Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây khổ sâm (sophora flavescens ait ) trồng tại tây n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - CAO NGỌC MINH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp GS.TS Hồng Nghĩa Sơn Thành phố Hồ Chí Minh – 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận n n y l công tr nh nghi n cứu ƣ i s hƣ ng ẫn khoa học PGS TS Ngô Đại Nghiệp v GS TS Ho ng Nghĩa Sơn C c số liệu kết luận n l trung th c v m t phần đƣ c công ố c c tạp chí chuy n ngành Những trích ẫn v t i liệu tham khảo luận n có nguồn gốc x c th c Th nh phố Hồ Chí Minh ng y 05 tháng năm 2022 T c giả luận n, Cao Ngọc Minh Trang ii LỜI CẢM ƠN h Lu h H học Công ngh - Vi h ghi h i i n Sinh học Nhi h gi họ h ới, Học vi n Khoa g gh Vi hi N T g gi ể hoàn thành g Nghĩ Sơ - h g g lu n án Tôi xin trân trọng c ới: - PGS TS Ng Đ i Nghi h g i g h i gi GS TS H h họ g i h hi n lu ọi i i Th i n thu i h - PGS TS Nguyễn Thị Ph g Th o, TS Lê Thành Long ồng ó h ng góp ý q báu cho tơi q trình nghiên c u hồn thi n nghi p lu n án H - Học vi n Khoa học Công ngh - Vi h Vi t Nam, i h ki n thu i n Sinh học Nhi i g ới, trình th c hi ng gi ghi YD c phẩm Vimedimex 2, ThS thu th p hỗ tr phân tích m u g Đ i họ Khoa Công ngh , Khoa Công ngh i n thu i tài - Ban Giám hi u T i g gh h D g, ThS Nguyễn Khắc M nh – Nguyễn Huy Vỹ - Trung tâm Kiểm nghi ới M i T họ gi h họ - DS Nguyễn Tiến Hùng – Cty Cổ ph Vi n Nhi h i h T i i i g ng vi g, Ban chủ nhi m khoa CNSH, g ghi ng dụng h i gi g iế h h ă L ắ i h ghi ới gi g Tác giả Cao Ngọc Minh Trang ủ gh i h h g h họ i h b n bè ghi iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan th c vật học Khổ Sâm 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Mơ tả đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố sinh thái, thu hái chế biến .4 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng ƣ c lý Khổ Sâm 1.2 Tổng quan hoạt tính kháng oxy hóa 10 1.2.1 Gốc t stress oxy hóa 10 1.2.2 Chất kháng oxy hóa 12 1.2.3 Hoạt tính kháng oxi hóa flavonoid rễ Khổ sâm 14 1.3 Tổng quan hoạt tính kháng tế o ung thƣ: 15 1.3.1 Quá trình Apoptosis 15 1.3.2 Quá trình Necrosis 15 1.3.3 Hoạt tính kháng ung thƣ từ rễ Khổ sâm 17 1.3.4 Dòng tế o ung thƣ gan 18 1.3.5 Dòng tế bào ung thu vú 19 iv 1.4 Phƣơng ph p x c định matrine oxymatrine Khổ sâm 21 1.4.1 Định tính v định lƣ ng matrine .21 1.4.2 Phân lập matrine oxymatrine làm chất đối chiếu .22 CHƢƠNG VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Đối tƣ ng nghiên cứu .23 2.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu .23 2.1.2 Vật Liệu 23 2.1.3 Thiết bị sử dụng .24 2.2 Phƣơng ph p nghi n cứu 25 2.2.1 Định anh v đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu 25 2.2.2 Chiết xuất ƣ c liệu Khổ sâm định hƣ ng phân lập alkaloid matrine oxymatrine 29 2.2.3 Định lƣ ng polyphenol flavonoid tổng số 32 2.2.4 Phƣơng ph p x c định hoạt tính kháng oxy hóa .33 2.2.5 Nuôi cấy tế bào 34 2.2.6 Hoạt tính kháng tế o ung thƣ HepG2 v BT474 cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm 35 2.2.7 Phƣơng ph p thống kê 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40 3.1 Định anh v đánh giá chất lƣ ng ƣ c liệu .40 3.1.1 Định danh loài Khổ sâm trồng Tây Nguyên 40 3.1.2 Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu 42 3.2 Kết tách chiết m t số hoạt chất rễ Khổ sâm 49 3.2.1 Phân lập Matrine Oxymatrine phƣơng ph p sắc ký điều chế 49 3.2.2 X c định tổng polyphenol tổng flavonoi ƣ c liệu 56 3.2.2.1 Định tính thành phần flavonoi ƣ c liệu .56 3.2.2.2 Định lƣ ng h p chất polyphenol tổng số (TPC) 58 v 3.2.2.3 Định lƣ ng flavonoid tổng số 59 3.3 Kết hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết rễ Khổ sâm 61 3.4 Kết ức chế tế o ung thƣ .63 3.4.1 Ảnh hƣởng cao chiết phân đoạn t i s tăng sinh tế bào HepG2 BT474 .63 3.4.2 Ảnh hƣởng cao CHCl3 lên mật đ tế bào, hình thái tế bào nhân 66 3.4.3 Ảnh hƣởng cao CHCl3 lên chu kì tế bào 71 3.4.4 Ảnh hƣởng cao CHCl3 lên trình Apoptosis .73 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 81 Kết luận 81 Kiến nghị 81 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 82 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 83 PHỤ LỤC 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………… ………………………………….