Nghiên cứu sự biến đổi hình thái mạch máu tân tạo trong sarcom 180 trước và sau liệu pháp quang động

Theothông báo của Tổ chức Y tế Thế giới WHO, năm 2008 thế giới cókhoảng 12,7 triệu ca mắc mới với 7,6 triệu người chết do ung thư.Hiện nay, trên thế giới đang có xu hướng tìm kiếm các ph

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lý do lựa chọn đề tài:

Ung thư là một bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao Theothông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2008 thế giới cókhoảng 12,7 triệu ca mắc mới với 7,6 triệu người chết do ung thư.Hiện nay, trên thế giới đang có xu hướng tìm kiếm các phương phápchẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư hiệu quả, trong đó hướngnghiên cứu tạo mạch trong khối u tỏ ra có nhiều triển vọng

Các nghiên cứu gần đây cho thấy trong khối u có hệ mạchrất phong phú, quá trình tạo mạch diễn ra liên tục, tân tạo mạch cóvai trò quan trọng trong quá trình chuyển dạng, tiến triển và di cănung thư Bicknell R và Giampietro Gasparini (1997) đã tổng kết 18công trình nghiên cứu định lượng mạch u đối chiếu lâm sàng tiếnhành trên 2700 bệnh nhân ung thư đặc ở vú, buồng trứng, đầu cổ,melanoma cho thấy mối liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính tạo mạch

u tiên phát với phát triển u tại chỗ và di căn xa

Liệu pháp quang động (Photodynamic Therapy - PDT) làphương pháp mới trong trị liệu ung thư Được Dougherty T.J vàcộng sự ứng dụng điều trị ung thư lâm sàng tại Hoa Kỳ lần đầu tiênnăm 1978, đến nay trị liệu này đã trải qua nhiều giai đoạn thửnghiệm lâm sàng và bắt đầu ứng dụng trong điều trị nhiều loại ungthư trên người với kết quả khả quan Tiến hành điều trị quang độngtrải qua hai giai đoạn chính: trước tiên đưa một lượng thuốc nhạyquang vào cơ thể, sau một thời gian nhất định thuốc sẽ tập trung vàokhối u nhiều hơn mô lành, làm cho tế bào trong u nhạy cảm với ánhsáng, sau đó chiếu ánh sáng đơn sắc có bước sóng thích hợp lên vùng

u để phá hủy mô ung thư một cách chọn lọc mà không làm tổn hạiđến mô lành xung quanh Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu hệ mạch

máu tân tạo trong khối u, đặc biệt là tác dụng ức chế tạo mạch tại ucủa liệu pháp quang động chưa được nghiên cứu nhiều và hệ thống.

Để bổ sung thêm các cơ sở khoa học cho việc triển khai và đánh giákhả năng ứng dụng của PDT trong điều trị các bệnh nhân ung thư ởViệt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài nhằm các mục tiêu:

1 Đánh giá mật độ mạch máu tân tạo trong sarcom 180 thực nghiệm ở đùi chuột.

2 Xác định mối liên quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với tiến triển của sarcom 180.

3 Đánh giá hiệu quả ức chế tạo mạch của liệu pháp quang động trong điều trị ung thư thực nghiệm.

Ý nghĩa của luận án:

- Đây là công trình đầu tiên trong nước nghiên cứu xác địnhmật độ mạch máu tân tạo tại khối u bằng các dấu ấn đặc hiệu với tếbào nội mô là kháng thể CD31 và CD34 trên tiêu bản nhuộm hóa mômiễn dịch Kết quả nghiên cứu cho thấy đồng thời với sự phát triểncủa u sarcom 180, hệ thống mạch máu trong u phát triển mạnh, quátrình tạo mạch diễn ra liên tục

- Mật độ mạch máu tân tạo có mối liên quan chặt chẽ vớiphát triển khối u và di căn các cơ quan gan, lách, phổi Chính vì vậy,

có thể xem định lượng tạo mạch là yếu tố có giá trị trong chẩn đoángiai đoạn và tiên lượng ung thư Đây cũng là cơ sở khoa học cho việcthử nghiệm các thuốc ức chế tạo mạch điều trị ung thư

- Xác định tác dụng ức chế tạo mạch của PDT và bổ sung cở

sở khoa học về cơ chế tổn thương mạch máu khối u sau điều trị quangđộng, đó là PDT giai đoạn sớm có tác dụng ức chế tạo mạch u theo cơchế làm tế bào nội mô chết theo chương trình

Cấu trúc luận án: Gồm 4 chương, phần đặt vấn đề (3 trang), tổng

quan tài liệu (37 trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (15trang), kết quả (36 trang), bàn luận (27 trang) và kết luận (2 trang),tài liệu tham khảo (với 186 tài liệu: 9 tài liệu tiếng Việt, 177 tài liệutiếng Anh)

Chương 1

TỔNG QUAN 1.1 Quá trình tạo mạch bình thường và sự hình thành mạch máu tân tạo trong khối u

1.1.1 Quá trình tạo mạch bình thường

Hệ thống mạch máu trong thời kỳ bào thai được hình thành từmạng lưới mạch máu có nguồn gốc từ tiền tế bào nội mô gọi là

angioblasts Quá trình tạo mạch ở người trưởng thành (angiogenesis),

trước đây cho rằng được hình thành bằng cách phân nhánh của cácmạch máu liền kề, tuy nhiên các công trình nghiên cứu gần đây đãchứng minh quá trình tân tạo mạch cũng có thể xảy ra do sự biệt hóa củacác tế bào nội mô tiền sinh từ tủy xương Quá trình tạo mạch đóng vaitrò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý, đặc biệt là sựphát triển của tế bào ung thư, đồng thời còn góp phần vào việc cungcấp thông tin cho tuần hoàn liền kề Chính vì vậy, gần đây nhiều tácgiả đang tích cực nghiên cứu nhằm tìm hiểu rõ cơ chế kiểm soát việchình thành các mạch máu tân tạo Có hai giả thiết chính về cơ chế tạomạch là các chất kích thích tạo mạch (gia tăng trong lòng mạch khicần thiết) và các chất ức chế tạo mạch

Với cơ chế tạo mạch bằng việc huy động từ các tế bào nội môtiền sinh từ tủy xương, các tế bào nội mô tiền sinh (EPCs) được dichuyển đến khu vực tổn thương hoặc khối u tăng sinh Cơ chế của quá

trình di chuyển chưa được xác định đầy đủ Tại khu vực này, các EPCsbiệt hóa và trưởng thành tạo nên một mạng mao mạch mới bằng cáchliên kết với nhau và liên kết với mạch máu liền kề Trường hợp tân tạomạch từ mạch máu liền kề, các tế bào nội mô tăng sinh và phát triển vàtạo ra các nhú mạch Với cả 2 cơ chế, lớp vỏ ngoài của mạch máuđược hình thành bằng cách huy động từ các tế bào cơ trơn liền kề.

1.1.2 Quá trình tạo mạch trong khối u

Theo nghiên cứu của Gasparini và một số tác giả khác, quá

trình tạo mạch trong u (tumor angiogenneis) diễn ra về cơ bản giống

như sự tân tạo mạch trong các tổ chức khác Các u đang phát triển đãhình thành nguồn cấp máu ra sao? Một số nghiên cứu đã nhận thấytạo mạch trong u bị tác động bởi các yếu tố chế tiết Có nhiều tế bào

và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tân tạo mạch trong khối u như

tế bào nội mô, tế bào lympho, đại thực bào, dưỡng bào Các yếu tố

tạo mạch khối u do tế bào ung thư tự tiết ra hoặc do các tế bào viêmnhư đại thực bào, thâm nhiễm vào u Trong số các yếu tố kích thíchtạo mạch u, có 2 yếu tố quan trọng nhất là yếu tố tăng trưởng nguyên

bào sợi (bFGF) và yếu tố phát triển tế bào nội mô mạch (VEGF) Cả hai chất này đều gắn với proteoglycan ở màng đáy và dễ dàng phóng

thích khi màng đáy bị tổn thương Dù trực tiếp hay gián tiếp nhữngchất này cũng kích thích các tế bào nội mô chế tiết các men

proteinases để phân huỷ màng đáy, thúc đẩy các tế bào nội mô tăng

sinh và di cư Các yếu tố tạo mạch còn trực tiếp liên kết với phân tử

lamidin của thành mạch để tạo ra các ống mạch mới nhờ sự di cư của

các quần thể tế bào nội mô Các yếu tố khác như yếu tố hoại tử u

(TNF-α) do đại thực bào chế tiết, cũng góp phần nhất định vào quá

trình tạo mạch Quá trình tạo mạch có tính hai chiều đối với sự pháttriển u: một mặt đưa chất dinh dưỡng và oxy đến cung cấp cho u, mặt

khác các tế bào nội mô mới sinh sẽ kích thích u phát triển do tiết ra cácyếu tố phát triển Hình thái mạch máu trong khối u có nhiều đặc điểmkhác biệt so với hình thái mạch máu bình thường Các mạch máu nàykhông tuân theo quy luật, chia nhánh không đều, tạo nên các nhánhnối động mạch- tĩnh mạch bất thường, không phân chia tuần tự và

hầu hết chúng đều có nhiều khe hở Kết quả là có rất nhiều protein,

hồng cầu thoát mạch vào tổ chức, và ngược lại các tế bào u di chuyểnvào trong lòng mạch, chúng là cơ sở cho việc hình thành di căn

1.2 Các liệu pháp ức chế tạo mạch trong khối u

Các tế bào ung thư có tốc độ phân chia nhanh chóng, vì vậycác thuốc điều trị ung thư chủ yếu hoạt động theo cơ chế gây độc tếbào kháng lại tăng trưởng của các tế bào u Tuy nhiên, hóa trị liệuung thư cũng tiêu diệt các tế bào bình thường, do đó gây ra các tácdụng phụ nặng nề như suy tủy Hơn nữa, các tế bào u thường có genkhông ổn định, dễ đột biến, mặt khác hiệu quả điều trị của thuốc cònphụ thuộc vào loại u và giai đoạn phát triển của u Chính vì vậy,ngày nay rất khó nghiên cứu tìm kiếm các thuốc gây độc tế bào điềutrị ung thư Sau khi Folkman J (1970) phát hiện vai trò quan trọngcủa tân tạo mạch trong quá trình phát triển khối u, nhiều nghiên cứu

đã tập trung làm sáng tỏ mối quan hệ chặt chẽ giữa tân tạo mạch vớiphát triển u và di căn xa Khi xác định được mối liên hệ chặt chẽgiữa tân tạo mạch với sự phát triển khối u, đặc biệt sau khi cơ chế tạomạch được làm sáng tỏ, rất nhiều chất ức chế tạo mạch được dùngtrong trị liệu ung thư được nghiên cứu và phát triển Hiện nay có 2liệu pháp trị liệu ức chế tạo mạch thường sử dụng trong lâm sàng:nhóm trị liệu điều trị ức chế tân tạo mạch và nhóm trị liệu ức chế hệ

mạch trong khối u. Phương thức ức chế tạo mạch hiệu quả là ngănchặn đường dẫn truyền tín hiệu kích thích tạo mạch (như là cạnh

tranh thụ cảm thể của yếu tố kích thích tạo mạch) Một số hướngnghiên cứu lại tập trung vào công nghệ kháng thể hoặc công nghệ tếbào đích Các hướng nghiên cứu này tỏ ra có nhiều triển vọng trongđiều trị ung thư, thực tế đã có một số thuốc ức chế tạo mạch đưa vàothực tế điều trị lâm sàng Với các trị liệu ức chế tạo mạch truyềnthống vẫn còn nhiều nghi vấn như: Liệu pháp này có thực sự hiệuquả cho tất cả các loại và giai đoạn phát triển khối u? Trị liệu này có

ức chế hoàn toàn phát triển u? Để trả lời những câu hỏi này, hiện nayđang phát triển cách tiếp cận mới trong các liệu pháp ức chế tạomạch u bằng cách dùng các thuốc tiêu diệt các tế bào nội mô tăngsinh, qua đó ức chế tạo mạch trong u Các thuốc mới này có triểnvọng ức chế hiệu quả khối u phát triển, mặc dù vẫn còn một số tácdụng phụ Hướng nghiên cứu ức chế hệ mạch tân tạo trong khối ubằng cách tiêu diệt các tế bào nội mô của mạch máu tăng sinh đangđược đánh giá là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng trong điều trịung thư Trong đó liệu pháp quang động (PDT) với tác dụng ức chế

hệ mạch tân tạo trong khối u được xem là một trong những phươngpháp hữu hiệu nhất để điều trị các khối u tại chỗ mà ít có tác dụngphụ Liệu pháp giải quyết được những hạn chế của hóa trị liệu thôngthường, và là hy vọng trong lâm sàng điều trị ung thư hiện nay.

1.3 Phương pháp quang động sử dụng thuốc nhạy quang Radachlorin trong điều trị ung thư

Liệu pháp quang động (PDT) được Dougherty và cộng sựứng dụng đầu tiên trong lâm sàng điều trị ung thư năm 1978 tại Mỹ.Phương pháp điều trị này đã được thử nghiệm lâm sàng qua các giaiđoạn I, II và III trên khoảng 60.000 bệnh nhân với kết quả rất khảquan Cơ chế tác dụng của liệu pháp quang động dựa trên phản ứngquang hoá giữa chất nhạy quang và ánh sáng với sự có mặt của oxy

tại mô và tạo ra các oxy singlet (1O2) và một số gốc tự nhiên như

superoxyd, hydroxyl gây peroxyt hoá phospholipid của màng cơ bản

và phá huỷ cấu trúc tế bào u nơi tập trung thuốc nhạy quang nhiềuhơn mô lành liền kề, kết hợp tổn thương thành mạch và tắc mạch dohuyết khối gây thiếu máu dẫn đến hoại tử u sau điều trị Quá trìnhphá huỷ mạch máu khối u do PDT là nguyên nhân quan trọng thứ hailàm khối u bị phá huỷ Henderson BW (1985) cắt khối u động vậtngay sau PDT để nuôi cấy và thử nghiệm clon hoá trong ống nghiệm,

đã thấy nhiều tế bào u phát triển và clon hoá nhanh Ngược lại, sauPDT vẫn để nguyên các khối u tại chỗ thì chúng sẽ bị phá huỷ hoàntoàn Như vậy, sự khác biệt giữa hai kết quả trên là do PDT đã phá huỷmạch máu gây thiếu máu, thiếu oxy và chất dinh dưỡng dẫn đến hàngloạt tế bào ung thư bị hoại tử

Radachlorin, được Công ty TNHH “RADA-PHARMA”,Cộng hòa Liên bang Nga đăng ký và sản xuất là một trong nhữngchất nhạy quang thế hệ thứ hai, thuộc nhóm chlorin-e6 tan trongnước, có đặc tính thời gian hấp thu và thải trừ ngắn, hấp thụ ánh sáng

ở bước sóng dài 662nm nên làm tăng độ xuyên sâu của PDT Thuốchiện được sử dụng nhiều trong lâm sàng PDT hiện nay

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 250 chuột nhắt trắng thuầnchủng dòng BALB/c, 6 đến 8 tuần tuổi, trọng lượng từ 20 đến 25gram Động vật được chia thành nhóm chứng, các nhóm gây u đơnthuần và các nhóm được PDT sau gây u 7 và 14 ngày

2.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị nghiên cứu PDT

- Thiết bị laser Diode ML 662

- Thuốc nhạy quang Radachlorin (biệt dược của Chlorin e6)

2.2.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu mô bệnh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tạo mô hình ung thư thực nghiệm sarcom 180

Phương pháp gây ung thư thực nghiệm của Lapis K., TrầnVăn Hanh (1979) và Nguyễn Đình Tảo (1982) Tiêm vào điểm giữamặt ngoài khối cơ đùi mỗi chuột nhắt 5 x 106tế bào sarcom 180

2.3.2 Phương pháp điều trị quang động khối u sarcom 180

Tiến hành PDT một lần duy nhất trên động vật mang u Tiêmvào tĩnh mạch đuôi chuột thuốc nhạy quang Radachlorin liều 20

mg/kg thể trọng chuột Sau 6 giờ tiến hành chiếu laser diode 662 nm

toàn bộ u đùi và ra ngoài ranh giới u với mật độ năng lượng trung bình

200 J/cm2 và mật độ công suất 0,22W/cm2 Xác định thời gian chiếu

và liều chiếu sáng theo phương pháp của Fingar và CS (1991)

2.3.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô bệnh

2.3.3.1 Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm HE: theo kỹ thuật thông thường 2.3.3.2 Phương pháp và kỹ thuật làm mẫu mô động vật cho kính hiển vi điện tử truyền qua.

- Sử dụng phương pháp của Hayat MA (1989)

- Quan sát sự biến đổi của tế bào nội mô trên các tiêu bảnsau PDT 24 giờ đến 48 giờ và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tửtruyền qua JEM 1010 của hãng JEOL (Nhật Bản)

2.3.3.3 Phương pháp và kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch

- Sử dụng kỹ thuật nhuộm miễn dịch men gián tiếp phức hợp

Avidin-Biotin-pero-peroxidase (ABC) với kháng thể thứ nhất là kháng

thể đơn dòng đặc hiệu với tế bào nội mô CD31 và CD34 (Hãng BPPharmigen, Hoa Kỳ)

- Phương pháp định lượng mạch máu tân tạo tại khối u: ápdụng phương pháp của Weidner và cộng sự Theo đó, các tiêu bảnđầu tiên được soi ở độ phóng đại thấp (x40) để xác định các điểm

nóng tạo mạch (hot spot), sau đưa lên độ phóng đại cao hơn (x400)

để đếm mạch Định lượng mật độ mao mạch trung bình (MVD: meal microvessel profile density) trên tiêu bản trong khối u và vùng cơ

lành cạnh u trên 1 đơn vi 0,74 mm2 bằng cách đếm số lượng mạchmáu tại ba điểm nóng tạo mạch và lấy giá trị trung bình

2.3.4 Quy trình nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu theo các bước quy chuẩn

2.3.4.1 Nghiên cứu định lượng tạo mạch tại u đùi chuột.

- Định lượng mạch máu tân tạo tại khối u trong các nhóm

trên tiêu bản u đùi nhuộm hóa mô miễn dịch, sử dụng kháng thểCD31 và CD34

2.3.4.2 Xác định mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với sự phát triển khối u

- Đánh giá sự phát triển khối u đại thể: trọng lượng, thể tích

u, các nốt di căn Đánh giá sự phát triển khối u trên vi thể: mật độ tếbào u

- Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa định lượng tạomạch với trọng lượng, thể tích khối u và với mật độ tế bào trong u

- Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa định lượng tạomạch với số lượng nốt di căn gan, lách, thận chuột

2.3.4.3 Nghiên cứu hiệu quả ức chế tạo mạch của liệu pháp quang động trong điều trị ung thư

- Đánh giá hiệu quả điều trị của PDT trên đại thể, vi thể

- Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điềutrị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 7 ngày.

- Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điềutrị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 14 ngày

- Đánh giá sự biến đổi của tế bào nội mô và hệ thống mạchmáu tân tạo trên tiêu bản siêu cấu trúc ở các thời điểm sau PDT 24giờ và 48 giờ

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả tạo mô hình u đùi thực nghiệm Sarcom 180

Toàn bộ chuột nhắt trắng BALB/c sau khi được tiêm 5x106 tếbào sarcom 180 vào cơ đùi đều thấy xuất hiện khối ung thư phát triểntrong cơ đùi Động vật mang u vào giai đoạn muộn có biểu hiện bỏ

ăn, suy kiệt, xù lông, ỉa chảy, liệt chân mang u và một số chết vàokhoảng ngày thứ 26 đến 28 sau khi tiêm tế bào ung thư

3.2 Định lượng mạch máu tân tạo tại khối u đùi chuột

Bảng 3.1 Mật độ mạch máu trên một đơn vị diện tích u đùi

Stt Giai đoạn

Phương pháp nhuộm hóa

mô miễn dịch

PKháng thể

Kết quả cho thấy, mật độ mạch máu trên một đơn vị diệntích tại u đùi tăng ở giai đoạn sớm của u, mức độ tăng cao nhất vàongày thứ 14 và 21 sau gây u Số lượng mạch máu có phần giảmxuống ở ngày thứ 28 sau gây u Không có sự khác biệt giữa mật độmạch máu tân tạo tại khối u cùng một thời điểm giữa phương phápnhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể CD31 và CD34.

3.2 Mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với sự phát triển u

3.2.1 Mối tương quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với thể tích u

Bảng 3.2 Mối liên quan giữa tạo mạch với thể tích khối u

Nhóm NC

(n = 20)

MDV với CD31 (1)

MDV vớiCD34 (2)

gây u 34,5 ± 13,2 30,7 ± 14,2 682±139 0,51 0,53Ngày 21 sau

gây u 58,2 ± 31,1 53,9 ± 32,5 1678±412 0,37 0,39Ngày 28 sau

gây u 49,6 ± 27,6 46,4 ± 28,5 2361±689 0,28 0,25Qua bảng 3.2 cho thấy mối tương quan thuận, chặt chẽ giữamật độ mạch máu trên một đơn vị diện tích tại khối u trên tiêu bảnnhuộm hóa mô miễn dịch với thể tích khối u đùi ở các giai đoạn saugây u ngày thứ 7, 14, 21 (r>0,33) Tuy nhiên không nhận thấy mốitương quan giữa hai đại lượng này ở ngày thứ 28 (r<0,33)

3.2.2 Mối liên quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với mật độ tế bào u

Bảng 3.3 Mối liên quan giữa tạo mạch với mật độ tế bào u

Nhóm NC MDV với MDV với Mật độ tế bào Hệ số TQ