Luận văn nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ lá cây vú bò (ficus hirta vahl ) phân bố tại miền trung lào

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIỆT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ vi MỞ ĐẦU 1 Mục tiêu đề tài 2 Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Dự kiến kết đạt Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Họ Dâu tằm (Moraceae) 1.1.1 Giới thiệu chung chi Ficus 1.1.2 Đặc điểm thực vật loài Ficus racemosa L 1.1.3 Đặc điểm thực vật loài Ficus hispida L.f 1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Ficus benghalensis 11 1.1.5 Đặc điểm thực vật loài Ficus hirta Vahl 12 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ficus 14 1.2.1 Trên giới 14 1.2.2 Các nghiên cứu loài F hirta Vahl Việt Nam 22 1.2.3 Các nghiên cứu loài F hirta Vahl Lào 23 1.3 Hoạt tính sinh học Taraxerone Bergapten 23 1.3.1 Taraxerone 23 1.3.2 Bergapten 24 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Chương 2: THỰC NGHIỆM 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Hóa chất, thiết bị 25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Thiết bị 27 2.3 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách xác định cấu trúc chất phân lập 27 2.3.1 Xử lý mẫu thực vật 27 2.3.2 Chiết tách chất 27 2.3.3 Xác định cấu trúc chất 28 2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 28 2.4.1 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế Nitric oxide (NOs inhibition) từ dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 28 2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 28 2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 28 2.5 Thực nghiệm 29 2.5.1 Quá trình phân lập chất từ mẫu loài F hirta Vahl 29 2.5.2 Dự kiện phổ chất phân lập 31 2.5.3 Xác định khả ức chế Nitric oxide từ mẫu loài F hirta Vahl 31 2.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh 33 2.5.5 Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư 34 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 35 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập chất từ cặn chiết ethyl acetate mẫu loài F hirta Vahl 36 3.2 Xác định cấu trúc chất tách 36 3.2.1 Chất F1: Taraxerone 36 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 3.2.2 Chất F2: Bergapten 42 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 48 3.3.1 Kết nghiên cứu khả ức chế Nitric Oxide (NOs Iinhibtion) từ dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 48 3.3.2 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 50 3.3.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thu dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 51 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIỆT TẮT F1 Taraxerone F2 Bergapten DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 13C C-NMR KB Human epidermic carcinoma Hep G2 Hepatocellular carcinoma MCF-7 Human breast carcinoma NCI National Cancer Ínstitute DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium FBS Fetal bovine serum MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide LPS Lipopolysaccharides L-NMMA NG-Methyl-L-arginine acetate DMSO Dimethyl sulphoxide MIC Minimum inhibitor concentration (Nồng độ tối thiểu ức chế) MBC Minimum bactericidal concentration (Nồng độ tối thiểu diệt khuẩn IC50 Nồng độ gây tác dộng sinh học cho 50% mẫu thử nghiệm MHB Mueller-Hinton Broth MHA Mueller-Hinton Agar TSB Tryptic Soy Broth TSA Tryptic Soy Agar SDB Sabourand-2% dextrose broth SA Sabourand-4% dextrose Agar Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nghiêm tử 1H H-NMR HR-ESI-MS Phổ khối phân giải cao SKC Sắc ký cột ODC Mật độ quang học dung môi ODT Mật độ quang học mẫu thử SKC Sắc ký cột Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các loài chi Ficus tìm thấy vùng lãnh thổ Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học hợp chất 1-9 17 Bảng 1.3: Cấu trúc hóa học hợp chất 10-13 19 Bảng 1.4: Cấu trúc hóa học hợp chất 14-36 20 Bảng 1.5: Cấu trúc hóa học hợp chất 37-39 22 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR chất F1 38 Bảng 3.2: Số liệu phổ 13C-NMR chất F1 40 Bảng 3.3: So sánh phổ 1H-NMR, 