Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU Nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong y học cổ truyền hiện nay đang đƣ c phát triển rất mạnh và có chiều sâu ở Việt Nam. Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đ i gió mùa, Việt Nam đƣ c đ nh gi l nƣ c đứng thứ 16 trên thế gi i về s phong phú, đa ạng sinh vật trong đó có đ đa ạng về cây thuốc. Để tăng th m tính đa ạng của cây thuốc Việt Nam và phong phú các bài thuốc trong y học cổ truyền thì việc di th c m t số cây thuốc có giá trị về trồng và phát triển l m ƣ c liệu cũng l m t việc làm rất cần thiết. Trong đó khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) l ƣ c liệu đã đƣ c sử ụng từ lâu trong y học cổ truyền phƣơng đông để chữa nhiều ệnh nhƣ chống loạn nhịp tim c c chứng vi m xuất huyết ti u ho l v ký sinh tr ng. Rễ của cây Khổ sâm (Sophorae Flavescentis Radix) đã đƣ c chứng minh trong thử nghiệm lâm sàng là không gây đ c đối v i con ngƣời. Các nghi n cứu tr n thế gi i cho thấy cao chiết từ rễ khổ sâm có chứa c c h p chất alkaloi v flavonoi có hoạt tính kh ng oxy hóa kh ng vi m kh ng khuẩn v ức chế s ph t triển của m t số ng tế o ung thƣ nhƣ HepG2, MCF7 và A549. Tuy nhi n cơ chế tăng sinh ị ức chế trong tế bào HepG2 v BT474 ƣ i t c đ ng của chiết xuất từ rễ Khổ sâm vẫn chƣa đƣ c nghiên cứu chuyên sâu. Tại Việt Nam, m t số chế phẩm đƣ c sản xuất từ cây Khổ sâm nhƣ Ninh tâm vƣơng h tr trong ệnh lý nhịp tim nhanh Nữ vƣơng h tr trong điều trị vi m nhiễm phụ khoa ở nữ gi i, tuy nhiên chủ yếu nhập nguyên liệu từ Trung Quốc. Hệ quả là nguồn nguyên liệu còn bị đ ng và các đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu chƣa kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay, khổ sâm đã đƣ c i th c trồng tại Đắk Nông - Tây Nguy n bởi Công ty Cổ phần Dƣ c phẩm BV Pharma. Từ đó, các nghiên cứu đ nh giá chất lƣ ng ƣ c liệu nhằm x c định thành phần h m lƣ ng hoạt chất có hoạt tính sinh học v x c định đ c tính là việc cần phải đƣ c th c hiện giúp chủ đ ng nguồn ƣ c liệu trong sản xuất v đảm ảo chất lƣ ng nguy n liệu. Trong định hƣ ng chiến lƣ c của ng nh ƣ c Việt Nam đến năm 2020 v tầm nh n đến năm 2030 cũng đã đề ra mục tiêu phát triển để Việt Nam có thể chủ đ ng đƣ c 60 % về thuốc v o năm 2020 m trong đó chú trọng đến thuốc có nguồn gốc th c vật. Theo báo cáo của cục quản lý ƣ c và tổ chức IQVIA năm 2020 thuốc sản xuất trong nƣ c chiếm 47 % nhu cầu sử dụng. 2 Tuy vậy ƣ c điển Việt Nam V vẫn chƣa có chuy n luận ri ng về ƣ c liệu rễ khổ sâm đồng thời hiện nay chỉ có m t v i công tr nh nghi n cứu về ƣ c liệu khổ sâm tại Việt Nam, gây khó khăn trong đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu thô v chế phẩm chứa ƣ c liệu n y trong nƣ c v ngoại nhập. Từ những lý do cấp thiết tr n đề t i: “Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.)” trồng tại Tây Nguyên” đƣ c th c hiện. Mục tiêu nghiên cứu của luận án: - Đ nh gi đƣ c m t số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết xuất từ rễ Khổ sâm trồng tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu chính của luận án: - Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu - Nghiên cứu tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm. - Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá của các cao chiết rễ Khổ sâm. - Nghiên cứu khả năng kh ng ung thƣ của cao chiết rễ Khổ sâm trên các dòng tế o ung thƣ gan HepG2 v ng tế o ung thƣ vú BT474.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - CAO NGỌC MINH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2022 iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan th c vật học Khổ Sâm 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Mơ tả đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố sinh thái, thu hái chế biến .4 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng ƣ c lý Khổ Sâm 1.2 Tổng quan hoạt tính kháng oxy hóa 10 1.2.1 Gốc t stress oxy hóa 10 1.2.2 Chất kháng oxy hóa 12 1.2.3 Hoạt tính kháng oxi hóa flavonoid rễ Khổ sâm 14 1.3 Tổng quan hoạt tính kháng tế o ung thƣ: 15 1.3.1 Quá trình Apoptosis 15 1.3.2 Quá trình Necrosis 15 1.3.3 Hoạt tính kháng ung thƣ từ rễ Khổ sâm 17 1.3.4 Dòng tế o ung thƣ gan 18 1.3.5 Dòng tế bào ung thu vú 19 iv 1.4 Phƣơng ph p x c định matrine oxymatrine Khổ sâm 21 1.4.1 Định tính v định lƣ ng matrine .21 1.4.2 Phân lập matrine oxymatrine làm chất đối chiếu .22 CHƢƠNG VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Đối tƣ ng nghiên cứu .23 2.