Sản xuất chitin chitosan từ vỏ tôm

đường xử lý hoá học làm giảm chất lượng sản phẩm chitosan vì phản ứng với NaOH làm giảm đi độ nhớt của chitosan.Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là sử dụng chế phẩm enzyme th

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chitin là một polysaccharide đứng thứ hai về lượng trong tự nhiên chỉ sau cellulose Chitin và các sản phẩm của chúng hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý môi trường Ngoài ra khi ta khử acetylene trong hợp chất chitin sẽ tạo thành chitosan là đơn vị cao phân tử của glucosamine, là một chất có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhẹ, thực phẩm, nông nghiệp Việc nghiên cứu và tách chiết chitin từ vỏ giáp xác đã được thực hiện hơn một thế kỷ nay

Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lượng tôm năm 2003 là 193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lượng nguyên liệu Tương ứng với sản lượng tôm hàng năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm được tạo ra Hiện nay, ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra sản phẩm có giá trị cao, chitin – chitosan

Tuy nhiên, quy trình sản xuất chitin được sử dụng phổ biến hiện nay là theo phương pháp hoá học, protein trong đầu và vỏ tôm được loại bỏ bằng cách xử lý với

đường xử lý hoá học làm giảm chất lượng sản phẩm chitosan vì phản ứng với NaOH làm giảm đi độ nhớt của chitosan.

Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là sử dụng chế phẩm enzyme thuỷ phân protein trong vỏ tôm để sản xuất ra sản phẩm chitin có chất lượng cao và vừa giải quyết được vấn đề môi trường Nhiều loại enzyme protease đã được trích ly từ tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi như: protease từ nội tạng tôm cá, bromelaine từ dứa, papain từ đu đủ, protease từ vi sinh vật vv

Việc sử dụng enzyme vào sản xuất công nghiệp không những đem lại hiệu quả cao mà còn có thể làm giảm chi phí sản xuất bằng cách tái sử dụng lại enzyme Để có thể tái sử dụng được enzyme ta có thể tiến hành cố định enzyme vào một chất mang bằng phương pháp nhốt và chitosan là một chất được xem là có nhiều triển vọng trong việc cố định enzyme và tế bào Vớùi mong muốn góp phần giải quyết những yêu cầu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm”

1.2 Mục đích khoá luận

Sản xuất chitin – chitosan bằng cách sử dụng enzyme protease thu được từ

nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae bằng các nguyên liệu rẻ tiền, đồng thời nghiên

cứu ứng dụng chitosan thu được làm giá thể cố định enzyme

1.3 Nội dung

Thu nhận enzyme protease từ Aspergillus oryzae.

Khảo sát quá trình kết tủa của enzyme protease

Sử dụng enzyme protease trong sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm Khảo sát quá trình thuỷ phân

Ưùng dụng chitosan làm giá thể cố định enzyme protease

CHƯƠNG II

2.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitosan trong tự nhiên

Chitin – chitosan là một polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn đứng thứ hai sau cellulose Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật

Chitin – chitosan là polysaccharide có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosaccharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823 Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống như cellulose

2.1.1 Cấu trúc hoá học của chitin

Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X người ta có thể chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ- chitin

Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ - chitin được mô tả như sau:

α – chitin β- chitin γ – chitin

α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp

do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên

β,γ- chitin da mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β- chitin ) và hai song song một ngược chiều (γ- chitin ), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β- chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình acetyl hoá cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Qua nhiều nghiên cứu về sự thuỷ phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β- (1-4) glucozit

Công thức phân tử: [C8H13O5N]n

Phân tử lượng: Mchitin = (230.09)n

Hình 1 Công thức cấu tạo của chitin Tên gọi: poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose 2.1.2 Tính chất của chitin

Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau

Chitin là một polysaccharide bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid loãng, trong kiềm loãng, các thuốc thử Schweitzer và các dung môi hữu cơ như rượu, este, nhưng nó hoà tan trong một số dung dịch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitrit, formic, acid khan) Đặc biệt nó còn hoà tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và muối thixianat canxi [Ca(SCN)2] tạo thành dung dịch keo

Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử bởi gốc acetyl tạo thành chitosan

2.1.3 Cấu trúc hoá học của chitosan

Trong các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế

Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hoá chất độc hại, đắt tiền Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hoá chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2

Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hoá (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit

2-amino-2-deoxy-β-D-Công thức phân tử chitosan [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161.07)n

Hình 2 Công thức cấu tạo của chitosan Tên gọi khoa học: poly(1-4)-amino-2-deoxy-β-D-glucose

Qua cấu trúc của chitin – chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là –OH ( H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hoá học hơn chitin Trong thực tế chitin – chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp

2.1.4 Tính chất của chitosan

Trọng lượng phân tử chitosan tuỳ thuộc vào điều kiện sản xuất, thường nằm trong khoảng 10.000 – 1.000.000 Da với mức độ deacetyl hoá thường là 70 – 90%

Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vị, không tan trong nước, kiềm, aicd đậm đặc nhưng tan trong acid loăng, tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng (0.5 – 1.5%) tạo thành dung dịch keo, trong suốt Lợi dụng tính chất này của chitosan để thực hiện cố định enzyme bằng phương pháp nhốt

Chitosan là một polyamine, nó được xem như là một polymer cationic có khả năng cho các ion kim loại nặng bám dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức chất với kim loại và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung dịch

Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các khuẩn gây bệnh

như E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm

nhất là nấm Candida albicans

Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309 – 3110C

Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, có tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối glutaradehyde

Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính chitosan

Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được xem là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá để cho ra các dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường

2.1.5 Nguồn thu nhận chitin

Chitin có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên trong đông vật, thực vật và cả vi sinh vật

Trong động vật chitin là một thành phần quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: cồn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, và các sinh khối nấm mốc, một số loài tảo

Tuy nhiên trên thực tế vỏ tôm cua lại chiếm thành phần chitin khá 35%) Với giá thành rẽ nên hầu hết các cơ sở sản xuất chitin – chitosan đều từ vỏ tôm Vì lý do giảm thiểu ô nhiễm môi trường (sản xuất chitin – chitosan chủ yếu bằng phương pháp hoá học) Nâng cao chất lượng sản phẩm, tận thu các phế phẩm có giá trị (vỏ tôm từ nhà máy) vv góp phần giải quyết ô nhiễm mà còn đem lại hiệu quả kinh tế cao

cao(14-Bảng 2.1: bảng biểu diễn thành phần hoá học trong đầu tôm

Hàm

lượng

Hiện nay sản xuất chitin – chitosan chủ yếu bằng phương pháp hoá học và phải qua các quá trình sau:

a) Quá trình khử khoáng

Trong vỏ tôm thành phần chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2

nên người ta thường dùng các loại acid như HCL, H2SO4 để khử khoáng Khi khử khoáng, nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn Nếu dùng H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít sử dụng Phản ứng của HCl để khử khoáng như sau:

Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính, công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết các muối, acid dư tan trong nước Quá trình rửa kết thúc khi dịch rửa cho pH

= 7

b) Quá trình loại protein

Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng Ta tiến hành loại bỏ hoàn toàn protein bằng dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm thuỷ phân thành các amin tự do tan và được loại ra

kiểm tra pH = 11 -12 là được để đảm bảo việc loại bỏ protein được hoàn toàn Đun ở nhiệt độ 90 -950C trong 3.5- 4 giờ (trong quá trình nung lưu ý vấn đề trào dung môi

do tạo bột nhiều và mùi bay ra khó chịu) sản phẩm sau khi nung được rửa sạch bằng nước thường hoặc nước cất đến pH = 7

Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trôi hết các, muối natri, các amin tự do và NaOH dư Sấy khô ở 600C thu được chitin thô

c) Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin)

chitin thô có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin Do chitin ổn định với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO4) oxy già (H2O2) nước javen (NaOCl + NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3 lợi dụng tính chất này ta sử dụng KMnO4 và H2O2 để khử màu cho chitin

d) Điều chế chitosan

quá trình điều chế chitin thành chitosan thực chất là quá trình deacety hoá chitin, chuyển hoá nhóm –NHCOCH3 thành nhóm NH2 và loại bỏ nhóm –CH3CO, chuyển hoá thành muối natri (CH3COONa Để thực hiện được quá trình deacetyl hoá hoàn toàn, người ta sử dụng NaOH đậm đặc 50% thời gian 4 giờ nhiệt độ ở 110 – 120C ở đây dựa vào tính chất chitosan tan được trong dung dịch acid loãng tạo thành dung dịch keo trong suốt, trong khi chitin không tan do đó ta có thể sơ bộ kiểm tra mức độ chuyển hoá chitin thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào

CH3COOH 1% Nếu sản phẩm tan tạo thành dung dịch keo trong suốt là được Sau đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu trắng sáng Quá trình điều chế chitosan tử chitin cho hiệu suất tương đối cao (60 -75%)

2.3 Ứng dụng của chitin – chitosan

a) Trong công nghiệp thực phẩm

Chitosan dùng để bảo quản hoa quả và rau tươi, bảo quản thực phẩm tươi sống.

