Nghiên cứu sự biến đổi hình thái mạch máu tân tạo trong sarcom 180 trước và sau liệu pháp quang động

ĐẶT VẤN ĐỀ Lý do lựa chọn đề tài: Ung thư là một bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao. Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2008 thế giới có khoảng 12,7 triệu ca mắc mới với 7,6 triệu người chết do ung thư. Hiện nay, trên thế giới đang có xu hướng tìm kiếm các phương pháp chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư hiệu quả, trong đó hướng nghiên cứu tạo mạch trong khối u tỏ ra có nhiều triển vọng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy trong khối u có hệ mạch rất phong phú, quá trình tạo mạch diễn ra liên tục, tân tạo mạch có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển dạng, tiến triển và di căn ung thư. Bicknell R. và Giampietro Gasparini (1997) đã tổng kết 18 công trình nghiên cứu định lượng mạch u đối chiếu lâm sàng tiến hành trên 2700 bệnh nhân ung thư đặc ở vú, buồng trứng, đầu cổ, melanoma cho thấy mối liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính tạo mạch u tiên phát với phát triển u tại chỗ và di căn xa. Liệu pháp quang động (Photodynamic Therapy - PDT) là phương pháp mới trong trị liệu ung thư. Được Dougherty T.J. và cộng sự ứng dụng điều trị ung thư lâm sàng tại Hoa Kỳ lần đầu tiên năm 1978, đến nay trị liệu này đã trải qua nhiều giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và bắt đầu ứng dụng trong điều trị nhiều loại ung thư trên người với kết quả khả quan. Tiến hành điều trị quang động trải qua hai giai đoạn chính: trước tiên đưa một lượng thuốc nhạy quang vào cơ thể, sau một thời gian nhất định thuốc sẽ tập trung vào khối u nhiều hơn mô lành, làm cho tế bào trong u nhạy cảm với ánh sáng, sau đó chiếu ánh sáng đơn sắc có bước sóng thích hợp lên vùng u để phá hủy mô ung thư một cách chọn lọc mà không làm tổn hại đến mô lành xung quanh. Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu hệ mạch 1 máu tân tạo trong khối u, đặc biệt là tác dụng ức chế tạo mạch tại u của liệu pháp quang động chưa được nghiên cứu nhiều và hệ thống. Để bổ sung thêm các cơ sở khoa học cho việc triển khai và đánh giá khả năng ứng dụng của PDT trong điều trị các bệnh nhân ung thư ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài nhằm các mục tiêu: 1. Đánh giá mật độ mạch máu tân tạo trong sarcom 180 thực nghiệm ở đùi chuột. 2. Xác định mối liên quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với tiến triển của sarcom 180. 3. Đánh giá hiệu quả ức chế tạo mạch của liệu pháp quang động trong điều trị ung thư thực nghiệm. Ý nghĩa của luận án: - Đây là công trình đầu tiên trong nước nghiên cứu xác định mật độ mạch máu tân tạo tại khối u bằng các dấu ấn đặc hiệu với tế bào nội mô là kháng thể CD31 và CD34 trên tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch. Kết quả nghiên cứu cho thấy đồng thời với sự phát triển của u sarcom 180, hệ thống mạch máu trong u phát triển mạnh, quá trình tạo mạch diễn ra liên tục. - Mật độ mạch máu tân tạo có mối liên quan chặt chẽ với phát triển khối u và di căn các cơ quan gan, lách, phổi. Chính vì vậy, có thể xem định lượng tạo mạch là yếu tố có giá trị trong chẩn đoán giai đoạn và tiên lượng ung thư. Đây cũng là cơ sở khoa học cho việc thử nghiệm các thuốc ức chế tạo mạch điều trị ung thư. - Xác định tác dụng ức chế tạo mạch của PDT và bổ sung cở sở khoa học về cơ chế tổn thương mạch máu khối u sau điều trị quang động, đó là PDT giai đoạn sớm có tác dụng ức chế tạo mạch u theo cơ chế làm tế bào nội mô chết theo chương trình. 