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu .23 2.1.2 Vật Liệu 23 2.1.3 Thiết bị sử dụng .24 2.2 Phƣơng ph p nghi n cứu 25 2.2.1 Định anh v đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu 25 2.2.2 Chiết xuất ƣ c liệu Khổ sâm định hƣ ng phân lập alkaloid matrine oxymatrine 29 2.2.3 Định lƣ ng polyphenol flavonoid tổng số 32 2.2.4 Phƣơng ph p x c định hoạt tính kháng oxy hóa .33 2.2.5 Nuôi cấy tế bào 34 2.2.6 Hoạt tính kháng tế o ung thƣ HepG2 v BT474 cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm 35 2.2.7 Phƣơng ph p thống kê 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40 3.1 Định anh v đánh giá chất lƣ ng ƣ c liệu .40 3.1.1 Định danh loài Khổ sâm trồng Tây Nguyên 40 3.1.2 Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu 42 3.2 Kết tách chiết m t số hoạt chất rễ Khổ sâm 49 3.2.1 Phân lập Matrine Oxymatrine phƣơng ph p sắc ký điều chế 49 3.2.2 X c định tổng polyphenol tổng flavonoi ƣ c liệu 56 3.2.2.1 Định tính thành phần flavonoi ƣ c liệu .56 3.2.2.2 Định lƣ ng h p chất polyphenol tổng số (TPC) 58 v 3.2.2.3 Định lƣ ng flavonoid tổng số 59 3.3 Kết hoạt tính kháng oxy hố cao chiết rễ Khổ sâm 61 3.4 Kết ức chế tế o ung thƣ .63 3.4.1 Ảnh hƣởng cao chiết phân đoạn t i s tăng sinh tế bào HepG2 BT474 .63 3.4.2 Ảnh hƣởng cao CHCl3 lên mật đ tế bào, hình thái tế bào nhân 66 3.4.3 Ảnh hƣởng cao CHCl3 lên chu kì tế bào 71 3.4.4 Ảnh hƣởng cao CHCl3 lên trình Apoptosis .73 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 81 Kết luận 81 Kiến nghị 81 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 82 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 83 PHỤ LỤC 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………… ………………………………….……… 83 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 95 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS ACN : : AIDS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid Acetonitrile : Acquired Immuno-deficiency Syndrome (h i chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) AR : Analytical Reagent (thuốc thử dùng cho phân tích) ATCC : American Type Culture Collection (B sƣu tập giống Mỹ) BT474 : DĐTQ Breast Tumor 474 (Dòng tế : o ung thƣ vú BT474) Dƣ c điển Trung Quốc DĐVN : Dƣ c điển Việt Nam DMEM : Môi trƣờng Dulbecco's Modified Eagle DMSO : Dimethylsulfoxide DNPH : 2,4-dinitrophenylhydrazin DPPH• : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA : Ethyl acetate EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid disodium salt EtOH : Ethanol FCR : Folin–Ciocalteu Reagent (thuốc thử Folin-Ciocalteu) FRAP : Ferric Re ucing Antioxi ant Power (năng l c khử sắt) FV : FRAP Value (chỉ số FRAP) GAE : Gallic acid Equivalent (đƣơng lƣ ng gallic acid) GSH : Glutathione HepG2 : Hepatoma G2 (Dòng tế HPLC : o ung thƣ gan HepG2) High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Khối phổ phân giải cao) IC50 : Inhibition concentration at 50 % (nồng đ ức chế 50 %) LOD : Loss On Drying (Mất khối lƣ ng làm khô) vii OD : Optical Density (Mật đ quang) PBS : Phosphate-buffered saline QE : RT- PCR: Quercetin Equivalent (đƣơng lƣ ng quercetin) Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction Rf : Retention factor (chỉ số lƣu giữ) RNS : Reactive Nitrogen Species (Các gốc t chứa Ni tơ) ROS : Reactive Oxygen Species (Các gốc t chứa Oxy) SFNP : Sophora Flavescens Nanoparticles SPE : Solid phase extraction (Chiết pha rắn) TFC : Total Flavonoid Content (hàm lƣ ng flavonoid tổng số) TLC : Thin layer Chromatography (Sắc ký l p mỏng) TPC số) : Total Phenolic Content (h m lƣ ng h p chất polyphenol tổng viii DANH MỤC BẢNG B ng 1.1: M t số dạng gốc t 11 B ng 1.2: Tính chất hóa lý matrine oxymatrine 21 B ng 2.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu .24 B ng 2.2: Chƣơng tr nh pha đ ng phân tách matrine oxymatrine .27 B ng 2.3: Chƣơng tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế 31 B ng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng Realtime RT- PCR cho gene liên quan t i s chết theo chƣơng tr nh 37 B ng 2.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lƣ ng Realtime RT- PCR 37 B ng 3.1: Kết search last NCBI .41 B ng 3.2: Kết đ ẩm, tro toàn phần tổng chất chiết nguyên liệu 44 B ng 3.