(Luận văn) nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rnai kháng đồng thời smv và bymv

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGÂN lu an NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ CHUYỂN GEN n va MANG CẤU TRÚC RNAi KHÁNG ĐỒNG THỜI SMV VÀ BYMV p ie gh tn to w d oa nl LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC an lu Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 ll u nf va oi m z at nh Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 4/2015 si Thái Nguyên - 8/ 2014 ac th http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mâ ̣u Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác lu an Thái Nguyên, ngày 10 tháng năm 2015 va n Tác giả p ie gh tn to w d oa nl Nguyễn Thi Phương Ngân ̣ u nf va an lu Cán bộ hướng dẫn khoa học ll Ban chủ nhiê ̣m khoa oi m z at nh z m co l gm @ GS.TS Chu Hoàng Mâ ̣u an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện để tơi hồn thành Bản l ̣n văn tha ̣c si ̃ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn Ban chủ nhiê ̣m khoa và các thầy cô khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành đề tài luận văn lu an Tôi xin cảm ơn cán bơ ̣ Phịng ADN ứng du ̣ng, Phịng thí nghiệm va n Trọng điểm cơng nghệ gen, Viêṇ Công nghê ̣ sinh ho ̣c, Viêṇ Hàn lâm Khoa tn to học Công nghê ̣ Viê ̣t Nam ta ̣o điề u kiêṇ và giúp đỡ quá trình Tơi xin cảm ơn Tiến sỹ Lị Thị Mai Thu Thạc sĩ Lê Thị Hồng p ie gh tiế n hành thí nghiê ̣m của đề tài nl w giúp đỡ trình thực hiêṇ đề tài luận văn d oa Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học an lu của Bộ môn Di truyề n & Sinh học hiê ̣n đại, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiê ̣p, ll u nf va trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên m oi Tác giả z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii lu MỞ ĐẦU…………………………………………………………… an n va Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… tn to 1.1 SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC ie gh VIRUS p 1.1.1 Bệnh khảm ở đậu tương nl w 1.1.2 Hệ gen SMV, BYMV Potyvirrus d oa 1.2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ an lu CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS 11 va 1.2.1 Cây thuốc và bệnh virus thuốc 11 ll u nf 1.2.2 Cơ chế RNA interference (RNAi) 14 oi m 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng z at nh virus 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍ CH CÂY 18 z CHUYỂN GEN 16 @ Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU l gm 22 m co 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI 22 ̣ 2.1.1 Vật liệu 22 an Lu 2.1.2 Hóa chất 22 http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si iv 2.1.3 Thiết bị 22 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 23 2.2.2 Phân tích sự có mặt cấu trúc chuyển gen pK7GW/SMVBYMV-CPi phương pháp PCR………………………………… 26 2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo SMV BYMV vào lá thuố c …… 28 lu an 2.2.4 Phân tích số lượng virus thuốc chuyển n va gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) kỹ thuâ ̣t Real time RT- 29 tn to PCR………………………………………………………………… Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ie gh 30 p 3.1 KẾT QUẢ CHUYỂN CẤU TRÚ C pK7GW/SMV-BYMV-CPi nl w VÀO THUỐC LÁ 30 d oa 3.1.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumeffaciens cảm ứng tạo 30 an lu cu ̣m chồi u nf va 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyể n gen hoàn chỉnh …………… 33 ll 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍ CH CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 35 m oi 3.2.1 Kết kiểm tra cấ u trúc RNAi dòng thuốc z at nh chuyển gen 35 z 3.2.2 Phân tích khả kháng virus các dòng chuyển gen @ gm CPi (SMV-BYMV) điề u kiêṇ lây nhiễm nhân tạo 36 m co l KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI…………………………………… ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 40 41 an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV Bean Golden Mosaic Virus BYMV Bean yellow mosaic virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) lu AS an n va tn to Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ie gh CTAB Cộng sự p cs d oa Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid lu Deoxyribo Nucleic Acid va an DNA nl EDTA Đối chứng w ĐC Gibberellic acid GM Môi trường tạo chồi hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base ll u nf GA3 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si v Luria and Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường rễ RNAi RNA interference siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus T0, T6, T12 Các dòng thuốc chuyển gen TAE Tris Acetate EDTA lu LB an n va tn to Thermus aquaticus ie gh Taq Virulence Region p Vir Cây thuốc không chuyển gen d oa nl w WT1, WT2, WT3 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh in vitro………… 24 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số…………… 26 Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của că ̣p mồ i PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n Cpi 28 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen lu an 28 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 31 n va Cpi tn to gh Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh lá……………………………… 33 p ie w Bảng 3.3 Kế t quả tạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối nl chứng………………………………………………………………… d oa 34 lu an Bảng 3.4 Kết định lượng sự có mặt virus SMV va thuốc chuyển gen………………………………………………… ll u nf 39 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lá đậu tương bị nhiễm SMV .5 Hình 1.2 Sơ đờ cấu trúc hệ protein potyvirus Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) 11 Hình 1.4 Cây thuốc giống C9-1 11 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động RNAi 15 Hin ̀ h 3.1 Các mảnh được ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hơ ̣p 31 lu an Hình 3.2 Hình ảnh phát sinh cu ̣m chồ i .32 va n Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc 34 ie gh tn to Hin ̀ h 3.4 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế ̣ T0 trồ ng châ ̣u nhà lưới 35 p Hình 3.5 Kế t quả điện di kiể m tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyể n gen 35 w d oa nl Hình 3.6 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n CPi (SMV-BYMV) từ 21 dòng thuốc chuyể n gen 36 lu va an Hin ̀ h 3.7 Hình ảnh mô ̣t số dòng thuố c lá chuyể n gen và đớ i chứng .37 ll u nf Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoa ̣n cDNA từ mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR .38 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng cạn có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao Hạt đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc Ngoài sản phẩm khơ dầu đậu tương cịn được dùng làm mực in, sơn, xà phòng, chất dẻo, thuốc trừ sâu Hạt đậu tương được dùng nhiều y học, giúp tránh hiện tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già; hạn chế bệnh loãng xương ở phụ lu an nữ; bệnh đái tháo đường, thấp khớp Ngoài đậu tương trồng ngắn n va ngày, thích hợp cho luân canh, xen canh gối vụ với nhiều loại khác tn to cải tạo đất tốt [4] Việt Nam nước nơng nghiệp, đậu ie gh tương trồng chủ đạo Mặc dù bắt đầu tiến p hành sản xuất quy mô công nghiệp từ năm 2011 Việt Nam vẫn nl w tiếp tục phải nhập phần lớn lượng bột đậu tương nhằm bù đắp sự thiếu oa hụt thực phẩm protein nước đáp ứng nhu cầu ngày tăng d ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Năng suất lu va an sản lượng đậu tương nước ta ở mức thấp có thể nguyên u nf nhân như: Nhiều giống hiện trồng suất tính ổn ll định chưa cao, sức biến động lớn miền, vùng; Khả m oi kháng virus sâu bệnh giống đậu tương trồng thấp; Chưa z at nh có dự báo thời vụ gieo trồng thích hợp cho vùng z Đậu tương số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, @ l gm ví dụ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng ở đậu tương (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá, bệnh gỉ sắt hại m co đậu tương nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) an Lu nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctonia solani http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 33 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh Cấu trúc RNAi Số mẫu Tổng số Số chồi Tỉ lệ tạo tạo chồi chồi trung chồi (%) bình/mảnh pK7GW-CPi (SMV- BYMV) ĐC0 25 64 2,62 62,5 - - - - ĐC1 38 102 2,7 95,0 lu an Bảng 3.2 cho thấ y 95% mảnh lô đố i chứng ĐC1 không chuyển gen thu n va được chồi, với tỉ lệ trung bình 2,7 chồi/mảnh Số lượng mẫu tạo chồi trung tn to bình ở lơ chủn gen 25 số chồi trung bình 2,62 chồi/mảnh Như vậy, có sự gh khác số lượng mảnh có cảm ứng môi trường chọn lọc, p ie tỉ lệ tạo chồi khác không đáng kể lô chuyển gen lô không chuyển nl w gen d oa 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyể n gen hoàn chỉnh an lu Tạo rễ khâu cuối ni cấy in vitro có ý nghĩa quan u nf va trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Những nghiên cứu tái sinh chuyển gen thuốc ghi nhận IBA, NAA IAA hormone ll oi m sinh trưởng được lựa chọn nghiên cứu tạo rễ bổ sung IBA 0,0001g/l z at nh Nồng độ chất điều khiển sinh trưởng dao động khoảng 0,1 mg/l Cụm chồi tuần tuổi có chiều cao 1cm được tách nhỏ chuyển sang môi z trường tạo rễ Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết chồi @ l gm (Hình 3.3 Bảng 3.3) Các chồi phát triển xanh tốt tạo nhiều mới Quan sát thấy chồi không chuyển gen môi trường đối chứng có m co q trình tạo rễ tương tự an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 34 lu an n va Bảng 3.3 Kế t quả tạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng p ie gh tn to Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc w Số sống sót Số rễ Số bầu đất Số trồng nhà lưới 64 40 35 25 25 - - 40 25 d oa nl Cấu trúc RNAi Số chồi tạo thành lu ĐC0 u nf BYMV) va an pK7GW-CPi (SMV- ĐC1 102 - ll - oi m 80 z at nh 87 z @ gm Bảng 3.3 cho thấ y với tổng số chồi ở lô thí nghiê ̣m thu đươ ̣c 40 m co l số ng sót và có 35 rễ; bầ u 25 và đem trồ ng ta ̣i nhà lưới Ở lô đố i chứng có 87 số ng, 80 rễ, cho bầ u 40 và đem trồ ng 25 an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 35 Những thuố c lá chuyể n gen trồ ng ở nhà lưới biểu hiện xanh tốt, mập mạp (Hình 3.4) lu an n va Hin ̀ h 3.4 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế ̣ T0 trồ ng châ ̣u tn to nhà lưới p ie gh 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍ CH CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN oa nl gen w 3.2.1 Kết kiểm tra cấ u trúc RNAi dòng thuốc chuyển d Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới được lu va an khoảng 3-4 tuần tiến hành thu tách chiế t DNA tổ ng số và thực hiện phản ll u nf ứng PCR kiểm tra sự có mặt đoa ̣n gen chuyển CPi oi m Từ mẫu non 21 dòng thuốc chuyển gen ở hệ T0 trồng z at nh nhà lưới sau - tuần DNA tổng số được tách chiế t điện di z gel agarose 0,8%, kế t quả đươ ̣c thể hiê ̣n ở hiǹ h 3.5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 gm @ m co l  an Lu Hình 3.5 Kế t quả điện di kiể m tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyể n gen (1-21: Băng DNA của 21 dòng thuốc chuyể n gen) http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 36 PCR đươ ̣c thực hiêṇ với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R và kết điện di sản phẩm PCR gel agarose hình 3.6 cho thấy, tất 21 dịng dương tính với phản ứng PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 500 bp, tương tự kết ở mẫu đối chứng dương Kích thước hồn tồn phù hợp với kích thước của cấ u trúc CPi (SMV-BYMV) Vì vậy, có thể khẳng định cấu trúc CPi (SMV-BYMV) được chuyển thành công vào thuốc giố ng C9-1 lu (+) (-) M 10 11 12 13 14 M 15 an 500 bp 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 500 bp n va gh tn to Hình 3.6 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n CPi (SMV- p ie BYMV) từ 21 dòng thuốc chuyể n gen w 1-21: 21 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GW-CPi oa nl (SMV-BYMV); (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ d thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) u nf va an lu ll 3.2.2 Phân tích khả kháng virus các dòng chuyển gen CPi oi m (SMV-BYMV) điề u kiêṇ lây nhiễm nhân ta ̣o z at nh Để kiểm tra tính kháng virus khảm lá , 21 dòng thuốc chuyển gen dương tính với PCR 10 dịng đối chứng khơng chủ n gen được lây z gm @ nhiễm bằ ng dich ̣ chứ a SMV và BYMV qua ba lần, lần cách 15 ngày Sau lần lây nhiễm, dòng thuốc được quan sát sự biểu hiện l m co bê ̣nh khảm Kế t quả đã xá c đinh ̣ đươ ̣c dòng thuố c lá kháng bê ̣nh, an Lu dòng nhiễm bê ̣nh và các đố i chứng không chuyể n gen Những đối chứng các dòng chuyể n gen nhiễm bệnh nhiễm hai loài SMV và http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 37 BYMV biể u hiêṇ có bị khảm và xoăn, còi cọc sinh trưởng Trong đó, dịng kháng hoàn toàn vẫn sinh trưởng phát triển bình thường, xanh tốt (Hình 3.7) Như vậy, phương pháp lây nhiễm nhân ta ̣o SMV và BYMV nguồn nhiễm bệnh khảm có thể áp dụng tốt để đánh giá khả kháng cho dòng thuốc chuyển cấu trúc CPi (SMVBYMV) lu an va n T 05 T 012 T 019 p ie gh tn to oa nl w WT1 WT2 WT3 d Hin ̀ h 3.7 Hình ảnh mơ ̣t sớ dòng th́ c lá chuyể n gen và đố i chứng an lu va T05, T012, T019- Dòng thuố c lá chuyể n gen; WT1, WT2, WT3- Cây thuố c lá không ll u nf chuyể n gen oi m z at nh Số lượng virus SMV các dòng thuốc chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) không chuyển gen (WT) đươ ̣c z kiể m tra bằ ng phản ứng Real time RT- PCR Sử du ̣ng của dòng thuốc @ l gm chủn gen khơng có triệu chứng bệnh là T05, T012; T019 thuốc khơng chủn gen có triệu chứng bệnh nặng là WT1, WT2, WT3 ở lần lây m co nhiễm nhân tạo thứ làm vật liệu cho phản ứng Real time RT-PCR an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 38 RNA tổng số được tách từ 1g thuốc lá, sau sử dụng µg RNA tổng số cho phản ứng tổng hợp cDNA Đường chuẩn được xây dựng từ phản ứng có số lượng tế bào E coli mang vector pBT-SMV tái tổ hợp được xác định buồng đếm tế bào Hàm lượng DNA mẫu chuẩn có hàm lượng tương ứng là: 1000, 100 10 DNA/µl (1 tế bào tương ứng với sao) Phương trình đường chuẩn được dựng dựa phản ứng Real time RT- PCR với cặp mồi SMVqF/SMVqR, phương trình đường chuẩn tuyến tính để xác định số DNA theo chu kỳ ngưỡng được lập có dạng: lu Y= -168,15x + 4202,7 R2 = 0,898 an n va p ie gh tn to d oa nl w an lu ll u nf va Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoa ̣n cDNA từ mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR oi m z at nh Từ kết ở hình 3.8, số liệu chu kỳ ngưỡng phát hiện virus SMV lượng sao/1 g thuốc được trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4 cho thấy, z virus SMV có mặt ở mẫu thuốc chuyển gen không chuyển @ gm gen sau lây nhiễm virus nhân tạo Trong không chuyển gen số lượng m co l SMV trung bình 810 cao 1,93 lần so với chuyển gen (trung bình 418,67 sao) Do sự hoạt động cấu trúc an Lu pK7GW-CPi (SMV-BYMV) có mặt hệ gen SMV bị phân http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 39 hủy theo RNAi số lượng SMV thuốc chuyển gen thấp Tuy nhiên, chuyển gen số lượng SMV khác nhau, dòng T01 có 386 sao, T02 lên tới 466 sao, T03 có 404 Như vậy, mức độ biể u hiê ̣n của tính kháng bệnh ở các dòng chuyể n gen có sự khác Kế t quả phân tích Real time PCR đã cho thấ y cấ u trúc RNAi CPi(SMV-BYMV) đã biể u hiê ̣n tăng cường tính kháng SMV ở các dòng thuố c lá chuyể n gen lu Bảng 3.4 Kết định lượng sự có mặt virus SMV thuốc chuyển gen n va p ie gh tn to Số bản copy/1 g (-) 28.68 - WT1 20.66 729 WT2 19.66 897 WT3 20.21 804 T01 22.70 386 T02 22.22 466 T03 22.59 404 19.52 1000 w CP nl an Tên mẫu va an 23.21 100 25.65 10 ll u nf 100x lu 10x d oa 1x Trung bin ̀ h 810,00 418,67 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ Kế t luâ ̣n 1.2 Cấu trúc RNAi pK7GW-SMV-BYMV-CPi đã đươ ̣c chuyể n thành công vào mô lá thuố c lá giống C9-1 thông qua lây nhiễm A tumefaciens 1.3 Phân tích các dòng th́ c lá chuyể n gen đã xác đinh ̣ đươ ̣c 21/21 dòng thuố c chuyể n gen ở thế ̣ T0 dương tiń h với phản ứng PCR 1.4 Các dòng thuốc chuyển gen và WT đã đươ ̣c lây nhiễm nhân ta ̣o lu virus khảm, kỹ thuâ ̣t Real time RT-PCR đã xác đinh ̣ đươ ̣c WT an n va số lượng SMV cao 1,93 lần so với chuyển gen Như dòng thuốc lá chuyển gen p ie gh tn to cấ u trúc CPi (SMV-BYMV) biểu hiện tăng cường tính kháng SMV ở các nl w Đề nghi ̣ d oa Tiếp tu ̣c theo dõi, phân tích và đánh giá tính kháng với SMV của các ll u nf va an lu dòng thuố c chuyể n gen ở các ̣ sau oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Thị Bản, Đào Đức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học 2007 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển lu an gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc n va vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 tn to Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị gh Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp p ie Trần Quốc Dung, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Cơng nghệ w chuyển gen, Nxb Đại học Sư phạm, Huế oa nl Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê d Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011), Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh lu u nf Nam: 316 – 326 va an đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt ll Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình m oi (2004), Đánh giá tính đa dạng dịng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ z at nh Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố z protein vỏ (CP)”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4):451-459 gm @ Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, Nxb Nông l nghiệp http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu Nghiệp Hà Nội m co Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình Bệnh chun khoa Đại học Nơng ac th si 42 10 Chu Hoàng Mậu, Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên năm 2008 11 Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn bệnh virus hại trồng, Nxb Giáo dục 12 Nguyễn Đức Thành (2008), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Cơng nghệ 13 Lị Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Đặc điểm đoạn gen mã hóa coat protein phân lâ ̣p từ lu Soybean Mosaic Virus Tạp chí sinh học 36 (1se), tr 283-292 an 14 Lị Thị Mai Thu, Lê Hờ ng Trang, Chu Hồng Hà, Chu Hoàng Mậu va n (2014) Nghiên cứu ta ̣o đậu tương chuyển gen kháng soybean mosaic gh tn to virus và bean yellow mosaic virus Tạp chí khoa học & Công nghê ̣- Đại học ie Thái Nguyên, 115 (02), tr 111-115 p 15 Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996 Trồng chế biên thuốc nl w NXB T/p Hơ Chí Minh d oa 16 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt u nf va 275 an lu gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265TÀI LIỆU TIẾNG ANH ll oi m 17 Afanasiev M M., Morris H E (1952), “Bean Virus (yellow) on z at nh Great Northern bean in Montana”, Phytopathology, 42, pp 101-104 18 Atreya, C.D., Raccah, B., and Pirone, T.P 1990 A point mutation in z the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus Virology 178: @ gm 161-165 m co l 19 Atreya, P.L., Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1991 Amino acid substitution in the coat protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus Proc Natl http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu Acad Sci USA 88:7887-7891 ac th si 43 20 Atreya, P.L., Lopez-Moya, J J., Chu, M Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1995 Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involved in potyvirus transmis sion J Gen Virol 76:265-270 21 Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall, l.,Arya N., Patel H.R.H 2005 Basic principles of real – time quantitative PCR Expert Rev Mol Diagn.,5:1-11 22 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 356-63 23 Bubner B., Gase K., Baldwin I T (2004), “Two - fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by lu real - time PCR”, BMC Biotechnology, 4, pp 4-14 an n va 24 Bustin S.A., Nolan T.2004 Pìfalls of quantitative real – time ReverseBiomolecular tn to transcription Polymerase Chain Reaction Joiurnal of Techniques 15:155-166 gh p ie 25 Brunt A A., Crabtree K., Dallwitz M J., Gibbs A J., Watson L., Zurcher E J (2003), Plant Viruses Online, Descriptions and Lists from nl w the VIDE Database Version: 20th August 1996 transcriptionnal gene d oa 26 Chicas., Macino, 2001 Charateristics of post- an lu silencing EMBO (11): 992-6 va 27 Dahmer M L., Hildebrand D F., Collin, G B (1992), “Comparative ll u nf protein accumulation patterns in soybean somatic and zygotic embryos”, In m Vitro Cell Dev Biol, 28, pp 106–114 oi 28 DeCleene M., DeLey J (1976), “The host range of crown gall”, Bot Rev z at nh pp 389–466 z 29 Di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin @ RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for gm l efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 989- m co 94 coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 30 Gal-On, A., Antignus, Y., Rosner, A., Raccah, B 1992 A zucchini an Lu yellow mosaic virus coat protein gene mutations restores aphid http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 44 transmissibilty but has no effect on multiplication J Gen Virol 73:21832187 31 Gibbs A., Harrison B.(1976), Plant virology the principles, Edward Amold 32 Gough K H., Shukla D D (1992), “Major sequence variations in the N - terminal region of the capsid protein of a severe strain of passion fruit woodiness potyvirus”, Arch Virol., 124, pp 389-396 33 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999), “Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition”, The American Phytopathological lu an Society Press, Minnesota, USA n va 34 Hartman G L., West E D., Herman, T K (2011), “Crops that feed the pathogens and pests”, Food Sec., 3, pp 5–17 gh tn to World Soybean-worldwide production, use and constraints caused by p ie 35 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987), “Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and nl w seed quality”, Plant Disease, 71, pp 237-239 d oa 36 Hill J H (1999), Soybean mosaic virus In Compendium of Soybean an lu Diseases, 4th edn, pp 70–71, Edited by G L Hartman J B Sinclair & J C va Rupe St Paul, MN: American Phytopathological Society ll u nf 37 Hunt M.Real-time PCR Microbiology and Immunology On-line oi m 38 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1992 Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of z at nh soybean containing the Rsv resistance gene J Gen Virol 73:2067-2077 z 39 Jayaram, Ch., Hill, J.H., Miller, W.A 1991 Nucleotide sequences of the @ coat protein genes of two aphid-transmissible strains of soybean mosaic virus l gm J Gen Virol 72:1001-1003 m co 40 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu 13, pp 196-223 ac th si 45 41 Kirichenko A N (2013), “The characterization of bean yellow mosaic virus isolated from soybean”, Mikrobiol Z., 75 (3), pp 68-73 42 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2014) Designing an RNA interference structure aims at creating transgenic soybean plants resistant to both Soybean Mosaic Virus (SMV) and Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV) in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp 43 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., lu Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance against an n va Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA tn to interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 44 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), gh p ie “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl nl w Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 d oa 45 Selvaraj T., Nisha M C., Rajeshkumar S (2009), “Effect of indigenous an lu arbuscular mycorrhizal fungi on some growth parameters and phytochemical va constituents of Pogostemon patchouli Pellet”, Maejo international journal ll u nf of science and technology, (1), pp 222-234 oi m 46 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM(2000)Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature, 407, pp z at nh 319-323 z 47 Shukla D D., Ward C W (1988), “Amino acid sequence homology of @ coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus l gm group”, J Gen Virol., 69, pp 2703-2710 m co 48 Shukla D D., Ward C W., Brunt, A A (1994), The Potyviridae, CAB International, University Press, Cambridge, UK an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 46 49 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 50 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print 51 Topping JF (1998) Tobacco transformation, Methods of Mol Biol, 81: 365 – 372 lu an 52 Vanderveken J J., Harris K F.,Maramorosch K (1977), Oils and other n va inhibitors of nonpersistent virus transmission, In Aphids as Virus tn to Vectors Academic Press, London, pp 435-454 53 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gh p ie gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 nl w 54 Won S L, Yul H K., Kook H K (2003), “Complete Genome Sequences d oa of the Genomic RNA of Soybean mosaic virus Strains G7H and G5”, an lu Plant Pathol., 19 (3), pp 171-176 va 55 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C u nf C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic ll tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi oi m Chuan, 29 (8), pp 1018-22 z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 47 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si