2 Cấu trúc luận án: Gồm 4 chương, phần đặt vấn đề (3 trang), tổng quan tài liệu (37 trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (15 trang), kết quả (36 trang), bàn luận (27 trang) và kết luận (2 trang), tài liệu tham khảo (với 186 tài liệu: 9 tài liệu tiếng Việt, 177 tài liệu tiếng Anh). Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Quá trình tạo mạch bình thường và sự hình thành mạch máu tân tạo trong khối u 1.1.1. Quá trình tạo mạch bình thường Hệ thống mạch máu trong thời kỳ bào thai được hình thành từ mạng lưới mạch máu có nguồn gốc từ tiền tế bào nội mô gọi là angioblasts. Quá trình tạo mạch ở người trưởng thành (angiogenesis), trước đây cho rằng được hình thành bằng cách phân nhánh của các mạch máu liền kề, tuy nhiên các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh quá trình tân tạo mạch cũng có thể xảy ra do sự biệt hóa của các tế bào nội mô tiền sinh từ tủy xương. Quá trình tạo mạch đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý, đặc biệt là sự phát triển của tế bào ung thư, đồng thời còn góp phần vào việc cung cấp thông tin cho tuần hoàn liền kề. Chính vì vậy, gần đây nhiều tác giả đang tích cực nghiên cứu nhằm tìm hiểu rõ cơ chế kiểm soát việc hình thành các mạch máu tân tạo. Có hai giả thiết chính về cơ chế tạo mạch là các chất kích thích tạo mạch (gia tăng trong lòng mạch khi cần thiết) và các chất ức chế tạo mạch. Với cơ chế tạo mạch bằng việc huy động từ các tế bào nội mô tiền sinh từ tủy xương, các tế bào nội mô tiền sinh (EPCs) được di chuyển đến khu vực tổn thương hoặc khối u tăng sinh. Cơ chế của quá 3 trình di chuyển chưa được xác định đầy đủ. Tại khu vực này, các EPCs biệt hóa và trưởng thành tạo nên một mạng mao mạch mới bằng cách liên kết với nhau và liên kết với mạch máu liền kề. Trường hợp tân tạo mạch từ mạch máu liền kề, các tế bào nội mô tăng sinh và phát triển và tạo ra các nhú mạch. Với cả 2 cơ chế, lớp vỏ ngoài của mạch máu được hình thành bằng cách huy động từ các tế bào cơ trơn liền kề. 1.1.2. Quá trình tạo mạch trong khối u Theo nghiên cứu của Gasparini và một số tác giả khác, quá trình tạo mạch trong u (tumor angiogenneis) diễn ra về cơ bản giống như sự tân tạo mạch trong các tổ chức khác. Các u đang phát triển đã hình thành nguồn cấp máu ra sao? Một số nghiên cứu đã nhận thấy tạo mạch trong u bị tác động bởi các yếu tố chế tiết. Có nhiều tế bào và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tân tạo mạch trong khối u như tế bào nội mô, tế bào lympho, đại thực bào, dưỡng bào. Các yếu tố tạo mạch khối u do tế bào ung thư tự tiết ra hoặc do các tế bào viêm như đại thực bào, thâm nhiễm vào u. Trong số các yếu tố kích thích tạo mạch u, có 2 yếu tố quan trọng nhất là yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (bFGF) và yếu tố phát triển tế bào nội mô mạch (VEGF). Cả hai chất này đều gắn với proteoglycan ở màng đáy và dễ dàng phóng thích khi màng đáy bị tổn thương. Dù trực tiếp hay gián tiếp những chất này cũng kích thích các tế bào nội mô chế tiết các men proteinases để phân huỷ màng đáy, thúc đẩy các tế bào nội mô tăng sinh và di cư. Các yếu tố tạo mạch còn trực tiếp liên kết với phân tử lamidin của thành mạch để tạo ra các ống mạch mới nhờ sự di cư của các quần thể tế bào nội mô. Các yếu tố khác như yếu tố hoại tử u (TNF- α ) do đại thực bào chế tiết, cũng góp phần nhất định vào quá trình tạo mạch. Quá trình tạo