Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10,20 .., .., ..100 µg/ml dung dịch HCl
Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào 1ml dung dịch Tyrosin đã pha trên. Thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên dung dịch ở 370C trong 20 phút
Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả
Đối với ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0.1M thay cho Tyrosin đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm ghi nhận kết quả
Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 10 trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị OD1 đến OD10. vẽ đồ thị dựa vào sự biến thiên của OD theo nồng độ protease, đồ thị này gọi là đường chuẩn Tyrosin
Xác định hoạt tính enzyme protease
Cho 1ml dung dịch casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 370C trong 10 – 15 phút Cho 1ml dịch chiết enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 370C trong 1 giờ
Cho vào 2ml dung dịch TCA 0.4M để ngưng phản ứng của enzyme
Để yên dung dịch trong 25 phút, lọc dung dịch này qua giấy lọc để loài tủa Hút 1ml dịch lọc
Cho 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào 1ml dịch lọc Thêm vào 1ml thuốc thử Folin
Trộn đều để yên ở 370C trong 20 phút
Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ghi nhận kết quả này là Am.
Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả này là A0.
e) Tính toán
Nguyên tắc: hàm lượng tyrosin được giải phóng do enzyme protease thuỷ phân được tính bằng cách lấy (Am – A0 ) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosin để xác định hoạt độ protease.
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ta lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosin trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0)*F*n*1/100. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – A0)*F*n*1/100*V/m.
[(10/As10 – A0) + (20/As20 – A0) + .. .+ (50/As100 – A0)] F =
10 Trong đó:
Am : độ hấp thu của mẫu
A0 : độ hấp thụ của ống đối chứng
F : hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660 nm trên đường chuẩn.
n : hệ số pha loãng của enzyme 1/100 : hệ số chuyển đổi.
V : thể tích của dung dịch enzyme m : khối lượng chế phẩm enzyme thô.
3.3.4 Xác định hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme
Hoạt tính của dịch chiết enzyme được xác định bởi công thức:
P Trong đó:
HTR : hoạt tính riêng
∑ĐVHT : số đơn vị hoạt tính enzyme/ml CPE P: hàm lượng protein (mg/ml CPE)
3.3.5 Phân tích thành phần nguyên liệu vỏ tôm3.3.5.1. Xác định độ ẩm của vỏ tôm khô 3.3.5.1. Xác định độ ẩm của vỏ tôm khô
a) Thiết bị
Cân phân tích có độ chính xác 10-4 Cốc sứ, Bình hút ẩm
Tủ sấy bằng điện, có khả năng kiểm tra nhiệt độ 1050C