Làm màng mỏng để bao gói bánh kẹo

Chitosan và muối của nó được dùng như chất tinh luyện nước ép từ trái cây như nước táo, cà rốt, chất này làm thay thế các chất cũ như silicasol, gelatin,

b) Trong mỹ phẩm

Chitosan dùng làm chất phụ gia, làm kem bôi mặt, thuốc làm mềm da, làm tăng khả năng hoà hợp sinh học giữa kem thuốc và da, cấu tạo thuốc định hình tóc, kem bôi da lột mặt,

Bản thân chitosan và các dẫn xuất của nó được dùng làm thuốc chữa bệnh: thuốc hạ cholesterol trong máu, thuốc chữa trị các vết thương, vết bỏng Thuốc chữa đau dạ dày, thuốc chống đông tụ máu, thuốc dùng tăng cường miễn dịch cơ thể và khả năng chống nhiễm HIV,

Chitosan được dùng như là một thành phần chính trong thuốc phòng trừ nấm (đạo ôn, khô vằn, ), dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cho cây lúa, cây công nghiệp, cây cảnh, cây ăn quả,

f) Trong công nghệ hoá học

Chitosan được dùng để xử lý nước thải công nghiệp, có khả năng tạo phưc với các kim loại nặng độc hại, dùng để lọc nước sạch tiêu dùng

g) Trong công nghệ sinh học

Chitosan được dùng làm chất nang để cố định enzyme và các tế bào

2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở việt nam và thế giới

Trước đây người ta đã thử tách chiết chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm cua Trong một thời gian các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn lại chitin sẽ được dùng làm như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp

Việc nghiên cứu chitin – chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục phụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta Vào những năm 1978 đến 1980 trường Đại học thủy sản nha trang đã công bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, như chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị

trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp.

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm – TPHCM Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại TPHCM, Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 2

Ơû miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp thuỷ sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng kích lệ

Ơû miền Nam Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một số

cơ quan khác: Đại Học Y Dược TPHCM, phân Viện Khoa Học Việt Nam Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam, đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin – chitosan trong lĩnh vực nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm

Trong nông nghiệp chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cương khả năng nảy mầm của hạt

Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan

vi lượng làm tăng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzyme amylase, catalase hay peroxidaza cũng tăng lên

Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Những ứng dụng của chitin – chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày càng phát triển Một số đã được ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo, thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác đang được nghiên cứu như : tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu, trị bỏng nhiệt

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Dược Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng hiệu quả

Chitin – chitossan và các oligo của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh

Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligo, N-acetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polymer tương ứng nhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzyme và tế bào Enzyme cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cầc thay đổi chất xúc tác Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nươc hoa quả, sử dụng enzyme cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tô hoá học

Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào nguyên liệu sẩn xuất giấy cũng tốt hơn Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in.

Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid hay kiềm nhẹ

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH4+ các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hoá của da, nhà vậy các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm

Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước

Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau:

Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin – chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+ Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu

Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào

Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào

Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó.

2.5 Một số quy trình sản xuất chitin và chitosan trên thế giới và ở việt nam

Trên Thế Giới

a) Quy trình thuỷ nhiệt Yamasaki và Nacamichi (nhật bản)

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%)

Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 1500C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70% Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm

Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác Hoá chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh thiết cao Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất

b) Quy trình sản xuất chitin của Hackman

Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C và đem xay nhỏ

Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở nhiệt độ phòng Sau

48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần bã Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly

tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem.

Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin

c) Quy trình sản xuất chitosan của pháp

Nguyên liệu vỏ tôm sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ Khử protein bằng NaOH 3.5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0.135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với ra rửa trung tính, thu được chitin sạch Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính thu được chitosan

Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hoá mạnh, ảnh hưởng đến mạch polymer, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao Chưa kể các yếu tố trong

an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay

d) Phương pháp điều chế chitin của Capozza

Cân 149g nguyên liêu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy,

giờ Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7 xác định hàm lượng tro 0.4 -0.5% sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml acid fomic HCOOH 90% Để qua đêm Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7 sản phẩm sạch sau đó được ngâm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether, sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm Khối lượng chitin thô sạch thu được là 66g hiệu suất 44,3%

Tại Việt Nam

a) Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng

Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1.5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính

Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10% sau 1 giờ rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1.5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin

Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan

Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm

b) Quy trình sản xuất chitosan ở trung tâm cao phân tử viện khoa học Việt Nam

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4%

ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau

Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 -95 C sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần hai bằng HCl ở nhiệt độ phòng 90 -950C sau 3 giờ đem rửa trung tính Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan.

Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn

c) Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà Nội

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng 24 giờ vớt ra rửa trung tính Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2.8 ở nhiệt độ 90-

950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2,

ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính Để tách protein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2.8, ở nhiệt độ 90-950C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên Sản phẩm đem làm khô thu được chitin

Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hoá chất polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm

d) Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp với hoá học.

Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hoá học cũng thực hiện theo các bước: khử khoáng, khử protein và deacetyl

Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hoá học

Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng enzyme protease và deacetyl bằng enzyme deacetylaza.

Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v =1/10, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ Rửa sạch đến pH = 7.sau đó khử protein bằng papain 13% tỷ lệ w/v

=1/5, pH = 5-5,5, ở nhiệt độ 70 -800C trong thời gian 4 giờ Rửa sạch, tẩy màu sấy khô ở nhiệt độ 600C thu được chitin thô, trắng Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ lệ w/v =1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan sạch

Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp trong và mềm mại Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác Tuy nhiên điều kiện khó khăn

do việc tìm mua hoặc sản xuất enzyem deacetylaza nên công đoạn deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc

e) Quy trình sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp sinh học

Trong vài năm gần đây đã có nhiều phát hiện mới liên quan đến sản xuất

chitin – chitosan bằng cách nuôi cấy nấm móc Rhizopus azygosporus và nấm mốc Actinomucor taiwanensis và cô lập chitin – chitosan từ sự nuôi cấy đó Sau khi nuôi

cấy tế bào nấm mốc được thu nhận từ canh trường lên men và xử lý chúng với NaOH nồng độ 1N ở 1210C thời gian 15 phút Sau đó trộn với nước cất đem đi ly tâm rửa lại bằng nước cất hoặc cồn rồi tiếp tụ xử lý với dung dịch acetic 2% ủ nhiệt độ

2.6 Nhu cầu sử dụng phương pháp sinh học kết hợp với hoá học

Qua các quy trình sản xuất trên ta đã thấy rõ phương pháp hoá học còn nhiều hạn chế, tiêu tốn nhiều hoá chất gây ô nhiễm môi trường Còn phương pháp sinh học giá thành lại cao, do đó điều kiện cấp thiết là phải có một quy trình sản xuất ít gây ô nhiễm và giá thành hợp lý vì vậy ta sẽ thay thế quá trình thuỷ phân protein bằng enyzme protease

2.7 Các nguồn enzyme protease

Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị

Renin chỉ có ở ngăn thứ tư trong dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất phomat

Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh

Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh

Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả

Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dược.

Trong các loại protein, protein vi sinh vật từ nấm mốc là được sử dụng rộng rãi nhất vì sản lượng lớn, dễ dàng thao thác, dễ dàng nuôi cấy chủ động được nguồn protein cho sản xuất Enyzme có hoạt tính cao vv do đó chúng tôi đã chọn nấm

mốc Aspergillus oryza vì enzyme protease từ nấm mốc có hoạt tính cao, sinh sản

nhanh, dễ dàng thu nhận chủ động được trong quá trình sản xuất

2.8 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu xanh, sợi nấm phát triển rất mạnh

(chiều ngang 5 – 7µm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty

Điều kiện phát triển

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử là 45%

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme là 55 – 58%

Độ ẩm không khí là 85 – 95%

pH môi trường là 5.5 – 6.5

Nhiệt độ nuôi cấy là 27 – 300C

Hình 2.1 Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi

2.8.1 Thu nhận enzyme protenase từ phương pháp nuôi cấy bề mặt

Để thu nhận chế phẩm proteinase từ vi sinh vật cưng như các enzyme khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy về sâu Phương pháp nuôi cấy bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp nuôi cấy bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh đã được nghiên cứu và phát triển rất mạnh trong những năm đầu thế kỷ 20 lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương pháp nuôi cấy chìm Nguyên liệu sử dụng nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc về thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô, trấu khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như nhưng cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 -14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi

cấy Ơû giai đoạn này có những thay đổi sau:

Nhiệt độ tăng rất chậm

Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

Khối môi trường còn rời rạc

Enzyme mới bắt đầu hình thành

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt

Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài khoảng 14 – 18 giờ Trong giai đoạn này

có những thay đổi cơ bản sau:

Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh Các sợi nấm tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường

Môi trường được kết lại khá chặt

Độ ẩm môi trường giảm dần

Nhiệt độ môi trường tằng nhanh có thể lên tới 40 – 450C

Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợiCác loại enzyme được hình thành và enzyme nào có chất cảm ứng trội hơn sẽ tạo ra nhiều hơn

Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng từ 29 -300C là tốt nhất

Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài khoảng 10 -20 giờ Ơû giai đoạn này có một

số thay đổi cơ bản sau:

Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do mật độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm lượng không khí môi trường xuống còn 20 – 250C thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ Nhiệt độ duy trì ở 300C Trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzyme giảm Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme là rất cần thiết

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường)

2.8.2 Thu nhận và tủa enzyme

Có nhiều phương pháp khác nhau để thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy như: dùng dung dịch muối loãng hoặc dùng nước Thông thường, để chiết enzyme người ta dùng nước với tỷ lệ thích hợp cho môi trường nuôi cấy vào, khấy đều trong thời gian nhất định, loại bỏ cặn, lấy dịch trong chứa enzyme hoà tan

Để tủa enzyme cũng có nhiều phương pháp:

Tủa bằng muối sunphat ở các nồng độ khác nhau Phương pháp này rẻ tiền do dùng các muối thông dụng như: Na2SO4, (NH4)2SO4, không làm biến tính protein, loại bỏ dễ dàng bằng phương pháp Dialis (quá trình thẩm tích) Tuy nhiên, chúng lại cho kết quả tủa không cao, khi chạy sắc ký phải loại muối trước, phải sử dụng nhiều nồng độ muối khác nhau.

Tủa bằng dung môi hữu cơ như: Acetone, isopropanol, ethanol (được dùng nhiều nhất) Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả tốt hơn so với tủa bằng muối, không cần loại muối trước khi chạy sắc ký, cách tiến hành đơn giản Như khi tủa phải thực hiện trong điều kiện lạnh vị nếu ở nhiệt độ thường sẽ làm biến tính protein, lương dung môi cần dùng tương đối nhiều

Tủa bằng đẳng điện: tại điểm đẳng điện, protein bin mất điện tích nên gây tủa, phương pháp này cho kết quả rất cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ

Tủa bằng loại polymer như: Polyacrylic acid, polysaccaride, polyphosphate

Ưu điểm của phương pháp có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polymer, hiệu suất tạo kết tủa cao Chi phí cho phương pháp này cao

Tủa bằng chất đa điện phân: thường dùng polyethylene glycol có phân tử lượng 6000 và 20.000 Có thể sử dụng với lượng chất này rất nhỏ, hiệu suất tạo kết tủa cao Nhược điểm của phương pháp này là rất đắc tiền và dễ gây biến tính protein

2.8.3 Tinh sạch enzyme

Để tinh sạch enzyme, người ta thường dùng các kỹ thuật sắc ký Đây là phương pháp tách liên tục từng vi phân của một hỗn hợp chất do sự phân bố không đồng đều giữa phase tĩnh và phase động khi cho phase động di chuyển xuyên qua phase tĩnh Dựa vào cơ chế của quá trình phân tách, có nhiều loại sắc ký:

Đặc tính Kỹ thuậtKích thước Lọc gel hay GF (gel filtration), còn gọi là

phân tách theo kích thướcĐiện tích Sắc ký trao đổi ion hay IEC (ion

exchange chromatography)

Kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước hay HIC

(hydrôphbic iteraction chromatography)Sắc ký đảo phase hay RPC (reversed

phase chromatography)Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của

b) phân đoạn các phân tử sinh học với tốc độ phân giải cao (high resolutiion frationation of biomolecules): dùng để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, xác định trọng lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử

Sắc ký lọc gel cũng dùng để thực hiện việc gấp cuộn lại các protein biến tính dễ dàng hơn bằng việc kiểm soát cẩn thận sự thay đổi điều kiện của dung dịch đệm

Sắc ký lọc gel khá phù hợp cho các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi của pH, nồng độ ion kim loại hoặc các co – factor và các điều kiện khắc nghiệt Sự phân tách có thể được thực hiện khi có mặt các ion hoặc các co – factor ở cường độ

cao hoặc thấp, ở 370C hoặc phòng lạnh theo yêu cầu thí nghiệm Protein tinh sạch có thể được thu nhận trong bất kỳ loại dung dịch đệm nào.

Để phân tách protein bằng sắc ký lọc gel, môi trường gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi Đây là chát nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, có tính ổn định về vật lý và hóa học, có tính trơ Nền nhồi được cân bằng bởi dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng ở bên trong các hạt, được xem như phase động Trong quá trình phân tách và giải hấp thụ chỉ dùng một loại đệm Bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy và tiến hành ở thời điểm kết thúc quá trình phân tách cho việc loại bỏ những phân tử còn lưu lại trong cột dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp

2.9 Giới thiệu về sự cố định enzyme

2.9.1 Định nghĩa

Enzyme cố định hay enzyme không hoà tan là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do Pha enzyme không hoà tan trong nước và được gắn với những polymer ưu nước có trọng lượng phân tử lớn Các enzyme hoà tan được gắn với các polymer (chất mang) bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, nhờ quá trình gắn này mà enzyme chuyển từ trạng thái hoà tan sang trạng thái không hoà tan

2.9.2 Tính chất của enzyme cố định

Khi gắn enzyme vào một chất mang, enzyme này có những đặc điểm sau:Hoạt tính của enzyme không hoà tan thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme hoà tan cùng loại, nguyên nhân do:

Do ảnh hưởng của điện tích của chất mang Khi gắn enzyme vào chất mang có điện tích khác với điện tích của enzyme, cấu trúc không gian của enzyme có sự

thay đổi ở mức độ nhất định Do đó sự tương tác của enzyme và cơ chất chậm lại, phản ứng xảy ra yếu hơn Mức độ giảm hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào mức độ thay đổi cấu trúc không gian của enzyme khi gắn chúng vào chất mang.

Do enzyme bị nhốt vào một gel Khi enzyme bị nhốt trong gel nào đó, gel sẽ bao lấy toàn bộ phân tử enzyme Do đó, sự tiếp xúc giữa trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất gặp khó khăn hơn so với sự tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme tự do

Enzyme không hoà tan hoàn toàn tuân theo định luật Michealis – Menten Tuy nhiên trong phản ứng giữa cơ chất với enzyme không hoà tan có những sai khác nhất định:

Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất vơi enzyme và chất mang Hiện tượng cản trở sự khuyếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng làm giảm tốc độ phản ứng

Enzyme không hoà tan có tính bền nhiệt hơn enzyme hoà tan cùng loại vì chúng được bảo vệ bởi chất mang

Enzyme không hoà tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme hoà tan chứ không trùng với pH tối ưu của enzyme hoà tan cùng loại

Enzyme không hoà tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme hoà tan cùng loại

Enzyme không hoà tan có thể tái sử dụng nhiều lần Trong khi đó enzyme hoà tan chỉ có thể sử dụng một lần Đặc điểm này rất có ý nghĩa về kinh tế khi ta tiến hành các phản ứng theo quy mô công nghiệp

2.9.3 Vật liệu cố định

một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau:

Giá thành rẽ, điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ

Tính chất cơ lý bền vững, ổn định Như vậy thì chất mang mới chịu được sự tác động từ môi trường bên ngoài như sự khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất

Về mặt hoá học, chất mang phải bền vững không tan trong môi trường phản ứng Chất mang không được làm mất hoạt tính của enzyme Chất mang không được gây ra những phản ứng hấp phụ không đặc hiệu

Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

Chất mang phải có độ trương nở tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định enzyme vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính của enzyme cố định và số lần tái sử dụng

Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng

b) Phân loại chất mang

Tất cả các chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm hai nhóm:Chất mang là polymer hữu cơ, gồm hai nhóm:

Chất mang là các polymer tự nhiên:

Chất mang polysaccharide: là nhóm chất mang đang thịnh hành và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng

Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất và dễ dàng tạo hạt Tuy nhiên do vấn đề giá cả nên chỉ được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu và vì mục đích y học

Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM – cellulose, DEAE – cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẽ nhưng lại không đồng nhất và ổn định nên chỉ được sử dụng ở dạng sợi và vi hạt

Alginate, carragenan là hai vật liệu khá mới mẻ Các vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào, enzyme Tuy nhiên gel của hai loại vật liệu này đều không ổn định trong môi trường có phosphate

Tinh bột là vật liệu rất phong phú và rẻ tiền Từ lâu, tinh bột dùng để đóng gạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzyme như là lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase, tuy nhiên, có nhược điểm là độ trương nở còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng vì vậy khả năng cố định và hoạt tính của enzyme còn thấp

Chitin và chitosan là một vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định enzyme và tế bào Chitin và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường dùng để cố định enzyme qua cầu nối glutaraldehyte và sodiumtripolyphosphate, ferrocianur potassium, cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ nước, độ trương nở kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ

Chất mang là proteine thường dùng như gelatin, keratin, albumin Vật liệu thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là NH2 vì vậy thường được sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyte Nhưng có nhược điểm là thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn, hay gây

ra các phản ứng miễn dịch với cơ thể khi sử dụng trên người và động vật

Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinyalcohol, polyvinyacetate, polyacrylic, polystyrene, polyethylene ghép với vinyl monomer, … ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương nở tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ, … tuy nhiên các polymer tổng hợp cũng bộc lộ những nhược điểm nhất định như: một số có giá thành cao như polyacrylic, polyacrylamide; có khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững không thể phân huỷ trong tự nhiên vì vậy gây ô nhiễm môi trường.

Chất mang vô cơ: ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang còn có một số chất mang vô cơ đã được xử dụng thương mại như sợi bông thuỷ tinh, silicum oxide, alluminium oxide, magnesium oxide Đây là những dạng oxide có cấu trúc siêu lỗ và có khả năng hấp phụ tốt Nhược điểm của các vật liệu này là tan trong dung dịch kiềm có pH lớn hơn 7.5

2.9.4 Phương pháp cố định

a) phân loại

Dựa vào bản chất các liên kết tạo thành giữa chất mang và enzyme, người ta chia thành hai phương pháp cố định: phương pháp vật lý (liên kết vật lý) và phương pháp hoá học (liên kết đồng hoá trị) Theo Scouten và Gerhartz, có bốn phương pháp cố định enzyme là:

Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption)

Phương pháp nhốt (entrapment)

Phương pháp khâu mạch ( cross – linking)

c) Phương pháp tạo enzyme không hoà tan

Phương pháp nhốt

Nhốt trong cấu trúc mạng gel:

Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị biến đổi qua quá trình cố định Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá các gel khi có mặt đồng thời enzyme Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp người ta thu được enzyme bị nhốt trong các lỗ gel Gel đã có enzyme có thể nghiên nhỏ bằng cách đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhở rồi đem sấy ở nhiệt độ thấp Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1993) thu được bằng cách trùng hợp acrylamine với N, và nN – metylenbisacrylamine Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp thu được dễ tạo thành hạt và tuỳ vào điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác nhau

Alginate và carragennan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận lợi để gói enzyme và tế bào Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzyme, hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt

Dạng các sợi tổng hợp:

Phương pháp này được thực hiện bằng việc trộn enzyme vào chất mangm tạo dịch lỏng, cho dịch lỏng này chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp ở các màng Phương pháp này được Dinelli (1972) tiến hành giống như tạo sợi celluloza triacetate trong methylen clorua và enzyme dạng dung dịch trong đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất của nitơ Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluene, sau đó được làm khô trong chân không

Dạng bao vi thể:

Enzyme được nhốt trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuyếch tán ra ngoài Vì ezyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enzyme và

cơ chất lớn hơn so với trường hợp nhốt trong cấu trúc dạng gel

Dạng màng siêu lọc:

Phương pháp này đơn giản tương tự như nhốt trong bao vi thể Enzyme được giữ trong màng siêu lọc Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp qua lại tự do, nhưng giữ lại enzyme có trọng lượng phân tử cao

2.9.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan) Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme không hoà tan là:

2.9 5.1 Bản chất và tính chất hoá học của chất mang

Các tính chất lý học của chất mang như tính hoà tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước, đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền, và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định Bản chất hoá học của chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tơi khả năng chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

Dẫn xuất enzyme không hào tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme hoà tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên Chất mang cũng có tác dụng hạn chế biến tính của enzyme trong dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen và liên kết kỵ nước

Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác.

2.9.5.2 Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố

Kích thước lỗ gel của chất polymer

Trọng lượng phân tử của cơ chất

Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

Trong vấn đề này, đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò hàng đầu Song những hạn chế khuyếch tán không đơn giản như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

2.9.5.3 Aûnh hưởng của pH lên enzyme không hào tan

Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme cố định pH tối ưu của enzyme hoà tan, sự chuyển dịch pH tối ưu là do ảnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang tạo nên

2.9.6 Ưùng dụng của enzyme cố định

Trong công nghiệp:

Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hoá chất, …

Rượu bia: các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn

Chế biến sữa: enzyme lactase cố định để thuỷ phân lactose sữa

Năm 1969, Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố địnhNăm 1971, đã sử dụng chymotrypsin liên kết cộng hoá trị với carboximethyl

Trong y học:

Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học để chữa các bệnh di truyền

do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh Do đó, cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ

Enzyme cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như: lượng glucose, urea, cholesterol, … enzyme horse radish peroxidase cố định trên polystyrene cùng với kháng thể, giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kỹ thuật ELISA)

Trong nghiên cứu khoa học:

Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiên đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoseoxydase cố định Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt có gel polyacrylamide Nhúng điện cực vào dung dịch có glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuyếch tán vào gel có chứa enzyme Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng và nồng độ glucose

Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử proteinem sử dụng trong phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc hiệu vơi enzyme Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng chế phẩm tế bào cố định để xử lý nước thải đạt hiệu quả

Trong bảo vệ môi trường:

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu bia, chế biến đường, chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu hữu cơ Do đó

có thể sử dụng enzyme cố định để xử lý nước thải sinh học nhằm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra môi trường bên ngoài.

2.9.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thuỷ phân bằng enzyme

a Aûnh hưởng nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính nồng độ enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

b Aûnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào tuyến tính vào nồng độ cơ chất Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

Với từng loại enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thuỷ phân một cơ chất cụ thể, trong điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme

c Aûnh hưởng của các chất kiềm hãm và các chất hoạt hoá

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hoá) hoặc làm giảm (chất kìm hãm) hoạt độ enzyme Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu và thay đổi tuỳ từng chất, tuỳ từng enzyme

Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hoá bởi enzyme Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein

Chất hoạt hoá là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động Các chất này

chất hữu cơ Chất hoạt hoá có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp.

d Aûnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng của enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt qua giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ lên quá cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính

Ngược lại, ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế rất mạnh, như khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp

Ơû nhiệt độ thấp (0 – 410C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng

Ơû nhiệt độ sau đó (tuỳ thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 450C), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 –

1000C

Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường

e Aûnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thuỷ phân vì nó ảnh hưởng đến mực độ ion hoá cơ chất, ion hoá enzyme và đến độ bền của protein – enzyme Đa số enzyme bền trong khoản từ pH 5 – 9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như: cơ chất, Coennzyme, Ca2+

Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ

Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepxin, protease acid của vi sinh vật, .) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10.

f Aûnh hưởng của thời gian thuỷ phân

Trong quá trình thuỷ phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ, thời gian thuỷ phản cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết trong quá trình thuỷ phân Khi cơ chất cần thuỷ phân thuỷ phân hết, quá trình thuỷ phân kết thúc Thời gian thuỷ phân thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chât lượng sản phẩm tốt

Trong thực tế, thời gian thuỷ phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thuỷ phân cụ thể

g Aûnh hưởng của lượng nước

Với phản ứng thuỷ phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nước có ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thuỷ phân bởi enzyme Vì thế, nước là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thuỷ phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế các phản ứng do enzyme xúc tác

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 04 năm 2010 đến tháng 05 năm 2010Địa điểm: phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học – Viện Sinh Học Nhiệt Đới

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm