xử lý số
liệu thực nghiệm để tìm khoảng tin cậy của giá trị thực dựa trên các kết quả này. Từ dãy số kết quả thực nghiệm cho từng loại vitamin trên các mẫu khác nhau, chúng tôi
tìm được các giá trị trung bình (xtb) và độ lệch chuẩn S. Như vậy, với độ tin cậy P = 0,95, tra bảng ta có t (P,f) và xác định được giá trị cần tìm nằm trong khoảng
N t S
x ±
) =
(à [6].Trong nghiờn cứu này chỳng tụi chọn cỏc giỏ trị: P = 0,95; N = 6; t = 2,447; các giá trị xtb và S theo các giá thị thực nghiệm chúng tôi xác định được. Như vậy, với độ tin cậy 95% thì các giá trị trung bình xác định được của cỏc vitamin đều nằm trong khoảng tin cậy của giỏ trị thực . Cỏc kết quả phõn tớch à trên các mẫu sữa bột thể hiện trong bảng 3.23 cho thấy hàm lượng các vitamin đều xác định được với độ chính xác cao, hàm lượng cyanocobalamin không xác định được do có hàm lượng thấp hơn dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp.
Bảng 3.2 : 3 Kết quả xác đinh hàm lượng các vitamin trong các mẫu sữa bột trẻ em
Loại mấu Thiamin Ribof-
lavin Niacin Pyridoxin Axit folic
Cyanoco- balamin Sữa bột DL
Gold Step 1 – M7
(mg/100g)
0,63 ± 0,02
0,36 ± 0,009
2,41 ± 0,09
0,23 ± 0,004
0,19 ±
0,003 ND
Sữa bột DL GOLD step 2 – M8 (mg/100g)
0,84 ± 0,03
0,96 ± 0,03
0,47 ± 0,01
0,38 ± 0,01
0,27 ±
0,01 ND
Dielac alpha1-2-3- Vinamilk
(mg/100g)
87,9 ± 0,002
0,9 ± 0,024
3,4 ± 0,05
0,36 ± 0,07
0,018
± 0,01 ND Sữa bột 0409444-2
(mg/100g) 0,86 ±
0,01 0,33 ±
0,02 0,91 ±
0,04 3,3 0,± 05 ND ND Sữa bột 0409452-1
(mg/100g) 0,6 0,± 04 0,76 ± 0,01
0,15 ± 0,03
0,07 ±
0,04 ND ND
Sữa bột 0409452-2 (mg/100g)
0,82 ± 0,04
0,83 ± 0,01
0,3 ± 0,03
0,12 ± 0,04
0,32 ±
0,05 ND
Sữa bột 0409358-2 (mg/100g)
0,21 ± 0,001
1,21 ± 0,031
1,6 ± 0,02
0,61 ± 0,03
0,17 ±
0,03 ND
Dutch Lady 123
0709939-1 (mg/100g)
0,92 ± 0,18
1,06 ± 0,05
3,5 ± 0,01
0,54 ± 0,041
0,36 ±
0,004 ND
Friso 3 gold
0709939 2 (mg/100g)-
0,61 ± 0,04
6,0 ± 0,022
3,7 ± 0,03
0,16 ± 0,023
0,17 ±
0,001 ND
Lactogen 3 – Nestle 0709939 3 (mg/100g)-
1,05 ± 0,03
1,24 ± 0,054
4,05 ± 0,021
0,3 ± 0,013
0,21 ±
0,002 ND
Dumex Dugro Gold 0709939 4 - (mg/100g)
0,97 ± 0,01
15,5 ± 0,021
3,2 ± 0,01
0,12 ± 0,026
0,12 ±
0,04 ND
Abbott Gain Plus
0709939 5 (mg/100g)-
0,95 ± 0,05
1,55 ± 0,033
5,01 ± 0,041
0,63 ± 0,014
0,02 ±
0,021 ND
Dutch Lady Gold 123 0709939 6 (mg/100g)-
0,84 ± 0,02
0,63 ± 0,024
3,2 ± 0,024
0,42 ± 0,052
0,07 ±
0,017 ND
Dielac alpha1-2-3- Vinamilk
0709939-7 (mg/100g)
0,17 ± 0,03
0,72 ± 0,014
3,4 ± 0,014
0,1 ± 0,017
0,12 ±
0,031 ND
Enfagrow A+
0709939 8 (mg/100g)-
0,51 ± 0,09
6,67 ± 0,003
2,1 ± 0,04
0,22 ± 0,024
0,06 ±
0,023 ND
NAN Pro
0709939 9 (mg/100g)-
1,09 ± 0,05
1,15 ± 0,014
9,4 ± 0,023
0,74 ± 0,031
0,08 ±
0,016 ND
Sữa bột nguyên kem 07*09933 (mg/100g)
0,23 ± 0,04
2,11 ± 0,004
6,3 ± 0,061
0,02 ± 0,052
0,05 ±
0,02 ND
Sữa bột
DDP-1/08 (mg/100g)
0,62 ± 0,008
1,38 ± 0,005
11,63 ± 0,011
0,78 ± 0,04
0,14 ±
0,006 ND
Sữa bột
DDP-2/08 (mg/100g)
1,08 ± 0,029
1,44 ± 0,023
19,61 ± 0,024
1,39 ± 0,05
0,23 ±
0,04 ND
Sữa bột
DDP-3/07 (mg/100g) 0,35 ±
0,02 0,97 ±
0,002 4,68 ±
0,01 0,41 ±
0,03 0,06 ±
0,002 ND
Sữa bột
DDP-4/07 (mg/100g)
0,97 ± 0,018
1,39 ± 0,01
18,84 ± 0,05
1,34 ± 0,11
0,18 ±
0,002 ND
Ghi chú: aGiá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 6 ND - Dưới giới hạn phát hiện của phương pháp
Sau khi xác định hàm lượng các vitamin trong các mẫu thực tế chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích hồi quy so sánh để so sánh hàm lượng các chất xác định được do phương phỏp phõn tớch với hàm lượng trờn nhón sản phẩm (à) của 09 mẫu sữa (bảng 3.24), từ đó đánh giá chất lượng của các mẫu sữa trên thị trường.
Bảng 3.24: So sánh kết quả xác đinh hàm lượng các vitamin với các giá trị trên nhãn trong 09 mẫu sữa bột trẻ em
Riboflavin Pyridoxin
Thiamin Niacin Axit
folic
Cyanoco- balamin Sữa bột DL
– Gold Step 1 M7 (mg/100g)
Giá trị
Trên nhãn 0,34 0,7 5,9 0,3 0,08 0,0012
Hàm lượng
xác định được 0,63 0,36 2,41 0,23 0,19 ND
Dutch Lady 123
0709939-1 (mg/100g)
Giá trị
Trên nhãn 0,53 0,87 7,4 0,74 0,06 0,0013
Hàm lượng
xác định được 0,92 1,06 3,5 0,54 0,36 ND
Friso 3 gold 0709939-2 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 0,51 0,66 6,1 0,51 0,08 0,0009
Hàm lượng
xác định được 0,61 6,0 3,7 0,16 0,17 ND
Lactogen3 – Nestle 0709939-3 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 0,95 1,24 6,57 0,74 0,14 0,001
Hàm lượng
xác định được 1,05 1,24 4,05 0,3 0,21 ND
Abbott Gain Plus
0709939-5 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 0,65 0,74 8,38 0,94 0,09 0,002
Hàm lượng
xác định được 0,95 1,55 5,01 0,63 0,02 ND
Dutch Lady Gold 123 0709939-6 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 0,53 0,87 7,4 0,74 0,05 0,0013
Hàm lượng
xác định được 0,84 0,63 3,2 0,42 0,07 ND
Dielac alpha 1-2-3- Vinamilk 0709939-7 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 0,45 1,4 7,0 0,7 0,7 0,001
Hàm lượng
xác định được 0,17 0,72 3,4 0,1 0,12 ND
Enfagrow A+
0709939-8 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 0,4 0,56 4,5 0,3 0,08 0,002
Hàm lượng
xác định được 0,51 6,67 2,1 0,22 0,06 ND
NAN Pro 0709939-9 (mg/100g)
Giá trị
trên nhãn 1,.0 1,.3 17,0 1,4 0,23 0,002
Hàm lượng
xác định được 1,09 1,15 9,4 0,74 0,08 ND
Ghi chú: ND - Dưới giới hạn phát hiện của phương pháp
Từ kết quả được trình bày trong bảng 3.24, chúng tôi thực hiện phân tích hồi quy so sánh hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm B xác định được bằng phương phỏp nghiờn cứu với hàm lượng trờn nhón sản phẩm (à), kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.25 dưới đây:
Bảng 3.25 P: hân tíchhồi quy so sánh hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm B xác định được bằng phương pháp nghiên cứu với hàm lượng trên nhãn
sản phẩm (ààààà)
Vitamin r r2 (%) Độ tuyến tính
Fvalue DFb P
Thiamin 0,742 55,1 8,59 1 0,022
Riboflavin 0,083 0,7 0,05 1 0,832
Niacin 0,972 94,4 118,25 1 0,000
Pyridoxin 0,802 64,3 12,61 1 0,009
Axit folic -0,186 3,5 0,25 1 0,631
r: hệ số tương quan Person
bDF: bậc tự do
Fvalue: phân phối chuẩn thống kê Fisher
Các kết quả phân tích so sánh cho thấy: hầu hết các vitamin hoặc có hàm lượng quá cao hoặc quá thấp so với giá trị công bố trên nhãn sản phẩm dẫn đến hàm lượng các vitamin trên nhãn không được thể hiện đúng như hàm lượng nhà sản xuất công bố.
