b) Từ thực vật:
2.8.3Tinh sạch enzyme
Để tinh sạch enzyme, người ta thường dùng các kỹ thuật sắc ký. Đây là phương pháp tách liên tục từng vi phân của một hỗn hợp chất do sự phân bố không đồng đều giữa phase tĩnh và phase động khi cho phase động di chuyển xuyên qua phase tĩnh. Dựa vào cơ chế của quá trình phân tách, có nhiều loại sắc ký:
Đặc tính Kỹ thuật
Kích thước Lọc gel hay GF (gel filtration), còn gọi là phân tách theo kích thước
Điện tích Sắc ký trao đổi ion hay IEC (ion exchange chromatography) Kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước hay HIC
(hydrôphbic iteraction chromatography) Sắc ký đảo phase hay RPC (reversed
phase chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của
ligand)
Sắc ký ái lực hay AC (afftinity chromatography)
Lọc gel là kỹ thuật đơn giản nhất trong các loại sắc ký, phân tách các phân tử dựa trên sự khác biệt về kích thước. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách:
a) phân tách nhóm (group seperations): các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hoặc các tạp chất nhỏ, để loại muối hoặc trao đổi điện.
b) phân đoạn các phân tử sinh học với tốc độ phân giải cao (high resolutiion frationation of biomolecules): dùng để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, xác định trọng lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
Sắc ký lọc gel cũng dùng để thực hiện việc gấp cuộn lại các protein biến tính dễ dàng hơn bằng việc kiểm soát cẩn thận sự thay đổi điều kiện của dung dịch đệm
Sắc ký lọc gel khá phù hợp cho các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi của pH, nồng độ ion kim loại hoặc các co – factor và các điều kiện khắc nghiệt. Sự phân tách có thể được thực hiện khi có mặt các ion hoặc các co – factor ở cường độ
cao hoặc thấp, ở 370C hoặc phòng lạnh theo yêu cầu thí nghiệm. Protein tinh sạch có thể được thu nhận trong bất kỳ loại dung dịch đệm nào.
Để phân tách protein bằng sắc ký lọc gel, môi trường gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Đây là chát nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, có tính ổn định về vật lý và hóa học, có tính trơ. Nền nhồi được cân bằng bởi dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng ở bên trong các hạt, được xem như phase động. Trong quá trình phân tách và giải hấp thụ chỉ dùng một loại đệm. Bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy và tiến hành ở thời điểm kết thúc quá trình phân tách cho việc loại bỏ những phân tử còn lưu lại trong cột dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
2.9 Giới thiệu về sự cố định enzyme