Tương tự hút 1ml protein cần phân tích thêm 2ml thuốc thử Bradford, để yên 10 phút đem đo OD tại bước sóng 595nm
Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích (OD595* độ pha loãng của mẫu).
Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm. Cường độ màu của phản ứng tỷ lệ với số lượng liên kết peptid (-CO – NH-) trong chuỗi polypeptide.
Phương pháp biure được sử dụng đối với các mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn (>= vài mg/ml).
b) Thực hành
Nguyên liệu và hoá chất: dung dịch albumin tiêu chuẩn 1% Thuốc thử biure:
CuSO4 1.5g.
Tarkat kilium và natrium 6g.
Nước cất 500ml.
Lắc cho tan, cho thêm vào 300ml dung dịch NaOH 2.5N lắc đều. Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất cho đủ 1000ml.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu nghiên cứu và 4ml thuốc thử biure, lắc đều, để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh. So màu ở bước sóng 540nm. Xác định mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu.
Lập đồ thị chuẩn, lấy sáu ống nghiệm, đánh số từ 1 – 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm như sau:
Bảng 3.2 lập đồ thị chuẩn nồng độ protein STT Protein 1% (ml) H2O (ml) Thuốc thử biure (ml) Nồng độ protein (mg/ml) OD 1 0.0 1.0 4 0 2 0.2 0.8 4 2 3 0.4 0.6 4 4 4 0.6 0.4 4 6 5 0.8 0.2 4 8
6 1.0 0.0 4 10
Lắc đều, để yên các ống nghiệm trongg 30 phút ở nhiệt độ phòng. So màu dung dịch trong các ống ở bước sóng 540nm. Ghi nhận các giá trị mật độ quang.