……… 83 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 95 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS ACN : : AIDS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid Acetonitrile : Acquired Immuno-deficiency Syndrome (h i chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) AR : Analytical Reagent (thuốc thử dùng cho phân tích) ATCC : American Type Culture Collection (B sƣu tập giống Mỹ) BT474 : DĐTQ Breast Tumor 474 (Dòng tế : o ung thƣ vú BT474) Dƣ c điển Trung Quốc DĐVN : Dƣ c điển Việt Nam DMEM : Môi trƣờng Dulbecco's Modified Eagle DMSO : Dimethylsulfoxide DNPH : 2,4-dinitrophenylhydrazin DPPH• : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA : Ethyl acetate EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid disodium salt EtOH : Ethanol FCR : Folin–Ciocalteu Reagent (thuốc thử Folin-Ciocalteu) FRAP : Ferric Re ucing Antioxi ant Power (năng l c khử sắt) FV : FRAP Value (chỉ số FRAP) GAE : Gallic acid Equivalent (đƣơng lƣ ng gallic acid) GSH : Glutathione HepG2 : Hepatoma G2 (Dòng tế HPLC : o ung thƣ gan HepG2) High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Khối phổ phân giải cao) IC50 : Inhibition concentration at 50 % (nồng đ ức chế 50 %) LOD : Loss On Drying (Mất khối lƣ ng làm khô) vii OD : Optical Density (Mật đ quang) PBS : Phosphate-buffered saline QE : RT- PCR: Quercetin Equivalent (đƣơng lƣ ng quercetin) Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction Rf : Retention factor (chỉ số lƣu giữ) RNS : Reactive Nitrogen Species (Các gốc t chứa Ni tơ) ROS : Reactive Oxygen Species (Các gốc t chứa Oxy) SFNP : Sophora Flavescens Nanoparticles SPE : Solid phase extraction (Chiết pha rắn) TFC : Total Flavonoid Content (hàm lƣ ng flavonoid tổng số) TLC : Thin layer Chromatography (Sắc ký l p mỏng) TPC số) : Total Phenolic Content (h m lƣ ng h p chất polyphenol tổng viii DANH MỤC BẢNG B ng 1.1: M t số dạng gốc t 11 B ng 1.2: Tính chất hóa lý matrine oxymatrine 21 B ng 2.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu .24 B ng 2.2: Chƣơng tr nh pha đ ng phân tách matrine oxymatrine .27 B ng 2.3: Chƣơng tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế 31 B ng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng Realtime RT- PCR cho gene liên quan t i s chết theo chƣơng tr nh 37 B ng 2.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lƣ ng Realtime RT- PCR 37 B ng 3.1: Kết search last NCBI .41 B ng 3.2: Kết đ ẩm, tro toàn phần tổng chất chiết nguyên liệu 44 B ng 3.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine oxymatrine .46 B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine oxymatrine từ rễ Khổ sâm 48 B ng 3.5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine oxymatrine 48 B ng 3.6: H m lƣ ng matrine oxymatrine cao phân đoạn EtOH 80 %, EA, CHCl3 v cao nƣ c 49 B ng 3.7: Tối ƣu l m dịch chiết ƣ c liệu c t OASIC MCX, sử dụng 200 mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát .50 B ng 3.8: Nhận danh flavonoid cao EA HPLC-HRMS 57 B ng 3.9: Kết hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết rễ Khổ sâm 61 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: B phận mặt đất (A) rễ (B) Khổ sâm Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid Khổ sâm Hình 1.3: Khung cấu trúc chung flavonoid .6 Hình 1.4: Phân iệt s kh c Apoptosis v Necrosis 16 Hình 1.5: Dịng tế bào ung thƣ gan HepG2 18 Hình 1.6: Dịng tế o ung thƣ vú BT474 20 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát 30 Hình 3.1: (A), (B) hình thái Khổ sâm năm tuổi đƣ c trồng Đắk Nông thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tƣơi (E) rễ Khổ sâm phơi khô, (F) mặt cắt ngang rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô chặt nhỏ, (H) b t rễ Khổ sâm .40 Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm 42 Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học (X10) 43 Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH rễ Khổ sâm phơi khô 44 Hình 3.5: Kết định tính alkaloi ƣ c liệu .46 Hình 3.6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine oxymatrine 47 Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX 51 Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine oxymatrine .52 Hình 3.9: Sắc ký đồ phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết matrine điều chế .54 Hình 3.10: Sắc ký đồ phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết oxymatrine điều chế .55 Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính flavonoid cao chiết EA 56 Hình 3.12: Tƣơng quan tuyến tính nồng đ gallic acid đ hấp thu quang 765 nm .58 Hình 3.13: Tƣơng quan tuyến tính nồng đ quercetin đ hấp thu quang 415 nm 59 Hình 3.14: Phân bố TPC TFC b t rễ Khổ sâm loại cao 60 Hình 3.15: Ảnh hƣởng cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) H2O (D) lên tế bào HepG2 .63 111 PHỤ LỤC 22: Tổng h p liệu khả gốc t ABTS+ cao tổng Mẫu Nồng độ (mg/mL) 0,00 0,05 0,10 Cao tổng 0,15 0,20 0,25 A 734 nm AA(%) ̅̅̅̅ SD 0,8650 0,7076 0,7064 0,7071 0,5765 0,5797 0,5749 0,4659 0,4654 0,4638 0,3674 0,3626 0,3681 0,2549 0,2575 0,2556 0,00 18,20 18,34 18,25 33,35 32,98 33,54 46,14 46,20 46,38 57,53 58,08 57,45 70,53 70,23 70,45 0,00 - 18,26 0,07 33,29 0,28 46,24 0,13 57,68 0,35 70,40 0,16 IC 50 (mg/mL) 0,17 PHỤ LỤC 23: Tổng h p liệu khả gốc t ABTS+ c c cao phân đoạn Mẫu Nồng độ (mg/mL) A 734 nm AA(%) AA tb SD 0,00 0,8350 - - - 0,5148 38,35 0,5161 0,5141 38,19 38,43 38,32 0,12 0,4766 42,92 0,4759 43,01 42,99 0,07 0,4755 43,05 0,3822 54,23 0,3807 54,41 54,38 0,13 0,3800 54,49 0,2648 0,2657 68,29 68,18 68,26 0,07 0,2645 68,32 0,2343 71,94 0,2336 72,02 71,98 0,04 0,2340 71,98 0,8350 - - - 0,6751 19,15 0,6758 19,07 19,16 0,10 0,6741 19,27 0,10 Cao CHCl3 0,12 0,19 0,27 0,31 0,00 0,02 IC 50 (mg/mL) 0,16 0,08 112 Cao EA 0,04 0,08 0,12 0,16 0,00 0,22 Cao EtOH 0,43 0,65 0,86 1,08 0,00 1,63 Cao Nƣớc 2,17 2,71 3,26 4,07 0,5646 0,5673 0,5661 0,4105 0,4090 0,4106 0,2812 0,2789 0,2798 0,1235 0,1250 0,1265 0,8350 0,6603 0,6591 0,6576 0,5725 0,5633 0,5802 0,4759 0,4779 0,4803 0,3980 0,3984 0,3916 0,3265 0,3228 0,3287 0,8500 0,6408 0,6362 0,6429 0,5731 0,5924 0,5836 0,5210 0,5468 0,5252 0,4705 0,4815 0,4775 0,4086 0,3956 0,3916 32,38 32,06 32,20 50,84 51,02 50,83 66,32 66,60 66,49 85,21 85,03 84,85 20,92 21,07 21,25 31,44 32,54 30,51 43,01 42,77 42,48 52,34 52,29 53,10 60,90 61,34 60,63 24,61 25,15 24,36 32,58 30,31 31,34 38,71 35,67 38,21 44,65 43,35 43,82 51,93 53,46 53,93 32,22 0,16 50,89 0,11 66,47 0,14 85,03 0,18 - - 21,08 0,16 31,50 1,01 42,75 0,26 52,57 0,46 60,96 0,36 - - 24,71 0,40 31,41 1,14 37,53 1,63 43,94 0,66 53,11 1,05 0,82 3,79 113 PHỤ LỤC 24: KẾT QUẢ WST - 1, Dòng tế bào BT474  Cao CHCl3 Giá trị OD mẫu thí nghiệm Lần Lần Lần 3 3,125 µg/mL 7,37E01 6,85E01 6,93E01 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL 6,92E-01 6,03E-01 6,81E-01 5,81E-01 6,79E-01 5,69E-01 25 µg/mL 5,15E01 4,05E01 5,21E01 50 µg/mL 4,53E01 4,62E01 4,05E01 100 µg/mL 3,29E01 3,72E01 3,58E01 Cách tính giá trị IC50 y = -14,66ln(x) + 116,27 R² = 0,978 IC50 =91,74 One Way Analysis of Variance Thýì Tý, Thng MýõÌi 16, 2019, 1:21:24 PM Data source: Data in Notebook1 Normality Test: Passed (P = 0,349) Equal Variance Test: Passed (P = 0,754) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 0,705 0,0281 0,0162 Col 0,6840,00725 0,00419 Col 3 0,585 0,0171 0,00989 Col 0,480 0,0651 0,0376 Col 0,440 0,0304 0,0175 Col 0,353 0,0219 0,0126 Giá tri OD mẫu thí nghiệm 3,125 6,25 12,5 25 50 100 µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 0,5777 0,5622 0,5141 0,4536 0,426 0,3983 Mean 6,94E-03 0,0132 3,86E-03 0,0142 0,0381 0,0823 Std Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 50,295 0,0590 52,168