Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách - dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Hình 1.1 mô tả sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC như sau:
Hình 1.1: Sơ đồ Cấu tạo của hệ thống HPLC
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích (solvent: dung môi pha động + mẫu phân tích; pump: hệ thống bơm)
- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ (HPLC Column: cột tách; injector autosampler: bơm mẫu tự động) - Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch
đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu (detector: phát hiện chất phân tích; data: bộ phận máy tính xử lý số liệu; waste: dung môi thải ra)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản;
sắc ký phân bố lỏng lỏng; sắc ký rây phân tử...Phương pháp được sử dụng rộng rãi - nhất là sắc ký lỏng pha liên kết.
1.3.2. Pha tĩnh trong HPLC
Trong HPLC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 - 7àm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương phỏp sắc ký lỏng pha liờn
kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC)
• Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN...), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluen…Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực.
• Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động là dung môi phân cực như nước, methanol, axetonitril…Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực [5].
1.3.3. Pha động trong HPLC [4]
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ với tướng tĩnh
- Bền vững và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký - Hoà tan được mẫu
- Phải có độ tinh khiết cao
- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector - Không quá đắt
Một pha động phù hợp (về độ phân cực, về detector cũng như các tính chất cần thiết khác như: khả năng tạo phức là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi …) sẽ góp phần tốt nhất có thể được vào qua trình tách.
Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp:
+ pha động có độ phân cực cao, có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha đảo.
+ pha động có độ phân cực thấp là các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải,nênngười ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích các hỗn hợp mẫu phức tạp Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thờ. i gian, trường hợp này gọi là rửa giải gradient nồng độ.
1.3.4. Các loại detector trong HPLC [37]
Detector là bộ phận quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp phân tích; tuỳ thuộc bản chất lý hoá của chất phân tích mà chúng ta đưa ra lựa chọn detector phù hợp:
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử vùng tử ngoại, khả kiến (UV VIS , - ) detector photodiot-aray (PDA): áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
- Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp…
Ngày nay các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như: diot-aray, MS, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kỹ thuật tin
học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.
1.3.5. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC
• Thời gian lưu
Khi được bơm vào cột sắc ký các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định, đó chính là thời gian lưu của chất phân tích tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại:
tRi = to + t’Ri
Trong đó: to là thời gian chết (thời gian chất phân tích nằm trong pha động) t’Rilà thời gian lưu giữ thực của chất phân tích trên cột tách
• Số đĩa lí thuyết[35]
Hiệu lực của cột tách được đo bằng số đĩa lí thuyết N của cột.
2 2 2
1/2 2 2
i
) . 2 .(
.W 54 , W 5
) .(
16
A t h t
t
N tRi o R π R
=
− =
=
Trong đó: tRi: thời gian lưu của chất phân tích i trên cột tách to: thời gian không lưu giữ
Wi: chiều rộng đáy chân pic
W1/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic h: chiều caopic
A: diện tích pic
khi giá trị N quá nhỏ thì các chất phân tích không được tách tốt hoặc quá trình tách xảy ra không hoàn toàn, ngược lại khi giá trị N quá lớn thì sẽ làm các pic của các chất sẽ cách nhau quá xa khiến việc rửa giải tốn nhiều dung môi. Thực tế với các mẫu của HPLC thường N nằm trong khoảng từ 4000 ÷ 7500 là vừa đủ.
• Hệ số đối xứng pic [6]
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký (xem có kéo đầu hay kéo đuôi không), ta có thể dùng hệ số đối xứng F: 2a
= W
F trong đó:
W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Ta cũng có thể đánh giá tính cân xứng theo công thức:
A S =B
A: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
B: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng cong phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
S = 1,0 ÷ 1,05 là pic rất đẹp (lí tưởng) S = 1,5 là chấp nhận được
S = 2 là pic xấu S = 4 là pic rất xấu
• Hệ số tách α
Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương pháp sắc ký và là tỉ số thời gian lưu của 2 chất: α = t’A/t’B.
- Điều kiện cần thiết để 2 chất A và B tách ra khỏi nhau là: α ≠ 1.
α càng lớn hai chất tách khỏi nhau càng rõ ràng.
- Khi α = 1 thì hai chất không có sự tách do lúc này chúng cùng nằm trong một pic.
- Khi α ≈ 1 thì hai chất có pic chung một vùng, tức là pic bị chập nhau, cũng không thể tách ra thành hai pic riêng biệt đặc trưng.
• Độ phân giải R [5]
Độ phân giải R nói lên mức độ tách ra khỏi nhau của hai chất A và B
B
A W
W
) ' ' .(
2 +
= t RA−tRB R
Ở đây: t’RA và t’RBlà thời gian lưu thực của các chất A và B WA và WBlà chiều rộng đáy pic của A và B
Theo qui luật phân bố của Gaoxo và Rayley, điều kiện tối thiểu để cho 2 chất A và B tách ra khỏi nhau thì cực tiểu của pic A nằm gần nhất vị trí cực đại của B, và để tách hoàn toàn rõ ràng thì cực tiểu của pic phía sau B phải kề với cực tiểu phía sau pic A, tức là RAB = WA + WB
1.3.6. Phân tích định tính bằng HPLC [7]
Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu.
Vì vậy sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó, so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.
1.3.7. Phân tích định lượng bằng HPLC [7]
Trong HPLC có thể dùng một trong hai phương pháp là: phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng. Việc dùng phương pháp nào trong hai phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích. Phương trình đường chuẩn có dạng :
Hi = k1.Ci
Si = k2. Ci
Hi, Si là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i Cilà nồng độ chất i
K1, k2 là các hằng số thực nghiệm
Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn. Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn.
1.3.8. Phương pháp sắc ký lỏng hấp phụ pha ngược RP-HPLC [3]
Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ thường phân chia ra làm 2 loại theo cơ chế bản chất của pha tĩnh. Hấp phụ pha thường (NP- HPLC) và hấp phụ pha ngược (RP-HPLC). Sự phân chia này là do tính chất của pha tĩnh quyết định.
Đối với hệ NP HPLC pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là các dung môi - không phân cực và kém phân cực. Ngược lại, trong hệ RP HPLC pha tĩ- nh kém phân cực, thông thường pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan và alkyl hóa bề mặt tạo thành các vật liệu nhồi kém phân cực. Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực. Do bản chất và hiệu quả tách của các quá trình trên nên ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng nhiều hơn
1.3.9. Các phương pháp xác định các vitamin nhóm B trong thực phẩm
Trên thực tế, trong vòng 20 năm trở lại đây phương pháp HPLC đã được sử dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong nước, trong các loại thực phẩm và thực phẩm giàu dinh dưỡng. Phương pháp HPLC sử dụng detector UV đã được sử dụng thành công trong việc phân tích thiamin và riboflavin trong các mẫu ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc [19], thiamin, riboflavin, niacin trong gạo và sản phẩm gạo [34]. Trong đối tượng thực phẩm là thịt, thiamin và riboflavin được xác định bằng việc sử dụng detector huỳnh quang [11]. Các loại thực phẩm khác nhau rất quan trọng đối với quá trình phân tích do bản chất và hàm lượng của các thành phần khác nhau trong các đối tượng thực phẩm sẽ ảnh hưởng đến tính hiệu quả của phương pháp tách. Esva Barma và cộng sự đãthiết lập một phương pháp HPLC phù hợp với detector UV sau một quá trình rửa cột để xác định thiamin và riboflavin trong các mẫu thịt và gan, hay F.Arella và cộng sự đã dùng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng detector huỳnh quang để xác định thiamin và riboflavin trong thực phẩm.
Năm 1979, Toma và Tabekhia [34], áp dụng phương pháp phân tích RP-LC với sắc ký lỏng sử dụng cặp ion trong pha động và cột tách pha ngược, đã thu được các kết quả tốt trong việc phân tích thiamine, riboflavin và niacin. Kể từ đó, nhiều phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP-LC) sử dụng cặp ion đã được triển khai để xác định các vitamin tan trong nước, áp dụng cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau, như gạo [34], tách các hỗn hợp khoáng vitamin [16], sữa [14], trứng [32]. Tuy nhiên, phương pháp sắc ký cột tách pha ngược (RP-LC) với thuốc thử cặp ion có nhược điểm do sự phức tạp của pha động dẫn đến thời gian ổn định cột lâu hơn và tổng thời gian phân tích lên tới hơn 50 phút [28].
Ngoài ra, từ năm 1987 phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng cặp ion (RP-LC) cũng được xem là một phương pháp chính thức được áp dụng trong việc
xác định vitamin B1 và B2, trong đó bao gồm cả bước thực hiện dẫn xuất trước cột cho thiamin thành thiochrome và sử dụng ánh sáng huỳnh quang để phát hiện, phương pháp này được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực