Luận văn nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính kháng hóa chất diệt côn trùng (pyrethroid) của muỗi aedes aegypti và muỗi aedes albopictus truyền bệnh sốt xuất huyết

2 - Xác định mức độ biểu hiện của các gen P450 liên quan đến tính kháng hóa chất diệt của quần thể muỗi Ae.. - Xác định các đột biến trên gen VGSC liên quan đến tính kháng hóa chất diệt

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ SỐ VIẾT TẮT

tiếng Anh

Viết giải nghĩa tiếng Việt

Ae aegypti Aedes aegypti

Ae albopictus Aedes epiroticus

Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Giá trị của hệ số tương quan và ý nghĩa 32

Bảng 3.1 Kết quả thu thập và nuôi muỗi Aedes aegypti 33

Bảng 3.2 Kết quả thu thập và nuôi muỗi Aedes albopictus 33

Bảng 3.3 Chỉ số muỗi , bọ gậy Ae aegypti tại các điểm nghiên cứu năm 2015 và 2016 34

Bảng 3.4 Chỉ số muỗi, bọ gậy Ae albopictus tại các điểm nghiên cứu năm 2015 và 2016 35

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ nhậy cảm với hóa chất diệt côn trùng 37

của muỗi Ae aegypti 37

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ nhậy cảm với hóa chất diệt côn trùng 40

của muỗi Ae albopictus 40

Bảng 3.7 Giá trị CT của locus gen CYPJ26, CYPJ28 với các quần thể muỗi Aedes aegypti nghiên cứu 43

Bảng 3.8 Giá trị CT của locus gen CYP6BB2, CYP9M6 với các quần thể Aedes aegypti nghiên cứu 45

Bảng 3.9 Giá trị CT của locus gen CYPJ26, CYPJ28 với các quần thể muỗi Ae albopictus nghiên cứu 47

Bảng 3.10 Giá trị CT của locus gen CYP6BB2, CYP9M6 với các quần thể Aedes albopictus nghiên cứu 48

Bảng 3.11 Kết quả xác định các đột biến trên gen VGSC của các quần thể muỗi Ae Aegypti 51

Bảng 3.12 Kết quả xác định các đột biến trên gen VGSC của các quần thể muỗi Ae Albopictus 54

Bảng 3.13 Tương quan giữa thử nghiệm sinh học và xác định mức độ khuếch đại các locus gen P450 của các quần thể Ae aegypti 56

Bảng 3.14 Tương quan giữa thử nghiệm sinh học và xác định mức độ khuếch

đại các locus gen P450 của các quần thể Ae albopictus 57

Bảng 3.15 Tương quan giữa thử nghiệm sinh học và đột biến điểm trên gen

VGSC của các quần thể Ae aegypti 58

Bảng 3.16 Tương quan giữa thử nghiệm sinh học và đột biến điểm trên gen

VGSC của các quần thể muỗi Ae albopictus 59

thể muỗi Ae aegypti nghiên cứu bằng kỹ thuật real-time PCR 44

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn tình trạng khuếch đại các locus gen của các quần

thể muỗi Ae albopictus nghiên cứu bằng kỹ thuật real-time PCR 49

Hình 3.5 Minh họa đột biến kháng Ala1007Gly phát điện được tại quần thể

Ae aegypti thu thập tại Khánh Hòa 52

Hình 3.6 Minh họa đột biến kháng Phe1007Cys phát điện được tại quần thể

Ae aegypti thu thập tại Khánh Hòa, Nghệ An, Hà Nội 52

Hình 3.7 Minh họa đột biến kháng Tyr1007His phát điện được tại các quần

thể Ae Albopictus 55

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 SỰ CẦN THIẾT TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 3

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 4

1.2.1 Tình hình mắc bệnh sốt xuất huyết trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình sốt xuất huyết ở Việt Nam 5

1.2.3 Tình hình sốt xuất huyết tại các tỉnh nghiên cứu 7

1.2.3.1 Tình hình sốt xuất huyết tại Hà Nội 7

1.2.3.2 Tình hình sốt xuất huyết tại Thanh Hóa 7

1.2.3.3 Tình hình sốt xuất huyết tại Thanh Hóa 7

1.2.3.4 Tình hình sốt xuất huyết tại Khánh Hòa 7

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ MUỖI TRUYỀN BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 8

1.3.1 Vai trò truyền bệnh của Ae aegypti và Ae albopictus 8

1.3.2 Tính kháng hóa chất diệt côn trùng của Ae aegypti và Ae albopictus 9

1.3.2.1 Hóa chất diệt côn trùng 9

1.3.2.2 Cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng 10

1.3.3 Tình hình nghiên cứu về muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết ở Việt Nam14 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 THỜI GIAN 17

2.2 ĐỊA ĐIỂM 17

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18

2.4.1 Vật liệu thu thập muỗi tại thực địa 18

2.4.2 Dụng cụ, vật liệu cho thử nghiệm độ nhạy cảm tại phòng thí nghiệm và

thực địa 18

2.4.3 Dụng cụ vật liệu cho kỹ thuật real-time PCR đánh giá biểu hiện của gen P.450 19

2.4.4 Dụng cụ, vật liệu cho kỹ thuật giải trình tự xác định các đột biến điểm trên gen quy định tính kháng knock down 20

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.5.1.Thu thập muỗi tại các điểm nghiên cứu 20

2.5.1.1 Chọn mẫu, cỡ mẫu nghiên cứu 21

2.5.1.2 Các bước tiến hành 21

2.5.1.3 Biến số và đo lường biến số 22

2.5.1.4 Các chỉ số đánh giá: 22

2.5.1.5 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: 22

2.5.1.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 22

2.5.2 Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi với hóa chất diệt côn trùng 22

2.5.2.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu 23

2.5.2.2 Các bước tiến hành 23

2.5.2.3 Chỉ số đánh giá 27

2.5.2.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: 27

2.5.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 27

2.5.3 Xác định biểu hiện của gen P450 bằng kỹ thuật real-time PCR 28

2.5.3.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu 28

2.5.3.2 Các bước tiến hành 28

2.5.3.3 Chỉ số đánh giá 29

2.5.3.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: 29

2.5.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 29

2.5.4 Xác định các đột biến điểm trên kênh vận chuyển natri liên quan đến

tính kháng hóa chất của Aedes aegypti và Aedes albopictus 29

2.5.4.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu 29

2.5.4.2 Các bước tiến hành 30

2.5.4.3 Chỉ số đánh giá 31

2.5.4.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: 31

2.5.4.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 31

2.5.5 Đánh giá mối tương quan giữa 3 phương pháp đánh giá độ nhạy cảm, tính kháng hóa chất của các quần thể nghiên cứu 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ THU THẬP MUỖI TỪ CÁC ĐIỂM NGHIÊN CỨU 33

3.1.1 Số lượng muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus thu thập tại các điểm nghiên cứu 33

3.1.2 Chỉ số muỗi và bọ gậy của Ae aegypti và Ae albopictus tại các điểm nghiên cứu 34

3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY CẢM VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM SINH HỌC 37

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG VỚI HÓA CHẤT BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 42

3.3.1 Kết quả nghiên cứu đối với các quần thể muỗi Aedes aegypti 42

3.3.2 Kết quả nghiên cứu đối với các quần thể muỗi Aedes albopictus 46

3.4 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN VGSC 51

3.4.1 Kết quả nghiên cứu trên các quần thể muỗi Aedes aegypti 51

3.4.2 Kết quả nghiên cứu trên các quần thể muỗi Aedes albopictus 53

3.5 ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤTDIỆT CÔN TRÙNG 56

3.5.1 Mối tương quan giữa phương pháp thử nghiệm sinh học và xác định

mức độ biểu hiện của các gen giải độc bằng kỹ thuật real-time PCR 56

3.6 ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG 58

3.6.1 Mối tương quan giữa thử nghiệm sinh học và các đột biến điểm liên quan đến tính kháng thuốc trên gen VGSC của các quần thể Ae aegypti 58

3.6.2 Mối tương quan giữa thử nghiệm sinh học và các đột biến điểm liên quan đến tính kháng thuốc trên gen VGSC của các quần thể muỗi Ae albopictus 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1 KẾT LUẬN 61

4.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

1

MỞ ĐẦU

Sốt xuất huyết do arbovirus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất bởi nguy cơ tử vong cao trên thế giới hiện nay Sốt xuất huyết lây lan rộng ở các vùng đô thị nhiệt đới và cận nhiệt đới trong những thập kỷ qua, bao gồm các nước Đông Nam Á, Thái Bình dường, Châu Mỹ Latinh Sốt xuất huyết xảy ra ở hơn 100 nước với 2,5 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh (WHO, 2009; 2012) Cho đến nay vẫn chưa có Vắc - xin phòng chống bệnh sốt xuất huyết, vì vậy việc giám sát và kiểm soát Véc - tơ là lựa chọn duy nhất hiện nay cho công tác phòng chống dịch

Aedes aegypti và Aedes albopictus được biết đến là các Véc - tơ truyền

bệnh sốt xuất huyết chính trên thế giới (Oppenoorth, 1985) Tuy nhiên, rất ít biện pháp kiểm soát muỗi trưởng thành được đưa ra Hiện nay, xử lý hóa học

là một phần quan trọng nhất trong chiến dịch tích hợp phòng chống bệnh sốt xuất huyết của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2000) Với biện pháp kiểm soát hiện nay bằng hóa chất diệt lại dẫn đến một nguy cơ mới đó là sự hình thành tính kháng hóa chất diệt ở quần thể muỗi Vì vậy, mức độ nhạy cảm với hóa

chất sử dụng lên Ae aegypti và Ae albopictus phải liên tục được sàng lọc ở

những vùng địa lý khác nhau để nâng cao hiệu quả của chiến lược kiểm soát

Tính kháng vị trí đích và tính kháng chuyển hóa được biết đến như là hai cơ chế kháng chính ở muỗi (Hemingway et al., 2004; Nkya et al., 2013) Các đột biến dẫn đến vị trí đích không nhạy cảm trên protein của kênh vận chuyển natri xuyên màng và đột biến trên enzym acetylcholinesterase là đặc trưng nổi bật cho tính kháng vị trí đích ở muỗi Tính kháng chuyển hóa được báo cáo trên thế giới có liên quan đến các enzym giải độc như cytochrome P450 monooxygenases (P450s hoặc CYPs đối với gen), carboxy/cholinesterases (CCEs), glutathione S-transferases (GSTs) và UDP glucosyl-transferases (UGTs) (Hemingway et al., 2004; Feyereisen et al., 2005; Li et al., 2007; Nkya et al., 2013)

Chính vì vậy, chúng tôi chon mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm:

2

- Xác định mức độ biểu hiện của các gen P450 liên quan đến tính kháng hóa chất diệt của quần thể muỗi Ae aegypti và Ae albopictus ở một số địa

điểm của Việt Nam

- Xác định các đột biến trên gen VGSC liên quan đến tính kháng hóa chất diệt của quần thể muỗi Ae aegypti và Ae albopictus ở một số địa điểm

của Việt Nam

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là: Các quần thể muỗi Ae aegypti và

Ae albopictus tại Hà Nội, Khánh Hòa, Nghệ An, Thanh Hóa Đề tài được tiến

hành thu thập mẫu tại Hà Nội, Khánh Hòa, Nghệ An, Thanh Hóa Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương và Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên nghiên cứu đánh giá đồng bộ tính kháng

hóa chất của muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus bằng phương pháp thử

nghiệm sinh học và chuyên sâu về sinh học phân tử

Về thực tiễn đề tài đánh giá sự tương đồng giữa kết quả của thử nghiệm sinh học và các phân tích chuyên sâu về sinh học phân tử, là cơ sở cho các cho việc sử dụng hóa chất diệt côn trùng phù hợp nhất

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 SỰ CẦN THIẾT TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

Trong những năm gần đây, mặc dù có nhiều nỗ lực trong công tác phòng chống dịch chủ động, nhưng dịch sốt xuất huyết có xu hướng gia tăng trở lại ở Việt Nam Có bốn chủng virus sốt xuất huyết Dengue đã được xác định là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4, chủ yếu lây truyền qua muỗi thuộc

giống Aedes, loài Ae aegypti được coi là Véc - tơ chính truyền sốt xuất huyết

ở đô thị và Ae albopictus ở nông thôn [1], [2], [4] Những nghiên cứu gần đây cho thấy vùng phân bố của Ae albopictus ngày càng mở rộng ở Việt

Nam Ở hầu hết các điểm nghiên cứu có ghi nhận sự lưu hành của cả 2 loài

muỗi Ae aegypti và Ae albopictus, đặc biệt là vụ dịch ở huyện Hương Khê, tỉnh Thanh Hóa chỉ thu thập được Ae albopictus Các địa bàn nghiên cứu trước đây vốn chỉ ghi nhận có sự lưu hành của Ae albopictus như xã Bát

Tràng, huyện Gia lâm, Hà Nội cũng có 2 bệnh nhân mắc sốt xuất huyết trong năm 2007 Tại một số nơi như xã Hát Môn huyện Phúc Thọ và xã Cao Viên huyện Thanh Oai, theo điều tra của Trung tâm y tế dự phòng Hà Nội, chỉ bắt

được Ae albopictus nhưng vẫn có bệnh nhân mắc sốt xuất huyết tại địa

phương [3], [5], [6]

Những kết quả nghiên cứu cho thấy đã có sự thay đổi về sự phân bố cũng như khả năng truyền bệnh sốt xuất huyết của hai loài muỗi này Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra các Véc - tơ truyền bệnh sốt xuất huyết thường trùng vùng phân bố nhưng lại có vai trò khác nhau [5], [6], [8] Vì vậy, để có được những biện pháp chủ động và có hiệu quả trong công tác phòng chống bệnh sốt

xuất huyết thì việc nghiên cứu về muỗi Ae aegypti và muỗi Ae albopictus là

một yêu cầu cấp thiết và có ý nghĩa quan trọng cả về lý luận và thực tiễn

4

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.2.1 Tình hình mắc bệnh sốt xuất huyết trên thế giới

Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới WHO, mỗi năm có khoảng 390 triệu người bị nhiễm sốt xuất huyết - đây là căn bệnh nhiệt đới lây lan nhanh nhất thế giới Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính

do vi rút gây nên Bệnh lây truyền từ người sang người qua vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi vằn Bệnh có thể gây thành dịch lớn và có tỷ lệ tử vong tương đối cao Bệnh lưu hành tại trên 100 quốc gia thuộc các khu vực có khí hậu nhiệt đới và á nhiệt đới như vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương, châu Mỹ, châu Phi với khoảng 2,5 tỷ người sống trong vùng nguy cơ (WHO, 11) [60] Theo Tổ chức Y tế thế giới, mỗi năm có khoảng 100 triệu trường hợp mắc, phần lớn là trẻ em dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong trung bình do sốt xuất huyết khoảng 2,5-5% tương đương khoảng 25.000 người mỗi năm [6], [8], [60]

Vụ dịch SXHD đầu tiên dược ghi nhận với tác nhận rõ ràng tại Úc năm

1897, tiếp đến tại Hy Lạp vào năm 1928 và Đài Loan 1931 Một số vụ đại dịch SXH xảy ra ở Đông Nam Á sau chiến tranh thế giới thứ II, năm 1953-

1954, dịch SXH Dengue cũng được phát hiện tại Phillippine, sau đó dịch tiếp tục được lan rộng tại khắp các vùng lãnh thổ châu Á bao gồm Ấn Độ, Indonéia, Myanmar, Srilanka và Thái Lan Trước năm 1970, chỉ có 9 nước có dịch SXHD, ngày nay đã lan trộng ra trên một trăm quốc gia [4], [8], [60]

Phần lớn dân số mắc SXHD sống tại các đô thị có khí hậu nhiệt đới và

cận nhiệt đới, nơi phù hợp cho muỗi Aedes phát triển Mặc dù trước kia bệnh

SXH được cho là chỉ xuất hiện ở khu vực thành thị, nhưng ngày nay bệnh đã trở nên phổ biến hơn tại khu vực nông thôn đặc biệt là vùng nông thôn của các nước Đông Nam Á [8], [12]

Theo TCYTTG, số trường hợp bệnh SXHD được báo cáo trong khoảng thời gian 55 năm qua đã tăng tới 2.427 lần Giai đoạn 1955-1959 mỗi năm có khoảng 908 trường hợp bệnh Đến giai đoạn 1960-1969 số trương hợp bệnh

5

đã tăng gấp 15 lần so với giai đoạn trước đó và tiếp tục tăng cao trong những giai đoạn tiếp theo [60]

Những năm 2001-2011, gần 10 triệu ca sốt xuất huyết đã được báo cáo

ở Châu Mỹ Latinh, gần 60% trường hợp này là ở Brazil Năm 2012, châu Âu

đã trải qua đợt sốt xuất huyết bùng phát lớn nhất từ sau năm 1920 đến nay với khoảng 2.000 người bị nhiễm ở quần đảo Madeira của Bồ Đào Nha [12], [22]