mạch có tính hai chiều đối với sự phát triển u: một mặt đưa chất dinh dưỡng và oxy đến cung cấp cho u, mặt 4 khác các tế bào nội mô mới sinh sẽ kích thích u phát triển do tiết ra các yếu tố phát triển. Hình thái mạch máu trong khối u có nhiều đặc điểm khác biệt so với hình thái mạch máu bình thường. Các mạch máu này không tuân theo quy luật, chia nhánh không đều, tạo nên các nhánh nối động mạch- tĩnh mạch bất thường, không phân chia tuần tự và hầu hết chúng đều có nhiều khe hở. Kết quả là có rất nhiều protein, hồng cầu thoát mạch vào tổ chức, và ngược lại các tế bào u di chuyển vào trong lòng mạch, chúng là cơ sở cho việc hình thành di căn. 1.2. Các liệu pháp ức chế tạo mạch trong khối u Các tế bào ung thư có tốc độ phân chia nhanh chóng, vì vậy các thuốc điều trị ung thư chủ yếu hoạt động theo cơ chế gây độc tế bào kháng lại tăng trưởng của các tế bào u. Tuy nhiên, hóa trị liệu ung thư cũng tiêu diệt các tế bào bình thường, do đó gây ra các tác dụng phụ nặng nề như suy tủy. Hơn nữa, các tế bào u thường có gen không ổn định, dễ đột biến, mặt khác hiệu quả điều trị của thuốc còn phụ thuộc vào loại u và giai đoạn phát triển của u. Chính vì vậy, ngày nay rất khó nghiên cứu tìm kiếm các thuốc gây độc tế bào điều trị ung thư. Sau khi Folkman J. (1970) phát hiện vai trò quan trọng của tân tạo mạch trong quá trình phát triển khối u, nhiều nghiên cứu đã tập trung làm sáng tỏ mối quan hệ chặt chẽ giữa tân tạo mạch với phát triển u và di căn xa. Khi xác định được mối liên hệ chặt chẽ giữa tân tạo mạch với sự phát triển khối u, đặc biệt sau khi cơ chế tạo mạch được làm sáng tỏ, rất nhiều chất ức chế tạo mạch được dùng trong trị liệu ung thư được nghiên cứu và phát triển. Hiện nay có 2 liệu pháp trị liệu ức chế tạo mạch thường sử dụng trong lâm sàng: nhóm trị liệu điều trị ức chế tân tạo mạch và nhóm trị liệu ức chế hệ mạch trong khối u. Phương thức ức chế tạo mạch hiệu quả là ngăn chặn đường dẫn truyền tín hiệu kích thích tạo mạch (như là cạnh 5 tranh thụ cảm thể của yếu tố kích thích tạo mạch). Một số hướng nghiên cứu lại tập trung vào công nghệ kháng thể hoặc công nghệ tế bào đích. Các hướng nghiên cứu này tỏ ra có nhiều triển vọng trong điều trị ung thư, thực tế đã có một số thuốc ức chế tạo mạch đưa vào thực tế điều trị lâm sàng. Với các trị liệu ức chế tạo mạch truyền thống vẫn còn nhiều nghi vấn như: Liệu pháp này có thực sự hiệu quả cho tất cả các loại và giai đoạn phát triển khối u? Trị liệu này có ức chế hoàn toàn phát triển u? Để trả lời những câu hỏi này, hiện nay đang phát triển cách tiếp cận mới trong các liệu pháp ức chế tạo mạch u bằng cách dùng các thuốc tiêu diệt các tế bào nội mô tăng sinh, qua đó ức chế tạo mạch trong u. Các thuốc mới này có triển vọng ức chế hiệu quả khối u phát triển, mặc dù vẫn còn một số tác dụng phụ. Hướng nghiên cứu ức chế hệ mạch tân tạo trong khối u bằng cách tiêu diệt các tế bào nội mô của mạch máu tăng sinh đang được đánh giá là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng trong điều trị ung thư. Trong đó liệu pháp quang động (PDT) với tác dụng ức chế hệ mạch tân tạo trong khối u được xem là một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để điều trị các khối u tại chỗ mà ít có tác dụng phụ. Liệu pháp giải quyết được những hạn chế của hóa trị liệu thông thường, và là hy vọng trong lâm sàng điều trị ung thư hiện nay. 1.3. Phương pháp quang động sử dụng thuốc nhạy quang Radachlorin trong điều trị ung thư Liệu pháp quang động (PDT) được Dougherty và cộng sự ứng dụng đầu tiên trong lâm sàng điều trị ung thư năm 1978 tại Mỹ. Phương pháp điều trị này đã được thử nghiệm lâm sàng qua các giai đoạn I, II và III trên khoảng 60.000 bệnh nhân với kết quả rất khả quan. Cơ chế tác dụng của liệu pháp quang động dựa trên phản ứng quang hoá giữa chất nhạy quang và ánh sáng với sự có mặt của oxy 6 tại mô và tạo ra các oxy singlet ( 1 O 2 ) và một số gốc tự nhiên như superoxyd, hydroxyl gây peroxyt hoá phospholipid của màng cơ bản và phá huỷ cấu trúc tế bào u nơi tập trung thuốc nhạy quang nhiều hơn mô lành liền kề, kết hợp tổn thương thành mạch và tắc mạch do huyết khối gây thiếu máu dẫn đến hoại tử u sau điều trị. Quá trình phá huỷ mạch máu khối u do PDT là nguyên nhân quan trọng thứ hai làm khối u bị phá huỷ. Henderson BW (1985) cắt khối u động vật ngay sau PDT để nuôi cấy và thử nghiệm clon hoá trong ống nghiệm, đã thấy nhiều tế bào u phát triển và clon hoá nhanh. Ngược lại, sau PDT vẫn để nguyên các khối u tại chỗ thì chúng sẽ bị phá huỷ hoàn toàn. Như vậy, sự khác biệt giữa hai kết quả trên là do PDT đã phá huỷ mạch máu gây thiếu máu, thiếu oxy và chất dinh dưỡng dẫn đến hàng loạt tế bào ung thư bị hoại tử. Radachlorin, được Công ty TNHH “RADA-PHARMA”, Cộng hòa Liên bang Nga đăng ký và sản xuất là một trong những chất nhạy quang thế hệ thứ hai, thuộc nhóm chlorin-e 6 tan trong nước, có đặc tính thời gian hấp thu và thải trừ ngắn, hấp thụ ánh sáng ở bước sóng dài 662nm nên làm tăng độ xuyên sâu của PDT. Thuốc hiện được sử dụng nhiều trong lâm sàng PDT hiện nay. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành trên 250 chuột nhắt trắng thuần chủng dòng BALB/c, 6 đến 8 tuần tuổi, trọng lượng từ 20 đến 25 gram. Động vật được chia thành nhóm chứng, các nhóm gây u đơn thuần và các nhóm được PDT sau gây u 7 và 14 ngày. 7 2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị nghiên cứu PDT - Thiết bị laser Diode ML 662 - Thuốc nhạy quang Radachlorin (biệt dược của Chlorin e 6 ) 2.2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu mô bệnh 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tạo mô hình ung thư thực nghiệm sarcom 180 Phương pháp gây ung thư thực nghiệm của Lapis K., Trần Văn Hanh (1979) và Nguyễn Đình Tảo (1982). Tiêm vào điểm giữa mặt ngoài khối cơ đùi mỗi chuột nhắt 5 x 10 6 tế bào sarcom 180. 2.3.2. Phương pháp điều trị quang động khối u sarcom 180 Tiến hành PDT một lần duy nhất trên động vật mang u. Tiêm vào tĩnh mạch đuôi chuột thuốc nhạy quang Radachlorin liều 20 mg/kg thể trọng chuột. Sau 6 giờ tiến hành chiếu laser diode 662 nm toàn bộ u đùi và ra ngoài ranh giới u với mật độ năng lượng trung bình 200 J/cm 2 và mật độ công suất 0,22W/cm 2 . Xác định thời gian chiếu và liều chiếu sáng theo phương pháp của Fingar và CS (1991). 2.3.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô bệnh 2.3.3.1. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm HE: theo kỹ thuật thông thường 2.3.3.2. Phương pháp và kỹ thuật làm mẫu mô động vật cho kính hiển vi điện tử truyền qua. - Sử dụng phương pháp của Hayat MA (1989) - Quan sát sự biến đổi của tế bào nội mô trên các tiêu bản sau PDT 24 giờ đến 48 giờ và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010 của hãng JEOL (Nhật Bản). 2.3.3.3. Phương pháp và kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch - Sử dụng kỹ thuật nhuộm miễn dịch men gián tiếp phức hợp Avidin-Biotin-pero-peroxidase (ABC) với kháng thể thứ nhất là kháng 8 thể đơn dòng đặc hiệu với tế bào nội mô CD31 và CD34 (Hãng BP Pharmigen, Hoa Kỳ). - Phương pháp định lượng mạch máu tân tạo tại khối u: áp dụng phương pháp của Weidner và cộng sự. Theo đó, các tiêu bản đầu tiên được soi ở độ phóng đại thấp (x40) để xác định các điểm nóng tạo mạch (hot spot), sau đưa lên độ phóng đại cao hơn (x400) để đếm mạch. Định lượng mật độ mao mạch trung bình (MVD: meal microvessel profile density) trên tiêu bản trong khối u và vùng cơ lành cạnh u trên 1 đơn vi 0,74 mm 2 bằng cách đếm số lượng mạch máu tại ba điểm nóng tạo mạch và lấy giá trị trung bình. 2.3.4. Quy trình nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu theo các bước quy chuẩn. 2.3.4.1. Nghiên cứu định lượng tạo mạch tại u đùi chuột. - Định lượng mạch máu tân tạo tại khối u trong các nhóm trên tiêu bản u đùi nhuộm hóa mô miễn dịch, sử dụng kháng thể CD31 và CD34. 2.3.4.2. Xác định mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với sự phát triển khối u - Đánh giá sự phát triển khối u đại thể: trọng lượng, thể tích u, các nốt di căn. Đánh giá sự phát triển khối u trên vi thể: mật độ tế bào u. - Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với trọng lượng, thể tích khối u và với mật độ tế bào trong u. - Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với số lượng nốt di căn gan, lách, thận chuột. 2.3.4.3. Nghiên cứu hiệu quả ức chế tạo mạch của liệu pháp quang động trong điều trị ung thư - Đánh giá hiệu quả điều trị của PDT trên đại thể, vi thể. 9 - Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điều trị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 7 ngày. - Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điều trị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 14 ngày. - Đánh giá sự biến đổi của tế bào nội mô và hệ thống mạch máu tân tạo trên tiêu bản siêu cấu trúc ở các thời điểm sau PDT 24 giờ và 48 giờ. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả tạo mô hình u đùi thực nghiệm Sarcom 180 Toàn bộ chuột nhắt trắng BALB/c sau khi được tiêm 5x10 6 tế bào sarcom 180 vào cơ đùi đều thấy xuất hiện khối ung thư phát triển trong cơ đùi. Động vật mang u vào giai đoạn muộn có biểu hiện bỏ ăn, suy kiệt, xù lông, ỉa chảy, liệt chân mang u và một số chết vào khoảng ngày thứ 26 đến 28 sau khi tiêm tế bào ung thư. 3.2. Định lượng mạch máu tân tạo tại khối u đùi chuột Bảng 3.1. Mật độ mạch máu trên một đơn vị diện tích u đùi Stt Giai đoạn Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch P Kháng thể CD 31 (a) Kháng thể CD 34 (b) 1 7 ngày sau gây u 17,9 ± 6,2 16,8 ± 7,7 p 1-2 <0,001 p 2-3 <0,01 2 14 ngày sau gây u 34,5 ± 13,2 30,7 ± 14,2 p 1-3 <0,001 p 2-4 <0,01 3 21 ngày sau gây u 58,2 ± 31,1 53,9 ± 32,5 p 1-4 <0,001 p 3-4 <0,05 4 28 ngày sau gây u 49,6 ± 27,6 46,4 ± 28,5 p a-b >0,05 10 [...]... 7 sau gây u (r1-3 . 7 ngày. - Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điều trị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 14 ngày. - Đánh giá sự biến đổi của tế bào nội mô và hệ thống mạch máu tân tạo trên tiêu. 177 tài liệu tiếng Anh). Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Quá trình tạo mạch bình thường và sự hình thành mạch máu tân tạo trong khối u 1.1.1. Quá trình tạo mạch bình thường Hệ thống mạch máu trong thời. dùng trong trị liệu ung thư được nghiên cứu và phát triển. Hiện nay có 2 liệu pháp trị liệu ức chế tạo mạch thường sử dụng trong lâm sàng: nhóm trị liệu điều trị ức chế tân tạo mạch và nhóm trị liệu ức