13 C-NMR chất F1 hợp chất tham khảo 41 Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H-NMR chất F2 44 Bảng 3.5: Số liệu phổ 13C-NMR chất F2 46 Bảng 3.6: So sánh phổ 1H-NMR, 13 C-NMR chất F2 hợp chất tham khảo 47 Bảng 3.7: Khả ức chế sản sinh NO mẫu nghiên cứu 50 Bảng 3.8: Kết thử hoạt tính kháng sinh vật kiển định 51 Bảng 3.9: Kết xác định khả ức chế phát triển tế bào ung thư dịch chiết nước mẫu loài F hirta Vahl 53 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1: Lá lồi F racemosa L Hình 1.2: Quả loài F racemosa L Hình 1.3: Thân lồi F racemosa L Hình 1.4: Hình vẽ mơ tả lồi F racemosa L Hình 1.5: Thân, lồi F hispida L.f 10 Hình 1.6: Hình vẽ mơ tả lồi F hispida L.f 10 Hình 1.7: Thân lồi F benghalensis 11 Hình 1.8: Lá lồi F benghalensis 11 Hình 1.9: Quả loài F benghalensis 11 Hình 1.10: Hình vẽ mơ tả lồi F benghalensis 11 Hình 1.11: Thân loài F hirta Vahl 13 Hình 1.12: Lá lồi F hirta Vahl 13 Hình 1.13: Quả lồi F hirta Vahl 13 Hình 1.14: Hình vẽ mơ tả lồi F hirta Vahl 13 Hình 1.15: Cơng thức cấu tạo taraxerone 24 Hình 1.16: Cơng thức cấu tạo Bergapten 24 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết, tách chất từ mẫu lồi F hirta Vahl 30 Hình 3.1: Phổ 1H-NMR chất F1 37 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR chất F1 37 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR chất F1 38 Hình 3.4: Phổ 13C-NMR chất F1 39 Hình 3.5: Phổ 13C-NMR chất F1 39 Hình 3.6: Phổ HSQC chất F1 40 Hình 3.7: Cơng thức cấu tạo chất F1 42 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR chất F2 43 Hình 3.9: Phổ 1H-NMR chất F2 43 Hình 3.10: Phổ 13C-NMR chất F2 44 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình 3.11: Phổ 13C-NMR chất F2 45 Hình 3.12: Phổ 13C-NMR DEPT chất F2 45 Hình 3.13: Cơng thức cấu tạo chất F2: Bergapten 47 Hình 3.14: Đường chuẩn NaNO2 49 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hệ thực vật Lào nghiên cứu từ năm đầu kỷ XX, Le Comte chủ biên (1907-1951), nhà khoa học phát khoảng 11.000 loài thực vật Lào Kết cho thấy, Lào quốc gia thuộc vùng nhiệt đới nhiều rừng nguyên sinh, nơi chứa đựng giá trị đa dạng sinh học cao chưa khám phá Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm dân gian, nhiều loài thực vật sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho nhân dân Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng dược lý cách khoa học, tồn diện để quy hoạch, bảo tồn loài thuốc quý gặp nhiều khó khăn Những năm vừa qua, việc quản lý khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có nhiều điều bất cập khiến cho lượng lớn nguồn dược liệu Lào bị tàn phá nặng nề, nhiều nguồn gen thuốc quý bị tuyệt chủng Hiện nay, giới có xu hướng sử dụng hợp chất thiên nhiên có sẵn để điều chế dược phẩm, thực phẩm Trong số hợp chất thu được, có hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư, số khác lại thể hoạt tính kháng sinh Tác dụng chữa bệnh, tăng cường bảo vệ sức khoẻ người nhiều loài thực vật chủ yếu hợp chất tự nhiên mà chúng sinh tổng hợp, tích luỹ q trình sinh trưởng phát triển Lồi F hirta Vahl (cịn gọi Vú bị hay Vú chó) có tên khoa học Ficus hirta Vahl thuộc họ Dâu tằm (Moraceae), loại mọc hoang vùng đồi núi miền Trung Lào Đây khu vực có khí hậu nhiệt đới, nóng, ẩm phù hợp cho phát triển chi Ficus nói chung lồi F hirta Vahl nói riêng Người dân dùng làm thức ăn cho gia súc chữa bệnh cho người Loài F hirta Vahl thuốc quý, sử dụng Đông y để chữa bệnh thấp khớp, viêm thận, ho Người dân từ lâu sử dụng nhựa mủ trắng loài F hirta Vahl để trị tắc tia sữa, phong thấp Lá Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn loài F hirta Vahl giã nát đắp để chữa vết thương bầm tím, sa dày, sa tử cung… [3] Việc nghiên cứu loài F hirta Vahl Lào hạn chế Hiện dùng mức nghiên cứu phân loại thực vật, chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi F hirta Vahl Chính lý mà lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học từ Vú bò (Ficus hirta Vahl.) phân bố miền Trung Lào” Mục tiêu đề tài - Thành phần hóa học phần lồi F hirta Vahl mọc địa bàn miền Trung Lào - Kết hoạt tính sinh học dịch chiết chất tách Nội dung nghiên cứu Từ mục tiêu đặt ra, đề