Các nhà nghiên cứu ước tính rằng 70% các trường hợp sốt xuất huyết nghiêm trọng trên thế giới tập trung ở châu Á, trong đó Ấn Độ chiếm tới 34% Năm 2014, tình hình sốt xuất huyết có chiều hướng gia tăng tại nhiều quốc gia khu vực Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới khu vực Tây Thái Bình Dương ngày 22/4/2014 (WHO, 2014) [60], sốt xuất huyết đang tăng gia tại các nước Campuchia, Singapore, Malaysia và Australia Có thể nói SXHD

là một trong những bệnh truyền nhiễm gây khó khăn lớn nhất và y tế công cộng cho khu vực Đông Nam Á, với 7 trong số 10 nước của khu vực bị SXHD nặng nề; SXHD là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh dẫn ddén tử vong của trẻ em tại các khu vực này; Tỷ kệ mắc SXHD trong khu vực tăng lên đáng

kể trong vòng 17 năm qua và từ năm 1980 trở lại đây số trường hợp mắc SXHD đã tăng lên gần 5 lần so với 30 năm và trước, và hầu như tất cả các quốc gia trong khu vực đều có dịch SXHD [8], [22], [60] Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, vẫn chưa có chủng ngừa hoặc loại thuốc cụ thể nào điều trị sốt xuất huyết được phê duyệt chính thức.Với mức độ nghiêm trọng của bệnh như vậy, việc kiểm soát Véc - tơ truyền bệnh ở các nước vùng dịch và các nước có nguy cơ cao được đặt ra hết sức cấp thiết

1.2.2 Tình hình sốt xuất huyết ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tình hình nhiễm sốt xuất huyết không ổn định nhưng thời

kỳ cao điểm của dịch sốt xuất huyết là từ tháng 6 đến tháng 10 hàng năm Trung bình mỗi năm cả nước ghi nhận khoảng 100.000 trường hợp mắc và gần 100 trường hợp tử vong Trên 85% ca mắc và 90% ca tử vong do sốt xuất huyết là ở các tỉnh miền Nam Việt Nam Khoảng 90% số ca tử vong do sốt xuất huyết là ở nhóm tuổi dưới 15 Dịch sốt xuất huyết thường xảy ra theo

6

chu kỳ từ 3 đến 5 năm một lần Tỷ lệ mắc sốt xuất huyết tăng liên tục, năm

2000 là 24.434 ca lên 105.370 ca năm 2009, và năm 2011 là 69.680 ca Năm

2013, cả nước ghi nhận 10.847 trường hợp mắc sốt xuất huyết tại 40 tỉnh/thành phố, trong đó có 10 ca tử vong Năm 2014, cả nước ghi nhận 9.011 trường hợp mắc sốt xuất huyết tại 42 tỉnh/thành phố, trong đó có 5 trường hợp

tử vong tại Cà Mau, Bình Dương, Bình Phước và TP Hồ Chí Minh So với năm 2015 năm 2016 số ca mắc sốt xuất huyết tăng gấp 3 lần, trong đó tình hình tại 4 tỉnh Tây Nguyên có diễn biến đặc biệt nghiêm trọng Đến tháng 8 năm 2016, cả nước có gần 50.000 ca mắc sốt xuất huyết tại 48 tỉnh thành, 17 trường hợp đã tử vong Tại 4 tỉnh Tây Nguyên gồm: Gia Lai, Kon Tum, Đắk Lắk, Đắk Nông, tình hình dịch SX HD đang diễn ra hết sức nghiêm trọng chiếm gần 75% số ca mắc cả nước Trong 6 tháng đầu năm 2019, 60/63 tỉnh thành trong cả nước có tổng số trên 80.000 trường hợp mắc sốt xuất huyết, cao gấp 3 lần so với cùng kỳ năm 2018, nhiều trường hợp đã tử vong [4], [5]

Thống kê của Bộ Y tế cho thấy, các địa phương có số ca mắc bệnh cao tập trung tại khu vực miền Trung và miền Nam Tại 20 tỉnh thành khu vực phía Nam đã có gần 50.000 người mắc bệnh, cao hơn năm 2018 lên tới hơn 20.000 người tức tăng đến 139% và đã có 6 trường hợp tử vong được ghi nhận.Thành phố Hồ Chí Minh là nơi phát hiện nhiều ca mắc bệnh nhất với hơn 24.000 ca Tỉnh An Giang là địa phương có số người bệnh đứng thứ 7 khu vực phía Nam chỉ sau Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bình Dương,

Bà Rịa Vũng Tàu, Long An và Bình Phước.Ngoài ra, tại khu vực Đắk Lắk toàn tỉnh phát hiện có hơn 3.000 trường hợp nhiễm sốt xuất huyết tăng gấp 7 lần so với cùng kỳ và khu vực phía Bắc thống kê cho thấy tại Thành phố Hà Nội đã ghi nhận được gần 1000 ca nhiễm bệnh nhưng không có tử vong [5]

Những năm gần đây, mỗi năm trung bình có khoảng 100.000 ca mắc bệnh sốt xuất huyết và dự báo năm 2019 số ca mắc bệnh này có thể tăng vượt con số này

Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa đạt nhiều thành công trong việc giảm số

ca mắc sốt xuất huyết

7

1.2.3 Tình hình sốt xuất huyết tại các tỉnh nghiên cứu

1.2.3.1 Tình hình sốt xuất huyết tại Hà Nội

Hà Nội đã ghi nhận nhiều dịch SXHD lớn tại trong 20 năm trở lại đây như dịch năm 1998 Năm 2009 số ca mắc SXH tại Hà Nội là 16.090 trường hợp /18.845 trường hợp mắc bệnh trên toàn miền Bắc chiếm 87% có 4 trường hợp tử vong Năm 2015, Hà Nội có 15.412 trường hợp bệnh chiếm 90% trường hợp bệnh của toàn miền Bắc Từ đầu năm 2019 đến nay, Hà Nội ghi nhận 2.399 trường hợp mắc sốt xuất huyết nhưng chưa có trường hợp tử vong,

phân bố tại 145 xã, phường, thị trấn của 26 quận, huyện, thị xã [4]

1.2.3.2 Tình hình sốt xuất huyết tại Thanh Hóa

Năm 2016, tình hình SXHD tăng cao tại tỉnh Thanh Hóa cả tỉnh có 171 bệnh nhân mắc SXHD trong đó có 109 trường hợp bệnh ngoại lai, 62 trường hợp mắc tại địa phương Chỉ sau một năm, 2017 tình hình bệnh sốt rét đã tăng cao lên gấp hơn 20 lần ghi nhận 3.374 trường hợp bệnh trong đó chỉ co 10,34% tương đương với 349 trương hợp bệnh nội địa Tập trung tại huyện Tĩnh Gia và Hoằng Hóa [5]

1.2.3.3 Tình hình sốt xuất huyết tại Thanh Hóa

Số bệnh nhân SXHD không nhiều, tăng giảm thất thường số trường hợp bệnh SXHD năm 2016 là 39 trường hợp giảm 33,8% so với cùng kỹ năm

2015 Năm 2017 số trường hợp bệnh sốt rét tăng gấp 400% so với năm 2016

có 194 trường hợp mắc bệnh [4]

1.2.3.4 Tình hình sốt xuất huyết tại Khánh Hòa

Khánh Hòa là điểm nóng về SXHD ở miền trung Việt Nam trong hơn

30 năm Năm 2015, Khánh Hòa đã ghi nhận gần 5.500 ca mắc SXHD, tăng gấp 5 lần so với cùng kỳ năm 2014 Năm 2015, tỉnh có 170 ca SXHD nặng và

đã có 2 trường hợp tử vong ở huyện Vạn Ninh Tất cả các huyện thị có số ca mắc SXHD đều tăng so với năm 2014: Cụ thể, huyện Diên Khánh tăng hơn

13 lần (hơn 1.000 ca); huyện Vạn Ninh tăng hơn 8 lần (gần 1.000 ca); thị xã

là 3 địa phương có số mắc mới cao nhất trong các tháng đầu năm 2019

Có thể nói, dịch SXH trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa đang diễn biến rất phức tạp, số ca mắc bệnh tăng đột biến và chưa có dấu hiệu dừng lại

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ MUỖI TRUYỀN BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.3.1 Vai trò truyền bệnh của Ae aegypti và Ae albopictus

Muỗi Ae aegypti và Ae albopictus được biết đến là Véc - tơ truyền

một số bệnh ở người trong đó có bệnh sốt xuất huyết, một trong những bệnh ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới Vai trò truyền bệnh sốt

xuất huyết của muỗi Aedes đã được chứng minh Trong đó loài Ae aegypti được xác định là Véc - tơ quan trọng nhất, Ae albopictus cũng được nghiên

cứu ở một số nước trong nhiều năm qua, tuy nhiên số liệu còn chưa đầy đủ

hết các khu vực bệnh lưu hành dịch (Oppenoorth, 1985) Trên lục địa châu Á

và quần đảo Indonesia, các vụ dịch sốt xuất huyết thường cho thấy có sự phù

hợp với sự phân bố muỗi Ae aegypti và Ae Albopictus [12], [60], [61]

Trong những năm gần đây đã có nhiều kỹ thuật mới như PCR sao chép ngược; kết hợp PCR sao chép ngược với PCR định lượng, LAMP được phát triển đã xác định các chủng virus sốt xuất huyết trong muỗi và khẳng định vai trò trung gian truyền bệnh của các loài muỗi này (Kamgang., 2011;

1.3.2.1 Hóa chất diệt côn trùng

Từ năm 1950, hóa chất diệt côn trùng đã được sử dụng ồ ạt cho việc kiểm soát số lượng muỗi Các loại thuốc hóa học được sử dụng chủ yếu là các hợp chất Clo hữu cơ, phosphate hữu cơ, carbamat, pyrethroid

Nhóm Clo hữu cơ bao gồm các hóa chất như DDT (dichlorodiphenyltrichloroethane), dieldrin và lindan Các hợp chất của nhóm này thường không tan trong nước, vì vậy rất bền vững trong môi trường Do

có độc tính cao với người, gây ô nhiễm môi trường và hiệu quả diệt muỗi không còn vì muỗi đã kháng với DDT nên hiện nay không còn được sử dụng [9], [61]

Nhóm phosphate hữu cơ bao gồm các hóa chất như DDVP, malathion, parathion, diazinon, fenthion Nhóm này cũng có độc tính cao với người, tuy nhiên không bền vững trong môi trường như nhóm Clo và có mùi khó chịu nên hiện nay chỉ được sử dụng ở mức hạn chế [11], [13]

Nhóm carbamat bao gồm các hợp chất như izolan, dimetan, pyramat, pyrolan tuy nhiên nhóm này có hiệu lực thấp và giá thành cao nên ít được sử dụng [14], [61]

Nhóm pyrethroid có nguồn gốc thực vật gồm allethrin (phân nhóm 1)

có tác dụng diệt ruồi và muỗi nhưng không chịu được tác động của ánh sáng, tetramethrin, phenothrin (phân nhóm 2), permethrin, fenvalerat (phân nhóm 3) có tác dụng diệt côn trùng mạnh, chịu được tác động của ánh sáng, cypermethrin, deltamethrin (phân nhóm 4) Hiện nay, hóa chất thuộc nhóm pyrethroid được sử dụng rộng rãi do tương đối an toàn với người và môi trường, tự hủy nhanh trong đất, có tác dụng hạ gục nhanh và rất độc với côn trùng [1], [7], [10],

10

Từ những năm 2000-2009, lượng hóa chất sử dụng hàng năm cho việc diệt muỗi là 394 tấn phosphate hữu cơ và 154 tấn pyrethroid (WHO, 2014) [60] Tuy nhiên, hiệu quả của các hóa chất diệt giờ đây đã bị đe dọa bởi cơ chế kháng ở muỗi Vì vậy, trong hoàn cảnh hiện nay khi chưa có giải pháp thay thế hiệu quả, cơ chế phân tử của tính kháng sẽ là bước chìa khóa nhằm cải thiện các chiến lược quản lý tính kháng hóa chất diệt ở muỗi (David et al., 2014) [17], [18]

1.3.2.2 Cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng

Trên thế giới, tính kháng hóa chất diệt ở muỗi Aedes đã được báo cáo ở khá nhiều vùng như châu Á, đặc biệt là Đông Nam Á như Thái Lan (Pethuan

et al., 2007; Rajatileka et al, 2008) [49], [50], Malaysia [13], Indonesia [23], [25] , Việt Nam [34], Ấn Độ [37], Trung Quốc [44], Mỹ Latinh: Brazil [39], Argentina (Llinas et al., 2010), Colombia (Fonseca-Gonzalez et al., 2010; Grisales et al., 2013), Grand Cayman (Harris et al., 2010), Trung Phi (Kamgang et al., 2011), Brazil (Lima et al., 2011; Linss et al., 2014), Martinique (Marcombe et al., 2012), Senegal (Dia et al., 2012), Haiti (McAllister et al., 2012), Costa Rica (Bisset et al., 2013), Malaysia (Chen et al., 2013), Pakistan (Jahan and Shahid, 2013), Myanmar (Kawada et al., 2014), Mỹ (Marcombe et al., 2014), Ấn Độ (Das and Dutta, 2014)

Tính kháng với hóa chất diệt có thể là kết quả của các cơ chế khác nhau, như là đột biến của protein mục tiêu của hóa chất diệt, sự thâm nhập thấp hơn của hóa chất diệt (tính kháng vị trí đích) hay sự phân hủy sinh học của nó (tính kháng chuyển hóa) Vị trí đích không nhạy cảm và tính kháng chuyển hóa được biết đến như là hai cơ chế kháng chính ở muỗi (Hemingway

et al., 2004) [25]

Nghiên cứu tính kháng hóa chất diệt ở muỗi trên thế giới đã được tiến hành dựa trên các phương pháp như PCR-RFLP, giải trình tự trực tiếp từ các sản phẩm PCR để xác định các đột biến gen (Stenhouse et al., 2013; Kawada

et al., 2014) [34], [35], [55], các phương pháp qRT-PCR, phân tích hệ gen, transcriptome, để xác định mức độ biểu hiện, mức độ sao chép của các gen

11

có liên quan đến tính kháng (Strode et al., 2008; Lertkiatmongkol et al., 2010; Bariami et al., 2012; David et al., 2010; 2014; Reid et al., 2014) [7], [17], [54], [55]

Tính kháng vị trí đích

Hiện nay, tính kháng với các hóa chất thuộc nhóm pyrethroids đang là vấn đề chính trong chương trình kiểm soát Véc - tơ Sự thay thế amino acid đơn trong kênh dẫn truyền natri xuyên màng (voltage-gated sodium channel - VGSC), được biết đến như là đột biến kháng ngã gục - kdr (knockdown resistance), là một trong các nguyên nhân chính trong tính kháng với pyrethroid ở một số loài muỗi [7], [10], [11]

Nghiên cứu cơ chế tác động của các hóa chất thuộc nhóm pyrethroid cho thấy các chất này ảnh hưởng lên côn trùng bằng cách gắn vào kênh vận chuyển natri của neurons Chúng thường ưu tiên gắn vào các kênh đang mở Các kênh được bao bởi natri vẫn còn đang mở ở giai đoạn hoạt động làm cho dây thần kinh bị kích thích dẫn đến sự mất kiểm soát Khiến cho côn trùng bị

co giật và không thể duy trì khả năng bay bình thường (David et al., 2010; Faucol et al., 2015) [16], [18] Nghiên cứu của Wang et al., (2014) [59] cho thấy pyrethroid gắn với hai vị trí thụ thể PyR1 và PyR2 trên kênh vận chuyển

natri Tuy nhiên, nếu đột biến điểm xác định trong gen AaNav xuất hiện, sự

thay thế amino acid có thể làm giảm đáng kể sự nhạy cảm của kênh natri gắn với pyrethroid Nó có thể cũng làm thay đổi cấu tạo của kênh natri đến một mức nào đó như vẫn đóng hoặc ở trạng thái bất hoạt hình thành nên tính kháng hóa chất diệt [58], [63]

Một số nghiên cứu đã tìm thấy các đột biến trên gen AaNav liên quan đến tính kháng hóa chất diệt ở Ae aegypti như: Gly923Val, Leu982Thr

(Brengues et al., 2003); Ile1011Met, Val1016Gly (Saavedra-Rodriguez et al., 2007; Lima et al., 2011; Stenhouse et al., 2013; Martins et al., 2013); Asp1794Tyr, Val1023Ile (Chang et al., 2009); Val1016Ile, Phe1534Cys (Harris et al., 2010); Phe1552Cys (Yanola et al., 2010); Ser989Pro (Kawada

et al., 2014); Thr1520Ile (Kushwah et al., 2015) Tần xuất cao của đột biến kdr 1534Cys được tìm thấy ở Việt Nam, Thái Lan, Grand Cayman và

12

Martinique (Kawada et al., 2009; Yanola et al., 2011; Harris et al., 2010; Marcombe et al., 2012) Nghiên cứu cho thấy ở Châu Mỹ Latinh đột biến kdr 1016Ile rất phổ biến, và tần xuất của nó tăng lên nhanh ở những nơi sử dụng nhiều pyrethroid, như Brazil và Mexico (Martine et al., 2009; Garcia et al., 2009) Đột biến thay thế valine thành glycine ở domain II (V1016G) liên quan đến tính kháng với dạng II của pyrethroid, deltamethrin Tuy nhiên, hiện nay tần xuất V1016G khá thấp ở Đông Nam Á, bao gồm Indonesia (Brengues et al., 2003), Thái Lan (Rajatileka et al., 2008; Srisawat et al., 2010), Việt Nam (Kawada et al., 2009) và Đài Loan (Chang et al., 2009) Tần xuất alen 1016G được tìm thấy là 0.23 trong nghiên cứu của Rajatileka et al., (2008)

Bên cạnh những đột biến liên quan đến tính kháng, ở nhiều quần thể

Ae aegypti kháng pyrethroid ở Thái Lan còn có sự gia tăng biểu hiện của hỗn

hợp enzym oxidases Các cơ chế trao đổi chất này có thể góp phần kháng cùng với đột biến kdr (Pethuan et al., 2007; Somwang et al., 2011)

Các biến thể đa hình có khả năng ảnh hưởng đến chức năng của các enzym giải độc đã được nghiên cứu nhiều ở muỗi mặc dù các bằng chứng cho

13

thấy hiện tượng này có thể có vai trò trong tính kháng hóa chất diệt (Li et al.,

2007; Chiu et al., 2008) Gần đây, đa hình gen P450 có liên quan đến tính

kháng pyrethroid ở muỗi Culex (Hardstone et al., 2010) và sự giảm đa dạng

trong trình tự của hai gen P450 gây ra tính kháng với pyrethroid ở Anopheles

đã được nghiên cứu (Riveron et al., 2013) Điều này chỉ ra rằng, nghiên cứu sâu về các đa hình liên quan đến tính kháng giúp chúng ta hiểu hơn về cơ chế kháng thuốc ở muỗi

Trong số các cytochrome P450, CYP9J32 được tổng hợp rất mạnh

trong các chủng Ae aegypti kháng với deltamethrin và permethrin ở Thailand,

Mexico và Vietnam (Strode et al., 2008; Bingham et al., 2011) Điều thú vị là trong khi CYP9J32 có khả năng chuyển hóa cả hai loại pyrethroids này, nó cho thấy một sự ưu tiên đặc biệt với deltamethrin (Stevenson et al., 2012)

CYP9J24, CYP9J26 và CYP9J28 là các P450 khác được chứng minh có ở Ae aegypti trong sự chuyển hóa pyrethroids Nghiên cứu của Reid et al., (2014)

trên 164 cytochrome P450 ở Ae aegypti, cho thấy 33 P450 có điều hòa biểu

hiện tăng một cách có ý nghĩa, trong đó có các họ CYP4, 6 và 9

Tính kháng hóa chất diệt ở muỗi Ae albopictus

Bên cạnh những nghiên cứu trên muỗi Ae aegypti, những năm gần đây

đã có thêm các báo cáo về hiện tượng kháng hóa chất diệt ở Ae albopictus

Từ những nghiên cứu đầu tiên phát hiện đột biến F1534C trên quần thể Ae albopictus ở Singapore (Kasai et al., 2011), cho đến gần đây đã có thêm nhiều nghiên cứu cho thấy quần thể muỗi Ae albopictus ở một số vùng đã có hiện tượng kháng với hóa chất diệt như DDT và deltamethrin (Kamgang et al., 2011) Nghiên cứu tính kháng hóa chất diệt của quần thể muỗi Ae albopictus

ở Malaysia cho thấy đã phát hiện sự kém nhạy cảm của acetylcholinesterase chứng tỏ các quần thể này đã xuất hiện tính kháng với hóa chất thuộc nhóm carbamat hoặc phosphate hữu cơ (Chen et al., 2013) Nghiên cứu tính kháng

hóa chất diệt của quần thể muỗi Ae albopictus ở Mỹ cũng cho thấy có hiện

tượng kháng với DDT, malathion và hóa chất thuộc nhóm phosphate, tuy nhiên các quần thể này vẫn còn nhạy cảm với các hóa chất thuộc nhóm pyrethroid (Marcombe et al., 2014) Hiện tượng kháng với DDT nhưng vẫn

14

còn mẫn cảm với deltamethrin của các quần thể muỗi Ae albopictus cũng

được báo cáo ở Ấn Độ (Das and Dutta, 2014)

Có thể thấy rằng tính kháng hóa chất diệt ở muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới hết sức quan tâm Tuy

nhiên, có sự khác biệt khá rõ về tính kháng hóa chất diệt của hai loài muỗi Ae aegypti và Ae albopictus Vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan đến tính

kháng hóa chất diệt ở hai loài muỗi này là rất cần thiết để có được chiến lược kiểm soát hiệu quả

1.3.3 Tình hình nghiên cứu về muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết ở

Việt Nam

Tại Việt Nam, khi vụ dịch sốt xuất huyết đầu tiên xảy ra ở miền Bắc vào năm 1958 cho đến nay đã có một số nghiên cứu dịch tễ về sốt xuất huyết Ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam, từ 1989 đến 1996 là thời gian bùng phát bệnh

do virus Dengue-1; từ 1987-1997 là thời gian bùng phát bệnh do virus Dengue-2; virus Dengue-3 bắt đầu được phát hiện từ 1995 và đến nay vẫn còn được phát hiện; virus Dengue-4 xuất hiện rải rác các năm 1987, 1990, 1991,

1992, 1998 [1], [4]

Nghiên cứu về Véc - tơ truyền bệnh sốt xuất huyết tại Việt nam cho

thấy loài Ae aegypti phân bố phổ biến ở các đô thị, còn Ae albopictus phân

bố chủ yếu ở vùng nông thôn Nghiên cứu của Vũ Sinh Nam (1995) cho thấy,

tất cả các ổ dịch đều có mặt Ae aegypti, chỉ có rất ít ổ dịch có hai loài, trong

đó Ae albopictus chiếm tỷ lệ rất thấp Nghiên cứu này cũng cho thấy ở nhiều địa phương có sự lưu hành của Ae albopictus với mật độ cao trong nhiều năm

như Lào Cai, Cao Bằng, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Tuyên Quang nhưng không có thông báo về bệnh sốt xuất huyết [1], [5]

Mặc dù muỗi Ae albopictus được ghi nhận có mặt ở các địa phương

trên khắp cả nước, nhưng vai trò truyền bệnh của chúng tại Việt Nam hiện

vẫn chưa được làm rõ Theo Trần Văn Tiến và cs., (2004) [6] Ae albopictus

phân bố rộng rãi ở 4 thực địa miền Bắc là Hà nội, Thanh Hóa, Phú Thọ và

15

Hòa Bình nhưng chưa khẳng định được vai trò truyền bệnh Nghiên cứu của

Vũ Đức Hương và Nguyễn Thị Bạch Ngọc (2006) cho thấy virus Dengue tuy

dễ dàng xâm nhập vào Ae albopictus, nhưng muỗi này hút máu người ít hơn

so với Ae aegypti do đó vai trò truyền bệnh thấp hơn, các vụ dịch sốt xuất

huyết xảy ra ở thành thị nhiều hơn so với nông thôn

Vai trò truyền bệnh và đặc điểm dịch tễ học của Ae aegypti trong việc

truyền bệnh sốt xuất huyết và khả năng đáp ứng với hóa chất diệt cũng đã được tiến hành ở một vài nghiên cứu Huber và cs., (2009) đã nghiên cứu biến

đổi di truyền và sự mẫn cảm với virus dengue 2 ở quần thể muỗi Ae aegypti ở

thành phố Hồ Chí Minh Kawada và cs., (2009) phát hiện được đột biến

V1016G trong quần thể muỗi Ae aegypti ở dạng dị hợp tử với tần xuất thấp

và đột biến F1269C với tần xuất cao ở hầu hết các địa điểm nghiên cứu vùng sông Mekong, Việt Nam Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Nhật Cảm (2010)

cho thấy muỗi Ae aegypti ở các tỉnh phía Bắc kháng 100% với DDT nhưng vẫn còn mẫn cảm với hóa chất thuộc nhóm pyrethroid Tuy nhiên, muỗi Ae aegypti ở miền Trung và Nam Việt Nam đã có hiện tượng kháng với các hóa

chất thuộc nhóm pyrethroid ở hầu hết các địa điểm nghiên cứu Bằng phương pháp microassay sử dụng chip DNA của Strode và cs., (2008), tác giả đã phát

hiện ba gen P450 có mức biểu hiện cao ở quần thể muỗi kháng với pyrethroid

là CYP9J8, CYP6M9 và CYP305A6 Cũng trong nghiên cứu này, khảo sát

đột biến gen kdr bằng kỹ thuật HOLA cho thấy 70% quần thể muỗi nghiên cứu xuất hiện đột biến Val1016Gly chủ yếu ở dạng dị hợp tử Tuy nhiên, tần

xuất xuất hiện đột biến không tương xứng với tình trạng kháng các hóa chất thuộc nhóm pyrethroid phát hiện bằng phương pháp giấy tẩm hóa chất của Tổ chức Y tế Thế giới