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine oxymatrine .46 B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine oxymatrine từ rễ Khổ sâm 48 B ng 3.5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine oxymatrine 48 B ng 3.6: H m lƣ ng matrine oxymatrine cao phân đoạn EtOH 80 %, EA, CHCl3 v cao nƣ c 49 B ng 3.7: Tối ƣu l m dịch chiết ƣ c liệu c t OASIC MCX, sử dụng 200 mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát .50 B ng 3.8: Nhận danh flavonoid cao EA HPLC-HRMS 57 B ng 3.9: Kết hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết rễ Khổ sâm 61 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: B phận mặt đất (A) rễ (B) Khổ sâm Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid Khổ sâm Hình 1.3: Khung cấu trúc chung flavonoid .6 Hình 1.4: Phân iệt s kh c Apoptosis v Necrosis 16 Hình 1.5: Dịng tế bào ung thƣ gan HepG2 18 Hình 1.6: Dòng tế o ung thƣ vú BT474 20 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát 30 Hình 3.1: (A), (B) hình thái Khổ sâm năm tuổi đƣ c trồng Đắk Nông thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tƣơi (E) rễ Khổ sâm phơi khô, (F) mặt cắt ngang rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô chặt nhỏ, (H) b t rễ Khổ sâm .40 Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm 42 Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học (X10) 43 Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH rễ Khổ sâm phơi khơ 44 Hình 3.5: Kết định tính alkaloi ƣ c liệu .46 Hình 3.6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine oxymatrine 47 Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX 51 Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine oxymatrine .52 Hình 3.9: Sắc ký đồ phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết matrine điều chế .54 Hình 3.10: Sắc ký đồ phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết oxymatrine điều chế .55 Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính flavonoid cao chiết EA 56 Hình 3.12: Tƣơng quan tuyến tính nồng đ gallic acid đ hấp thu quang 765 nm .58 Hình 3.13: Tƣơng quan tuyến tính nồng đ quercetin đ hấp thu quang 415 nm 59 Hình 3.14: Phân bố TPC TFC b t rễ Khổ sâm loại cao 60 Hình 3.15: Ảnh hƣởng cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) H2O (D) lên tế bào HepG2 .63 x Hình 3.16: Ảnh hƣởng cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) H2O (D) lên tế bào BT474 64 Hình 3.17: Ảnh hƣởng cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên s tăng sinh tế bào ung thƣ BT474 a c : kh c iệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05) 64 Hình 3.18: S thay đổi hình thái tế bào HepG2 xử lý v i mức nồng đ cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm: 3,125 µg/mL (A), 6,25 µg/mL (B), 12,5 µg/mL (C), 25 µg/mL (D), 50 µg/mL (E) 100 µg/mL (F) đ phóng đại x 100 .66 Hình 3.19: Đƣờng tuyến tính mật đ tế bào/ giếng v i giá trị OD tƣơng ứng đƣ c đo ƣ c sóng 450 nm .66 Hình 3.20: Mật đ tế bào HepG2/giếng xử lý v i mức nồng đ khác cao chiết CHCl3 67 Hình 3.21: Tỉ lệ quẩn thể tế bào HepG2 xử lý v i mức nồng đ cao chiết CHCl3 (A) Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể tế o nh thƣờng, Q3: quần thể tế bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào apoptosis mu n (B) *** khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,001), ** khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.01) 68 Hình 3.22: Ảnh hƣởng cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình thái nhân A (0 mg/L) , B (1 µg/mL), C (10 µg/mL), D (100 µg/mL); Thang đo: 30 µm .69 Hình 3.23: Ảnh hƣởng cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình dạng trịn nhân (Nuclear round shape) a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05) 70 Hình 3.24: Tỉ lệ tế bào pha G0/G1 G2/M đƣ c xử lý v i cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm nồng đ khác 71 Hình 3.25: Tỉ lệ tế bào pha G0/G1 G2/M đƣ c xử lý v i cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm nồng đ khác a, b, c, d: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05) 72 Hình 3.26: S biểu mRNA gene p53, Bcl-2, Caspase 9, Caspase Bax tế bào HepG2 thông qua phản ứng Realtime-PCR sau 24h 48h cảm ứng CHCl3 v nhóm đối chứng 73 Hình 3.27: Tỉ lệ tế bào nh thƣờng ƣ i s cảm ứng dịch chiết sau 24h, 48h 72h so v i nhóm đối chứng (*p