tài có nội dung sau: Thu mẫu loài F hirta Vahl phân bố miền Trung Lào, tạo tiêu xác định tên khoa học Tạo cặn chiết dung môi khác từ mẫu thu hái Phân lập xác định cấu trúc hóa học chất từ cặn chiết có hoạt tính Thử hoạt tính sinh học dịch chiết chất tách Phương pháp nghiên cứu 3.1 Cách tiếp cận Với mục tiêu đặt ra, cách tiếp cận đề tài là: - Thu thập tài liệu ngồi nước có liên quan đến đề tài, đặc biệt thành tựu gần lĩnh vực nghiên cứu chất có hoạt tính chi Ficus - Sử dụng phương pháp thử hoạt tính để thăm dị hoạt tính dịch chiết từ mẫu loài F hirta Vahl thu hái Sau nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết có hoạt tính tìm chất dịch chiết Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn - Kết hợp phương pháp nghiên cứu hoá học truyền thống, đề tài sử dụng phương pháp phân lập đạt hiệu cao chất phân cực khó phân tách 3.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng - Thu hái mẫu loài F hirta Vahl phân bố miền Trung Lào vào thời điểm hoa, sinh trưởng mạnh - Xử lý mẫu, chiết dung mơi hữu có độ phân cực khác - Tách chiết tạo dịch chiết cách chiết phân đoạn dung môi n-hexan, CH2Cl2, ethyl acetate - Tách tinh chế chất từ dịch chiết phương pháp sắc ký sắc ký cột thường, sắc ký cột nhanh với chất nhồi cột silicagel, sắc ký mỏng điều chế… - Xác định cấu trúc chất phân lập cách sử dụng kết hợp phương pháp phổ đại - Thử hoạt tính sinh học dịch chiết chất thu Dự kiến kết đạt - Thành phần hóa học mẫu loài F hirta Vahl mọc miền Trung Lào - Kết hoạt tính sinh học dịch chiết chất tách - Định hướng khoa học việc sử dụng chất từ phần lồi F hirta Vahl Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình P8: Phổ 1H chất F2 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình P9: Phổ 13C chất F2 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình P10: Phổ 13C chất F2 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình P11: Phổ 13C DEPT chất Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC _ Địachỉ: 18 Hoang Quoc Viet, CauGiay, Hanoi, Vietnam Tel: 844-38361774; Fax: 844-38363144; Email: thaodo@ibt.ac.vn KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ NITRIC OXIDE (NOs INHIBITION) (Kết thử nghiệm có giá trị với mẫu đem thử) - Tên mẫu: mẫu - Mẫu thử: Trên nhãn ghi tên mẫu rõ ràng - Ngày sản xuất: - Người gửi mẫu: - Thời hạn thử nghiệm: tháng 1/2019 - Tài liệu tham khảo:  Liao H, Banbury L, Liang H, Wang X, Lü X, Hu L, Wu J (2014) Effect of Honghua (Flos Carthami) on nitric oxide production in RAW 264.7 cells and α-glucosidase activity Journal of Traditional Chinese Medicine 34(3): 362-368  Combet S, Balligand JL, Lameire N, Goffin E, Devuyst O (2000) A specific method for measurement of nitric oxide synthase enzymatic activity in peritoneal biopsies Kidney International 57(1):332-8  Tsai PJ, Tsai TH, Yu CH, Ho SC (2007) Comparison of NO-scavenging and NO-suppressing activities of different herbal teas with those of green tea Food Chemistry, 103(1), 181-187  Bernardes NR, Heggdorne-Araújo M, Borges IF, Almeida FM, Amaral EP, Lasunskaia EB, Muzitano MF, Oliveira DB (2014) Nitric oxide production, inhibitory, antioxidant and antimycobacterial activities of the fruits extract and flavonoid content of Schinus terebinthifolius Revista Brasileira de Farmacognosia, 24(6), 644-650 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn  Cheenpracha S, Park EJ, Rostama B, Pezzuto JM, Chang LC (2010) Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A Marine drugs, 8(3), 429-437 I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Vật liệu - Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia- coli Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA) Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) hóa chất cần thiết khác hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v - Dòng tế bào: RAW 264.7 GS TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp 1.2 Phương pháp ni cấy tế bào in vitro - Dịng tế bào RAW264.7 nuôi cấy môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate, bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO) Tế bào cấy chuyển sau - ngày với tỉ lệ (1:3) nuôi tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2 1.3 Phương pháp xác định khả ức chế sản sinh NO tế bào macrophage RAW 264.7 - Tế bào RAW 274.7 đưa vào đĩa 96 giếng nồng độ x 105 tb/giếng nuôi tủ ấm 37oC 5% CO2 24h - Tiếp theo, môi trường nuôi cấy loại bỏ, thay mơi trường DMEM khơng có FBS 3h - Tế bào sau ủ mẫu nghiên cứu nồng độ khác 2h trước kích thích sản sinh yếu tố NO LPS (1 μg/ml) 24h Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn - Một số giếng không ủ mẫu mà sử dụng dung dịch pha mẫu coi đối chứng âm Trong đối chứng dương sử dụng NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) nồng độ 100; 20; 0.8 μg/ml - Nitrite (NO2-), xem thị cho việc tạo NO, xác định nhờ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA) Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) chuyển sang đĩa 96 thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μl of 1% (w/v) sulfanilamide 5% (v/v) phosphoric acid 50 μl 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha nước - Hỗn hợp ủ tiếp nhiệt độ phòng 10 phút hàm lượng nitrite đo máy microplate reader bước song 540 nm Môi trường DMEM không FBS sử dụng giếng trắng (blank) - Hàm lượng nitrite mẫu thí nghiệm xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 so sánh % với mẫu chứng âm (LPS) - Khả ức chế sản sinh NO mẫu xác định nhờ công thức: % ức chế = 100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS]*100 - Phép thử lặp lại lần để đảm bảo tính xác Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% hình thành NO) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 1.4 Phép thử sinh học xác định khả gây độc tế bào MTT - Chất thử (20 l) đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ thí nghiệm NO - Sau điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 l tế bào vào giếng khay 96 giếng có chất thử Trên đĩa thử, bố trí số giếng để làm đối chứng khơng có mẫu thử, có dung mơi pha mẫu DMSO10% Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn - Để đĩa nuôi cấy vào tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2, nuôi thời gian 72 - Sau 72 giờ, 10 µl MTT (nồng độ cuối mg/ml) cho vào giếng - Sau 4h, loại bỏ mơi trường, tinh thể formazan hịa tan 50 µl (DMSO) 100% - Giá trị OD đo bước sóng 540 nm máy quang phổ - Lượng tế bào sống sót tính theo cơng thức: % tế bào sống sót = OD (chất thử) – OD (đối chứng trắng) x 100% OD (DMSO) – OD (đối chứng trắng) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thí nghiệm trình bày hình bảng Hình P12: đường chuẩn NaNO2 Khả ức chế sản sinh NO mẫu nghiên cứu thể bảng sau: Bảng P1 Khả ức chế sản sinh NO mẫu nghiên cứu Nồng độ (µg/ml) 100 20 0.8 IC50 Ficus L-NMMA % ức chế NO % tế bào sống % ức chế NO % tế bào sống 80,14 75,16 103.98 85.85 14,61 91,29 82.91 92.59 3,55 95,77 30.94 95.37 -2,48 96,54 19.64 100.31 62.51±5.21 7.64±0.47 - Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Kết cho thấy: mẫu nghiên cứu có khả ức chế tế bào đại thực bào sinh NO mức trung bình với IC50 = 62.51 ± 5.21 µg/ml Chất đối chứng dương L - NMMA hoạt động ổn định thí nghiệm KẾT LUẬN  Mẫu nghiên cứu có khả ức chế tế bào đại thực bào sinh NO mức trung bình với IC50 = 62.51 ± 5.21 µg/ml Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỘ ĐỘC TẾ BÀO Thiết bị nghiên cứu Tủ ấm CO2 (INNOVA CO - 170); Tủ cấy sinh học an tồn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), Máy quang phổ (Genios Tecan), Bình nitro lỏng bảo quản tế bào dụng cụ thí nghiệm thơng thường khác Các dòng tế bào Các dòng tế bào ung thư người cung cấp ATCC gồm: KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mơ, dịng ln ln sử dụng phép thử độ độc tế bào, Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan Phương pháp Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro Viện ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển diệt tế bào ung thư điều kiện in vitro Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu nuôi cấy môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết phơi bò (FBS) thành phần cần thiết khác điều kiện tiêu chuẩn (5% CO 2, 37oC, độ ẩm 98%; vơ trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển khác Tế bào phát triển pha log sử dụng để thử độc tính Thử độc tế bào: 200 l dung dịch tế bào pha log nồng độ x 104 tế bào/ml vào giếng (đĩa 96 giếng) môi trường DMEM cho dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU Mẫu thử pha loãng cho đạt đến nồng độ cuối 128 g/ml nồng độ pha loãng thấp Ủ 370C, 5% CO2 ngày Đối chứng dương gồm 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml Đối chứng âm gồm 200 l môi trường nuôi cấy Ellipticine (Sigma) dùng làm chất tham khảo Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Sau ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0,2 mg/ml 370C giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đọc kết bước sóng 540 nm máy spectrophotometter Genios TECAN Phần trăm kìm hãm phát triển tế bào (Growth inhibition) tính tốn dựa số liệu đo mật độ quang học OD máy quang phổ TECAN theo công thức sau: Giá trị IC50 tính dựa kết số liệu phần trăm kìm hãm phát triển tế bào phần mềm máy tính table curve Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bảng P2: Kết xác định khả ức chế phát triển tế bào ung thư dịch chiết nước mẫu lồi F hirta Vahl Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thực dựa phương pháp dãy nồng độ môi trường lỏng Đây phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu mẫu thử thông qua giá trị thể hoạt tính MIC (minimum inhibitor concentration- nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration - nồng độ tối thiểu diệt khuẩn) Các chủng vi sinh vật kiểm định Bao gồm vi khuẩn nấm kiểm định gây bệnh người: - Bacillus subtilis (ATCC 6633): trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh - Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ da quan nội tạng - Lactobacillus fermentum (N4): vi khuẩn gram (+), loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt hệ tiêu hóa người động vật - Escherichia coli (ATCC 25922): vi khuẩn gram (-), gây số bệnh đường tiêu hóa viêm dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn - Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng da niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng tim, viêm ruột - Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột người động vật - Candida albicans (ATCC 10231): nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi trẻ em bệnh phụ khoa Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Môi trường nuôi cấy MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabourand-2% dextrose broth) SA (Sabourand- 4% dextrose agar) cho nấm Cách tiến hành 4.1 Pha loãng mẫu thử Mẫu ban đầu pha loãng DMSO nước cất tiệt trùng thành dãy nồng độ theo yêu càu mục đích thử Nồng độ thử cao 128 µg/ml 4.2 Thử hoạt tính Lấy 10µl dung dịch mẫu thử nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi khuẩn nấm có nồng độ 5.105 CFU/ml, 37oC/24h 4.3 Xử lý kết - Giá trị MIC xác định giếng có nồng độ chất thử thấp ức chế phát triển vi sinh vật - Giá trị IC50 tính tốn dựa số liệu đo độ đục môi trường nuôi cấy máy quang phổ TECAN phần mềm raw data ODtest – ODcontrol(+) IC (%)=100 x ODcontrol(-) – ODcontrol(+) - Giá trị MBC xác định số khuẩn lạc đĩa thạch 4.4 Chất tham khảo - Kháng sinh Ampicillin cho chủng vi khuẩn Gram (+) với giá trị MIC khoảng 0,004 - 1,2 µg/ml - Kháng sinh Cefotaxim cho chủng vi khuẩn Gram (-) với giá trị MIC khoảng 0,07 - 19,23µg/ml - Kháng nấm Nystatin cho chủng nấm với giá trị MIC khoảng 2,8 - 5,0 µg/ml Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bảng P3: Kết thử hoạt tính kháng sinh Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ... tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học từ Vú bị (Ficus hirta Vahl. ) phân bố miền Trung Lào? ?? Mục tiêu đề tài - Thành phần hóa học phần loài F hirta Vahl mọc địa bàn miền Trung Lào. .. cung… [3] Việc nghiên cứu loài F hirta Vahl Lào hạn chế Hiện dùng mức nghiên cứu phân loại thực vật, chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi F hirta Vahl Chính lý... biệt thành tựu gần lĩnh vực nghiên cứu chất có hoạt tính chi Ficus - Sử dụng phương pháp thử hoạt tính để thăm dị hoạt tính dịch chiết từ mẫu loài F hirta Vahl thu hái Sau nghiên cứu thành phần hóa