Nghiên cứu tình hình kháng với hóa chất diệt như malathion, permethrin, deltamethrin đã được Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương điều tra tại 47 điểm trên 21 tỉnh thành trên cả nước cho thấy: có

27 điểm nhạy cảm, 5 điểm có khả năng kháng, 15 điểm có hiện tượng kháng

16

với malathion; có 13 điểm nhạy cảm, 1 điểm có khả năng kháng, 20 điểm có hiện tượng kháng với permethrin; có 13 điểm nhạy cảm, 7 điểm có khả năng kháng, 16 điểm có hiện tượng kháng với deltamethrin

Vì vậy, việc nghiên cứu sự biểu hiện và đột biến gen liên quan đến tính kháng hóa chất diệt của các loài muỗi là Véc - tơ truyền bệnh sốt xuất huyết ở Việt Nam là hết sức cần thiết góp phần kiểm soát dịch bệnh

17

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phường Trương Định, quận Hai Bà Trưng, TP Hà Nội

- Phường Hưng Lộc, thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An

- Xã Hải Bình, huyện Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa

- Xã Diên Phú, huyện Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Thu thập muỗi Aedes tại các địa điểm nghiên cứu tại thực địa, phân

loại muỗi, nhân nuôi

- Thử nghiệm sinh học đánh giá độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng thuộc nhóm pyrethoid

- Xác định biểu hiện của gen P450 bằng kỹ thuật real-time PCR

- Xác định các đột biến điểm trên kênh vận chuyển natri liên quan đến

tính kháng hóa chất của Aedes aegypti và Aedes albopictus

- Đánh giá mối tương quan giữa 3 phương pháp đánh giá độ nhạy cảm, tính kháng hóa chất của các quần thể nghiên cứu

18

2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.4.1 Vật liệu thu thập muỗi tại thực địa

- Ống tube bắt muỗi thủng 2 đầu, dài 20 cm: 50 ống

- Máy bắt muỗi cầm tay: 02 cái

- Lồng muỗi

- Vợt thu bọ gậy

- Cốc đựng bọ gậy

- Biểu mẫu ghi kết quả thu thập và định loại muỗi

2.4.2 Dụng cụ, vật liệu cho thử nghiệm độ nhạy cảm tại phòng thí nghiệm

và thực địa

Bộ dụng cụ do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cung cấp để thử nhạy cảm gồm có:

a) Mười hai (12) ống nhựa cứng, trong suốt, hình trụ, chiều dài 125 mm

và đường kính là 44mm, hai đầu ống có ren: một đầu lắp vào nắp đậy

có lưới nhựa, một đầu lắp vào tấm đế, 12 ống nhựa này bao gồm:

- 5 ống có chấm đỏ dùng cho muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất (ống tiếp xúc)

- 2 ống có chấm xanh dùng làm ống cho muỗi tiếp xúc với giấy đối chứng không tẩm hóa chất (ống đối chứng)

- 5 ống có chấm xanh dùng làm ống cho muỗi nghỉ trước và sau khi tiếp xúc với giấy thử (ống nghỉ)

b) Bảy (7) tấm đế (hay còn gọi là tấm trượt), mỗi tấm đế có 3 lớp: hai lớp phía ngoài được gắn cố định vào nhau và mặt ngoài của hai lớp này gắn một ống hình trụ ngắn có ren để lắp vào ống nhựa nói trên, lớp giữa là một phiến nhựa có hai lỗ tròn: lỗ to có đường kính 44mm, lỗ nhỏ có đường kính 20mm Muỗi được cho vào ống nhựa qua lỗ tròn trên phiến giữa

c) Bốn mươi (40) tờ giấy trắng, sạch (12 x 15 cm) để lót ống nghỉ

d) Mười bốn (14) kẹp kim loại có dạng vòng tròn để giữa cho giấy tẩm hóa chất, giấy đối chứng và giấy lót ống nghỉ ép sát vào thành ống

19

nhựa 7 kẹp bằng thép dùng để giữ giấy trong ống nghỉ và ống đối chứng, và 7 kẹp bằng đồng dùng để giữ giấy tẩm hóa chất trong ống tiếp xúc

e) Hai (2) ống hút muỗi, mỗi ống có 3 phần: phần đầu ống hút làm bằng nhựa cứng hoặc thủy tinh, có đường kính 12mm, tiếp đến là ống dẫn dài 60 cm, và cuối cùng là bộ phận làm bằng nhựa hoặc thủy tinh là nơi miệng người bắt muỗi ngậm vào để hút muỗi

f) Một (1) cuộn băng dính

g) Một (1) bản hướng dẫn quy trình thử nghiệm

Ngoài các dụng cụ nêu trên, để tiến hành thử nghiệm cần phải có những vật liệu sau đây:

- Tubes bắt muỗi thủng hai đầu

- Ôn ẩm kế, đồng hồ, kéo

- Lỗng muỗi, khay nhựa hoặc kim loại

- Bông thấm nước và khống thấm nước

- Đường Glucose

- Khăn hoặc tấm vải

- Phiếu ghi kết quả thử nghiệm

2.4.3 Dụng cụ vật liệu cho kỹ thuật real-time PCR đánh giá biểu hiện của gen P.450

- Máy lắc Vortex có tốc độ tối đa 3000 vòng/phút

- Máy li tâm thường, rotor sử dụng ống 2ml có tốc độ tối đa 12.000 vòng/phút

- Máy li tâm lạnh, rotor sử dụng ống 2ml có thể điều khiển nhiệt độ từ 00C đến 990C, tốc độ tối đa 12,000 vòng/phút

- Máy li tâm mini, rotor sử dụng ống 2ml tốc độ tối đa 10,000 vòng/phút

- Máy lắc ủ nhiệt khô, block nhiệt sử dụng ống 2ml, có thể điều chỉnh nhiệt

độ từ 00C đến 990C, có khả năng đặt thời gian chính xác đến phút, tốc độ lắc tối đa 3,000 vòng/phút

- Giá đựng mẫu chứa được ống 1,5 ml, ống 0,5 ml và ống 0,2 ml

- Ống Eppendorf 1,5 ml (sạch, không chứa DNase và RNase)

- Ống có nắp vặn 1,5ml (sạch, không chứa DNase và RNase)

- Ống Falcon 50ml (sạch, không chứa DNase và RNase)

- Ống PCR 0,2 và 0,5ml (sạch, không chứa DNase và RNase)

- Kìm cắt mẫu, có thể đục lỗ giấy thấm đường kính 5 mm

- Giấy thấm Whatman 3M đã tiệt trùng

- Đèn cồn

- Đầu tip có phin lọc hoặc sạch không chứa DNase và RNase

- Bút đánh dấu

- Găng tay không bột tal

2.4.4 Dụng cụ, vật liệu cho kỹ thuật giải trình tự xác định các đột biến điểm trên gen quy định tính kháng knock down

Tương tự như của phương pháp Real-time

Hệ thống giải trình tự thế hệ mới Giải trình tự bằng máy giải trình tự thế hệ mới (Illumina)

Phân tích số liệu bằng phần mềm Sequence comparative analysis (SCAN)

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5.1.Thu thập muỗi tại các điểm nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang, tiến cứu điều tra muỗi và bọ gậy, thử nhạy cảm với các hóa chất diệt côn trùng, PCR xác định virút trong muỗi thu từ

21

thực địa

2.5.1.1 Chọn mẫu, cỡ mẫu nghiên cứu

- Đối với muỗi, bọ gậy Aedes thu thập ở thực địa: toàn bộ muỗi, bọ gậy

thu được từ các hộ gia đình

- Số lượng hộ gia đình cần điều tra thu thập muỗi trong nghiên cứu tuân thủ theo quy định của Bộ y tế “QĐ số 3711/QĐ-BYT ngày 19 tháng 9 năm

2014 của Bộ Y tế về việc ban hành Hướng dẫn giám sát và phòng chống bệnh sốt xuất huyết Dengue”: Mỗi xã phường điều tra 100 hộ gia đình trong một lần điều tra