Hệ số tương quan r của các vitamin khá thấp trừ trường hợp của vitamin niacin, đặc biệt 02 vitamin là riboflavin và xit folic có giá trị xác định được và giá trị trên nhãn a khác biệt nhau rất lớn (r < 0,1). Đây cũng là vấn đề các cơ quan quản lý nhà nước đang tăng cường kiểm tra công bố nhãn mác của các hãng sữa trên thị trường nhằm đảm bảo quyền lợi của người tiêu dùng cũng như chất lượng của sản phẩm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Đề tài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm B gồm: thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxine, axit folic và cyanocobalamin trong các mẫu sữa bột trẻ em đã thu được các kết quả sau:
- Đã khảo sát và chọn được các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký:
bước sóng phát hiện: từ 246 nm đến 361 nm, cột tách: symestry Water C18 , thành phần pha động: photphat KH2PO4 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat : acetonitril; tốc độ pha động: 1ml/phút.
- Đã khảo sát, đánh giá được độ tin cậy của phương pháp thông qua các đại lượng: độ lệch chuẩn (SD < 1), độ thu hồi (80 % – 98%), độ tái lặp (Zscore ≤ 3, giới hạn phát hiện ( 37 ppb 178– ppb), giới hạn định lượng (123 ppb – 593 ppb).
- Đưa ra được quy trình xử lý mẫu bằng dung dịch TCA 4% phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm, hiệu suất thu hồi đạt 80 -98%.
- Đánh giá được độ nhiễu của nền mẫu qua giá trị độ tinh khiết của pic sắc ký đánh giá tại 03 điểm của đường cong pic tại bước sóng 246 nm với độ tinh khiết của pic đạt trên 90%.
- Đánh giá sai số hệ thống của phương pháp (chuẩn t) cho thấy phương pháp chỉ mắc sai số ngẫu nhiên tức là phương pháp có độ đúng chấp nhận được, không có sự khác biệt đáng kể nào giữa kết quả thu được và các giá trị thật của mẫu sữa kiểm tra liên phòng, đồng thời khẳng định tính hiệu quả của quá trình chiết mẫu thông qua độ thu hồi trong các mẫu sữa bột trẻ em.
- Tiến hành phân tích trên 20 mẫu sữa bột trẻ em, kết quả phân tích cho thấy xác định được hàm lượng các vitamin thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxine, axit folic với độ chính xác cao. Vitamin cyanocobalamin không xác định được trong bất kỳ mẫu sữa bột nào do có hàm lượng thấp dưới ngưỡng phát hiện (LOD) của phương pháp, đây cũng là trường hợp thường gặp trong các
phương pháp phân tích xác định đồng thời cyanocobalamin trong các mẫu thực phẩm trẻ em như: ngũ cốc, sữa bột, bột dinh dưỡng hoa quả cho trẻ em (1, 23, 25). Thực tế trong các mẫu sữa bột trẻ em hàm lượng cyanocobalamin thường được bổ sung với hàm lượng rất nhỏ nên hiện các phương pháp phân tích đồng thời các vitamin thường không xác định được hàm lượng cyanocobalamin trong các mẫu sữa.
Từ các kết quả thu được cho thấy, phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng detector PDA, cột tách symestry Water C18, thành phần pha động dung môi A là đệm photphat KH2PO4 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat;
dung môi B là acetonitril, tốc độ dòng 1ml/phút là sự lựa chọn đúng đắn để xác định hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm B. Quá trình sắc ký sử dụng chế độ tách rửa giải gradient để tách đồng thời 06 vitamin cũng là ưu điểm và thành công của phương pháp này và thực tế phương pháp này đã thành công khi được áp dụng vào phân tích các mẫu sữa bột trẻ em và cho các kết quả tốt. Qua đó chúng tôi đã xây dựng được quy trình phân tích 06 vitamin tan trong nước nhóm B trong các mẫu sữa bột trẻ em bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector PDA.
Trong thời gian tới, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu phương pháp phân tích nhằm xác định hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm B trong các nhóm đối tượng thực phẩm khác như: gạo, rau, củ quả…là các nhóm đối tượng mẫu giàu vitamin nhóm B nhưng có nền mẫu phức tạp khi thực hiện quá trình xử lý mẫu.
