Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng việc cho 3g chitosan vào 100 ml dung dịch acid acetic 1%, sau đó hoà trộn hỗn hợp trên với 2 ml dung dịch enzymê 5%. Dùng ống tiêm cho chảy nhỏ giọt hỗn hợp trên vào 500 ml dung dịch tripolyphosphate (TPP) 3%. Chúng được để qua đêm cho rắn lại và sau đó được rửa hai lần trên màng lọc với nước cất. Dung dịch TPP sau khi rửa được thu thập để xác định hiệu suất nhốt.
Xác định hiệu suất cố định enzyme CiVi - CfVf
CiVi Trong đó:
Ci : là nồng độ ban đầu của protein.
Vi : là thể tích ban đầu của dung dịch protein. Cf : là nồng độ protein trong tổng phần nước lọc ra. Vf : là tổng thể tích của phần nước lọc.
3.3.5 Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease trong chế phẩm enzyme ban đầu enzyme ban đầu
Cân 0.05g chế phẩm enzyme hoà tan trong 5ml dung dịch nước cất, sau đó tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease theo phương pháp Bradford và Amano
3.3.5.1 Xác định hiệu suất hoạt tính enyzme cố định
Hiệu suất hoạt tính enzyme cố định được xác định bởi công thức: E0V0 - EfVf
H = x 100
E0V0 Trong đó:
H : hiệu suất hoạt tính enzyme cố định (%).
E0 : hoạt tính enzyme protease có trong thể tích dùng để cố định (U/ml). V0 : thể tích enzym dùng để cố định (ml).
Ef : hoạt tính của enzyme protease có trong thể tích sau khi cố định (U/ml). Vf : tổng thể tích của phần nước lọc (ml).
3.3.5.2 Xác định hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn enzyme cố định
(C0V0 - CfVf)
P = x 1/1000 (mg/g) Wg
Trong đó:
P : hàm lượng protein
C0 : nồng độ protein của dung dịch enzyme protease trước khi cố định (µg/ml). Cf : nồng độ protein của dung dịch enzyme protease sau khi cố định (µg/ml). V0 : thể tích enzyme trước khi cố định (ml).
Vf : thể tích enzyme sau khi cố định (ml).
Wg: trọng lượng của chất mang gắn enzyme cố định (g)
3.3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme trước và sau cố định định
Chế phẩm enzyme protease ban đầu và enzyme protease cố định được khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính protease bằng phương pháp đã Amano. tuy nhiên chúng tôi giữ nguyên giá trị pH và nồng độ cơ chất casein 1%, chỉ thay đổi giá trị nhiệt độ từ 30 – 800C, mỗi giá trị cách nhau 100C. từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của enzyme protease ban đầu và protease cố định để tìm ra nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xúc tác thuỷ phân của enzyme protease ban đầu và enzyme protease cố định.
3.3.5.4 Khảo sát độ bền nhiệt đối với hoạt tính của enzyme trước và sau cố định
Chế phẩm enzyme protease ban đầu và enzyme protease cố định được khảo sát độ bền nhiệt lên hoạt tính protease bằng phương pháp Amano. tuy nhiên chúng tôi tiến hành ủ enzyme ở nhiệt độ 600C trong các khoảng thời gian 0 phút, 10 phút,
20 phút, .. .., 100 phút. Ơû mỗi khoảng thời gian chúng tôi đem ra làm nguội và xác định hoạt tính theo phương pháp Amano.
Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của enzyme protease ban đầu và enzyme protease cố định để xem ảnh hưởng của thời gian ủ lên hoạt động xúc tác thuỷ phân của enzyme protease ban đầu và enzyme cố định.
3.3.5.5 Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định bằng phương pháp nhốt
Sau khi xác định được nhiệt độ và pH tối ưu của protease cố định, ta tiến hành khảo sát số lần tái sử dụng của protease đã được cố định, thông qua việc xác định hoạt tính theo phương pháp Amano. khi kết thúc thí nghiệm xác định hoạt tính lần 1, rửa lại bằng nước cất và tiếp tục khảo sát hoạt tính lần 2, cứ tiếp tục như thế cho đến khi hoạt tính enzyme protease cố định giảm xuống 50%
Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của enzyme protease cố định theo số lần tái sử dụng, và cũng xác định được khi nào hoạt tính của enzyme protease cố định giảm đi một nữa so với hoạt tính enzyme ban đầu.
Chương 4