2.5.1.2 Các bước tiến hành

Thu thập muỗi trú đậu trong và ngoài nhà 100 hộ dân

+ Sử dụng máy hút muỗi Mospack để thu thập toàn bộ muỗi trong và ngoài nhà (xung quanh dụng cụ chứa nước, vườn cây) Mỗi hộ gia đình thu thập muỗi trong vòng 15 phút vào ban ngày Muỗi được định loại, giữ sống nhân nuôi thành thế hệ F1

+ Ghi chép thông tin muỗi thu được vào biểu mẫu điều tra

Thu thập bọ gậy trong các dụng cụ chứa nước trong và ngoài nhà khu vực điều tra:

+ Đối với các dụng cụ chứa nước lớn như bể nước, thùng phi, chum, vại lớn, giếng nông… dùng vợt đường kính 22 cm để thu thập

+ Đối với các dụng cụ chứa nước nhỏ như cây cảnh, bẫy kiến, máng ăn gia súc, hốc cây dùng pipet và gáo lọc để thu thập toàn bộ bọ gậy Đối với các DCN là phế thải hay lốp xe, đổ toàn bộ nước ta khay chậu dùng pipet để thu thập toàn bộ bọ gậy

+ Ghi chép thông tin các mẫu bọ gậy thu thậpvào biểu mẫu điều tra

+ Nhân nuôi thành thế hệ F1

+ Định loại muỗi, bọ gậy thu thập từ thực địa theo khóa định loại của Vũ

22

Đức Hương, 1997

2.5.1.3 Biến số và đo lường biến số

- Số lượng muỗi thu được của muỗi loài tại từng địa điểm điều tra

- Số lượng bị gậy thu được tại từng địa điểm điều tra, nuôi theo từng địa điểm và định loại sau khi phát triển thành muỗi trưởng thành

2.5.1.4 Các chỉ số đánh giá:

Mật độ muỗi, nhà có muỗi, nhà có bọ gậy, Chỉ số các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:

- Kỹ thuật thu thập muỗi

- Kỹ thuật thu thập bọ gậy

- Kỹ thuật định loại muỗi

- Kỹ thuật nuôi muỗi

2.5.1.5 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu:

Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn

Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó

so sánh để có bộ số liệu chuẩn

2.5.1.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

Mật độ muỗi: MĐM (con/nhà) = số muỗi cái từng loài muỗi/số nhà điều tra Nhà có muỗi: NCM (%): Số nhà có muỗi cái/số nhà điều tra x 100

Nhà có bọ gậy: NCBG: Số nhà có BG/số nhà điều tra x 100

Chỉ số BI: BI = DCCN có bọ gậy/số hộ điều tra x 100

2.5.2 Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi với hóa chất diệt côn trùng

Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi thu thập từ các địa địa điểm nghiên cứu với 6 loại hóa chất thuộc 3 nhóm Chlo hữu co, phospho hữu cơ và pyrethoid

23

- Giấy tẩm hóa chất theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới gồm các

loại sau :

Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ tẩm trên giấy:

Pyrethroid Permethrin

Deltamethrin Lambda cyhalothrin Alpha cypermethrin

0,75%

0,05%

0,05%

30 mg/m2

2.5.2.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu

Muỗi cái Aedes thế hệ F1: 2-5 ngày tuổi, đủ chân cánh, khỏe mạnh

Tại mỗi địa điểm, với mỗi loại hóa chất cần tối thiểu 150 muỗi đủ tiêu chuẩn

2.5.2.2 Các bước tiến hành

Theo phương pháp của Tổ chức Y tế Thế giới, 2016 : Cho muỗi cái đủ tiêu chuẩn tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất 60 phút, theo dõi tỷ lệ muỗi ngã gục trong thời gian tiếp xúc và tính tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ Thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25±2oC, độ ẩm 70-80% Mỗi hóa chất thử ít nhất với 150 muỗi cái, trong đó 100 muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất, 50 muỗi tiếp xúc với giấy đối chứng trong 1 giờ Sau 24 giờ tính số muỗi chết và

tỷ lệ muỗi chết

24

Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm theo sơ đồ sau:

Chuẩn bị ống nghỉ Cho muỗi vào ống nghỉ

Muỗi nghỉ trước khi tiếp xúc với

giấy tẩm hóa chất Chuẩn bị ống tiếp xúc

Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang

Vệ sinh dụng cụ Bước 1 Chuẩn bị ống nghỉ:

Lấy một tờ giấy trắng sạch có kích thước 12 x 15 cm, ghi trên tờ giấy tên hóa chất thử nghiệm, nồng độ hóa chất, loài muỗi thử, sau đó cuộn thành hình trụ và lồng vào bên trong ống nghỉ (chú ý quay mặt tờ giấy có ghi chữ ra phía ngoài), dùng kẹp bằng thép để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống Lắp oongsn ghỉ vào tấm đế (tấm trượt)

Bước 2 Cho muỗi vào ống nghỉ

25

Dùng ống hút hoặc tubes thủng hai đầu để bắt muỗi Mỗi lần bắt muỗi không quá 10 con nếu sử dụng ống hút, nếu bắt bằng tubes thì mỗi lần bắt không quá 5 con Muỗi được cho vào ống nghỉ qua lỗ tròn đường kính 20 mm trên phiến giữa của tấm đế Cho 20 - 25 con muỗi vào một ống nghỉ Hết sức cẩn thận trong khi hút bắt muỗi và chuyển muỗi vào ống nghỉ để tránh gây thương tích cho muỗi, vì nếu muỗi bị thương tổn sẽ dẫn đến tỉ lệ muỗi chết cao trong thử nghiệm

Bước 3 Muỗi nghỉ trước khi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất

Sau khi đã cho đủ 20 - 25 con muỗi vào ống, để ống nghỉ ở tư thế thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên trong thời gian 1 giờ Sau đó quan sát xem có muỗi nào bị thương (gẫy chân, gẫy cánh ) hoặc có vật kí sinh bám hay không Nếu phát hiện thấy con muỗi nào bị thương hoặc có vật kí sinh thì dùng ống hút bắt ra khỏi ống và loại bỏ không dùng để thử nghiệm Bước 4 Chuẩn bị ống tiếp xúc

Cho vào mỗi ống tiếp xúc một tờ giấy tẩm hóa chất cần thử: cuộn tờ giấy tẩm thành hình trụ và lồng vào ống tiếp xúc Chú ý khi cuộn tờ giấy cho vào óng tiếp xúc phải để mặt tờ giấy có in tên hóa chất và nồng độ háo chất quay ra ngoài, tức là có thể đọc được tên hóa chất và nồng độ háo chất in trên giấy qua thành ống Dùng kẹp bằng đồng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống

Bước 5 Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc:

Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế của ống nghỉ (trong ống nghỉ đã có muỗi) Dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí mà ống nghỉ và ống tiếp xúc hoàn toàn thông với nhau (qua lỗ tròn đường kính 44 mm trên phiến giữa) Thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống nghỉ để muỗi bay từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc Sau khi muỗi đã bay hết sang ống tiếp xúc, dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí ngăn cách hoàn toàn ống nghỉ với ống tiếp xúc Sau đó tháo ống nghỉ (lúc này không còn muỗi ở phía trong) ra khỏi tấm đế

Bước 6 Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất:

- Để ống tiếp xúc (có muỗi ở trong) ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên phía trên Duy trì tư thế ống tiếp xúc như vậy trong suốt thời

- Ghi nhiệt độ, độ ẩm nơi để ống tiếp xúc

Bước 7 Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ:

Ngay sau khi kết thúc thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ bằng các thao tác ngược lại với bước 5 Nếu có muỗi ngã (knock-down) trong quá trình tiếp xúc, thì trước khi chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ cần phải để ống tiếp xúc nằm ngang và gõ rất nhẹ vào ống

để những con muỗi đã ngã rời khỏi phiến giữa của tấm đế Lắp ống nghỉ vào tấm đế của ống tiếp xúc Dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí mà ống nghỉ và ống tiếp xúc hoàn toàn thông với nhau Thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống tiếp xúc để muỗi di chuyển từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ Sau khi muỗi

đã di chuyển hết sang ống nghỉ, dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí ngăn cách hoàn toàn ống nghỉ với ống tiếp xúc Sau đó tháo ống tiếp xúc (lúc này không còn muỗi ở phía trong) ra khỏi tấm đế

Bước 8 Muỗi nghỉ sau tiếp xúc:

- Để ống nghỉ ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên Đặt một miếng bông tẩm nước đường Glucose 10% lên trên lưới Cần chú ý chỉ tẩm miếng bông với một lượng nước đường vừa phải để tránh không cho nước đường rơi vào trong ống nghỉ

- Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, mát mẻ với nhiệt độ không quá

300C Nếu điều kiện môi trường rất nóng và khô, thì phải cho oongsn ghỉ vào một chiếc hộp trong đó có treo khăn ẩm

- Ghi nhiệt độ tối đa và tối thiểu ở nơi để ống nghỉ trong khoảng thời gian theo dõi (24 giờ)

- Cần có biện pháp đề phòng kiến ăn muỗi trong ống nghỉ Cách phòng tránh kiến đơn giản là để các ống nghỉ lên một chiếc khay và đặt chiếc khay đó lên trên một chiếc khay khác có chứa nước

27

Bước 9 Đọc kết quả thử nghiệm:

- Tỷ lệ muỗi chết xác định sau 24 giờ Những con muỗi được coi là còn sống nếu chúng bay được, bất kể chúng còn chân hay không Vì vậy, không được coi những con muỗi nằm ở đáy ống nghỉ là những con muỗi chết, bởi vì muỗi thường rụng chân khi thử nghiệm với các hóa chất nhóm pyrethroid, và khi rụng chân thì muỗi sẽ nằm dưới đáy ống nghỉ mặc dù chúng vẫn còn sống

- Đề phòng những con muỗi còn sống bay mất, đặt một bát nhựa vào lồng muỗi 30 x 30 x 30 cm, sau đó cho ống nghỉ vào lồng, tháo ống nghỉ ra khỏi tấm đế và chuyển muỗi vào bát nhựa Dùng panh côn trùng gõ nhẹ vào miệng bát, nếu con muỗi nào còn sống chúng sẽ bay lên Sau đó dùng panh chạm nhẹ vào những con muỗi còn lại trong bát để kiểm tra xem có con nào còn sống hay không (nếu còn sống chúng sẽ bay lên khi panh chạm vào) Như vậy số lượng muỗi còn sống là những con bay lên khi bát được gõ nhẹ và khi đầu panh chạm vào cơ thể chúng

- Số muỗi còn lại không bay được thì coi là muỗi đã chết Chuyển bát đựng muỗi chết ra khỏi lồng rồi đếm số lượng muỗi trong bát, và đếm số lượng muỗi còn sống ở trong lồng Kết quả được ghi vào phiếu thử nghiệm

2.5.2.3 Chỉ số đánh giá

Tỷ lệ muỗi chết sau khi thử nghiệm

2.5.2.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu:

Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn

Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó

so sánh để có bộ số liệu chuẩn

2.5.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

- Nếu tỉ lệ muỗi chết trong lô đối chứng > 20% thì hủy bỏ thí nghiệm và làm lại Cần xác định nguyên nhân gây ra tỷ lệ chết cao ở muỗi đói chứng và tìm giải pháp khắc phục Một trong những lí do có thể dẫn đến tỷ lệ muỗi đối

28

chứng chết cao là muỗi đã được thu thập trong những ngôi nhà có sử dụng hóa chất diệt côn trùng (nhất là trong các nhà được phun tồn lưu) Trong trường hợp như vậy, cần phải tiến hành bắt muỗi ở những ngôi nhà không sử dụng hóa chất, hoặc tiến hành thử nghiệm với muỗi trưởng thành được nuôi lên từ bọ gậy

- Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng < 5% thì giữ nguyên tỷ lệ chết quan sát mà không cần điều chỉnh

- Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng nằm trong khoảng 5% - 20%, tỷ lệ muỗi chết ở lô tiếp xúc với hóa chất (tức muỗi thử nghiệm) được điều chỉnh theo công thức Abbott như sau:

% muỗi chết thực nghiệm - % muỗi chết đối chứng

100 - % muỗi chết đối chứng + Đánh giá độ nhạy cảm với hoá chất diệt côn trùng

- Tỷ lệ chết từ 98-100%: muỗi nhạy cảm với hoá chất

- Tỷ lệ chết từ 80-97%: muỗi có thể kháng với hoá chất, cần thử nghiệm thêm để khẳng định

- Tỷ lệ chết dưới 80%: muỗi kháng với hoá chất

2.5.3 Xác định biểu hiện của gen P450 bằng kỹ thuật real-time PCR

2.5.3.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu

Mỗi quần thể muỗi tối thiểu 50 mẫu cho phân tích sinh học phân tử Mỗi mẫu ít nhất 10 cá thể đã được thử nghiệm sinh học, muỗi tươi ngay sau khi thử nghiệm sinh học được bảo quản ở nhiệt độ tối thiểu -200C

29

dẫn của nhà sản xuất + Kỹ thuật qRT-PCR dùng để xác định sự tồn tại và mức độ hoạt động của một số gen P450 ở dòng muỗi kháng so với dòng muỗi nhạy cảm Sử dụng locus gen Ribosomal SP7 (RSP7) làm locus chuẩn đối chứng để xác định mức độ biểu hiện của các locus gen xác định tính kháng Phản ứng RT-PCR được tiến hành với bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR Nghiện cứu đã sử dụng 5 cặp mồi, (1) CYP6BB2F và CYP6BB2R, (2) CYP9M6F và CYP9M6R; (3) CYPJ26F và CYPJ26R; (4) CYP9J28F và CYP9J28R; (5) RPS7-Aae F và RPS7-Aae R theo thiết kế của Reid và cs, IshakIntan và cs

2.5.3.3 Chỉ số đánh giá

Mức độ khuếch đại gen (2-∆∆CT)

2.5.3.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu:

Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn

Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó

so sánh để có bộ số liệu chuẩn

2.5.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Phân tích mức bộ biểu hiện và số lần khuếch đại của của các gen theo phương pháp của Schittegen T.D, 2008 Mức độ khuếch đại gen (2-∆∆CT) được tính theo công thức sau: 2-∆∆CT = (CT gen nghiên cứu - CT gen đối chứng) mẫu

1 - (CT gen nghiên cứu - CT gen đối chứng) mẫu 2 Trong đó CT là chu kỳ ngưỡng của phản ứng Real-time PCR

2.5.4 Xác định các đột biến điểm trên kênh vận chuyển natri liên quan

đến tính kháng hóa chất của Aedes aegypti và Aedes albopictus

2.5.4.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu

Mỗi quần thể muỗi tối thiểu 50 mẫu cho phân tích sinh học phân tử Mỗi mẫu 1cá thể đã được thử nghiệm sinh học, muỗi tươi ngay sau khi thử nghiệm sinh học được bảo quản ở nhiệt độ tối thiểu- 200C

30

2.5.4.2 Các bước tiến hành

Tách chiết ADN từ chân muỗi theo phương pháp sau:

- Cắt chân của muỗi cho vào ống ly tâm 1,5 ml vô trùng,

- Thêm 50 μl dung dịch tách chiết (5 M NaCl, 1mM Tris-HCl pH 8,6, 0,5

- Hút dung dịch nổi sang ống mới

- Thêm 100 μl ethanol lạnh đã được thêm vào ống mới

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng / phút trong 20 phút

- Loại bỏ dịch nổi và hòa tan kết tủa trong 50 μl TE (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)

Để xác định các đột biến kdr tiềm năng, sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại hai đoạn của vùng mã hóa của gen VGSC kéo dài từ exon 19 đến exon 31 (bao gồm các vị trí mã hóa 989, 1011, 1016 và 1534) và sau đó giải trình tự trực tiếp các mẫu để xác định các đột biến

Phản ứng PCR sử dụng 10 pmol của mỗi loại mồi (Kawada et al 2014) và

20 ng ADN mẫu làm khuôn trong tổng phản ứng 25 μl chứa 1X Dream Taq , 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2 và 1đơn vi Dream Taq (Thermo, Hoa Kỳ) Điều kiện chu kỳ là 95 °C trong 1 phút và 35 chu kỳ 95 ° C trong 10 giây, 55

° C trong 30 giây và 72 ° C trong 30 giây, cuối cùng là 72 ° C trong 10 phút Phản ứng PCR được thực hiện trên gradient EP Eppendorf Mastercycler Xây dựng thư viện cDNA bằng kit mRNA-Seq Sample Prep (Part

1004898 Rev D, Illumina, USA), gắn adapter và tinh sạch trên gel agarose 2%

Làm giàu thư viện bằng PCR với cặp mồi gắn adapter đặc hiệu và tinh sạch bằng kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN, Germany)

2.5.4.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu:

Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn

Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó

so sánh để có bộ số liệu chuẩn

2.5.4.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

Để xác định các đột biến trên gen VGSC, kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự gen VGSC mã số XM019696519 trên Ngân hàng gen quốc