TÓM TẮT NGHIÊN CỨU
Đề tài đã tiến hành nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng các vitamin tan trong nước nhóm B gồm: thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxine, axit folic và cyanocobalamin trong các mẫu sữa bột trẻ em. Nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng detector PDA, cột tách pha ngược symestry Water C18, thành phần pha động dung môi A là đệm photphat KH2PO4 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat; dung môi B là acetonitril, tốc độ dòng 1ml/phút hiệu năng cao (HPLC) để tách và xác định đồng thời các vitamin tan trong nước nhóm B trong các mẫu sữa bột trẻ em. Quá trình sắc ký sử dụng chế độ tách rửa giải gradient để tách đồng thời 06 vitamin cho thấy các vitamin được tách ra hoàn toàn tại các bước sóng khác nhau tương ứng với bước sóng hấp thụ của các vitamin với thời gian lưu tổng cộng là khoảng 20 phút, các pic có độ đối xứng tốt và không xảy ra hiện tượng doãng chân pic. Quá trình xử lý mẫu được thực hiện bằng phương pháp kết tủa protein bằng dung dịch axit trichloroacetic (TCA 4%), lắc kỹ bằng máy vortex trong 5 phút, ly tâm sau đó gạn lấy dịch lọc.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy các thông số đánh giá độ chính xác của phương pháp như: khoảng tuyến tính nằm trong khoảng 176 ppb đến 20000 ppb, độ thu hồi đạt từ trên 80 % đến hơn 98 %, độ lệch chuẩn (SD) luôn nhỏ hơn 1, độ tái
lặp Zscore ≤ 3. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng từ 37 đến
178 ppb và giới hạn định lượng nằm trong khoảng từ 155 ppb đến 977 ppb. Ngoài ra để đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích, chúng tôi đã sử dụng các mẫu thử nghiệm liên phòng do Công ty Sữa Nestlé (Thụy sỹ) cung cấp. Các kết quả phân tích mẫu liên phòng thông qua các đánh giá phân tích thống kê đã khẳng định phương pháp đạt độ tin cậy với P = 0,95.
Phương pháp nghiên cứu đã được ứng dụng để xác định các vitamin tan trong nước nhóm B: thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxin, axit folic và cyanocobalamin trong các mẫu sữa bột trẻ em và đã hoàn chỉnh quy trình phân tích
06 vitamin tan trong nước nhóm B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector PDA để áp dụng cho các đối tượng phân tích khác.
RESEARCH SUMMARY
The Theme s ha performed a study in order to determine the sixth water- soluble vitamins including: thiamine, riboflavin, niacin, pyridoxine, folic acid and cyanocobalamin in milk powder by liquid chromatography.
The research used reversed-phased liquid chromatography (RP-LC) combined with PDA detector. The separation was carried out in a HPLC Shimadzu 10Avp equipped with a photodiode array detector (PDA) using gradient elution on a Symestry Water C18 (150mm ì 5mm ì 4,6àm) set at 40oC. The mobile phase was a modified buffer phosphate KH2PO4 (solvent A - 0,01M, pH = 3,0 + 5mM natri heptan sulfonat) and acetonitril (solvent B). The flow rate was 1 mL/min during the entire time. The injection volume was 50 l. The separation procedure using à gradient elution to determine sixth vitamins showed that alls of vitamins were completely separated at different wavelengths corresponding with absorption wavelengths of the sixth vitamins and the total retention time was 20 minutes. Alls pick had a good balance and did not occur on the phenomenon of pick unbalance.
The sample treatment procedure was carried out by protein precipitation method using trichloroacetic acid 4% (TCA), and vibrated by Vortex’s machine in 5 minutes, centrifuged and filtered to recover solution.
The research results demonstrated that all parameters as: linear range from 176 ppb to 20000 ppb, recovery rate from above 80 % to more than98 %, standards deviations (SD) were less than 1, repeatability with Zscore ≤ 3. The limitation of detection (LOD) stayed in range from 37 to 178 ppb and limitation of quantification (LOQ) from 155 ppb to 977 ppb.
Beside that, to evaluate the accuracy of analysis method, we used the proficiency test samples (PTS) supplied by Nestle Milk Company (Swiss). The results of proficiency test samples through evaluation of statistical analysis confirmed that the method gained confidentiality P = 0,95.
The research method has successfully applied to determine the sixth water- soluble vitamins including: thiamine, riboflavin, niacin, pyridoxine, folic acid and cyanocobalamin in milk powder for children and completed analytic procedure of sixth water soluble vitamins in B group by high performance liquid - chromatography (HPLC) using photodiode array (PDA) detector to apply for others analytic objects.