Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Hoạt Tính Ức Chế Enzym Xanthine Oxidase Của Củ Ráy Dại (Alocasia Odora K. Koch).Pdf

Untitled N G U Y Ễ N T H Ị H U Y Ề N BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Huyền NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZY[.]

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ HUYỀN Nguyễn Thị Huyền NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE CỦA CỦ RÁY DẠI (ALOCASIA ODORA K KOCH) HÓA HỮU CƠ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỮU CƠ 2022 Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Huyền NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE CỦA CỦ RÁY DẠI (ALOCASIA ODORA K KOCH) Chuyên ngành : Hóa hữu Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ THU HÀ Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Những nội dung luận văn “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch)” thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thu Hà Các kết trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm vấn đề liên quan đến nội dung luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Thị Huyền LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Hóa hữu với đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch)” thực Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thu Hà Trong suốt trình thực luận văn, nhận định hướng khoa học, hỗ trợ, quan tâm động viên giáo viên hướng dẫn Bằng tất kính trọng, lịng biết ơn, xin gửi tới TS Nguyễn Thị Thu Hà lời cảm ơn chân thành Tôi xin cảm ơn đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam mã số VAST04.09/21-22, tài trợ kinh phí để tơi thực nội dung nghiên cứu luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện, Phịng Đào tạo, thầy giáo tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn cán bộ, nghiên cứu viên Phịng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi suốt q trình thực thí nghiệm thuộc phạm vi thực luận văn Luận văn tốt nghiệp khơng tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong nhận ý kiến đóng góp q báu từ q thầy để luận văn hoàn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Thị Huyền MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ………………………………………vii MỞ ĐẦU 01 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 03 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI RÁY ALOCASIA 03 1.1.1 Sơ lược chi ráy Alocasia 03 1.1.2 Đặc điểm Ráy dại (Alocasia odora K Koch) 03 1.1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước 04 1.1.4 Tình hình nghiên cứu nước 06 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT ALKALOID 08 1.2.1 Định nghĩa 08 1.2.2 Phân loại 09 1.2.3 Tính chất vật lý 10 1.2.4 Tính chất hóa học 11 1.2.5 Hoạt tính sinh học 11 1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYM XANTHINE OXIDASE 12 1.3.1 Đặc điểm 12 1.3.2 Cơ chế 13 1.3.3 Vai trò 13 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.2 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 15 2.2.1 Thiết bị hóa chất tách chiết mẫu thực vật 15 2.2.2 Thiết bị hóa chất thử hoạt tính sinh học 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Các phương pháp ngâm chiết 16 2.3.2 Xử lý ngâm chiết mẫu thực vật 17 2.3.3 Các phương pháp phân tích sắc ký 18 2.3.4 Tạo phân đoạn từ cặn chiết 21 2.3.5 Phân lập chất từ dịch chiết củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch) 22 2.3.6 Các phương lý hóa quang phổ xác định cấu trúc 23 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC 27 3.1.1 Hợp chất AO1 (Alocasin A) 27 3.1.2 Hợp chất AO2 (Hyrtiosin B) 31 3.1.3 Hợp chất AO5 (Hyrtiosulawesine) 35 3.2 HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM XANTHIN OXYDASE 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC……………………………………………………………………48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẤT H-NMR, 13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1chiều A indica : Alocasia indica A macrorrhiza : Alocasia macrorrhiza A odora : Cây Ráy dại (Alocasia odora) EtOAc : Ethyl acetat HMBC, HSQC : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều IC50 : nồng độ ức chế 50% hoạt động enzym MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry – MS) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) OD : Độ hấp thụ quang (OD) XO : Enzym Xanthine oxidase (XO; EC 1.17.3.2) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất AO1 28 Bảng 3.2 Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất AO2 32 Bảng 3.3 Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất AO5 36 Bảng 3.4 Khả ức chế enzym XO in vitro dịch chiết EtOAc hợp chất nồng độ khác 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Ráy dại (Alocasia odora K Koch) 04 Hình 1.2 Một số hợp chất phân lập từ chi Alocasia giới 06 Hình 1.3 Một số hợp chất phân lập từ loài A macrorrhiza thu hái Việt Nam 08 Hình 1.4 Sự chuyển hóa axit uric thể enzym xanthine oxidase 13 Hình 2.1 Củ Ráy dại - Alocasia odora K Koch 15 Sơ đồ Sơ đồ ngâm chiết củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch) 17 Hình 2.2 Sắc khí mỏng chấm chạy dung môi 19 Hình 2.3 Sắc ký cột 21 Sơ đồ Sơ đồ tạo phân đoạn từ cặn chiết EtOAc củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch) 21 Sơ đồ Sơ đồ phân lập chất từ cặn EtOAc củ Ráy dại 22 Hình 3.1 Phổ MS hợp chất AO1 27 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất AO1 28 Hình 3.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AO1 29 Hình 3.4 Phổ HSQC giãn rộng hợp chất AO1 29 Hình 3.5 Một số tương tác phổ HMBC hợp chất AO1 30 Hình 3.6 Phổ HMBC hợp chất AO1 30 Hình 3.7 Cấu trúc hóa học hợp chất AO1 31 Hình 3.8 Phổ MS hợp chất AO2 31 Hình 3.9 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất AO2 32 Hình 3.10 Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất AO2 33 Hình 3.11 Phổ HSQC giãn rộng hợp chất AO2 33 Hình 3.12 Phổ HMBC hợp chất AO2 34 Hình 3.13 Một số tương tác phổ HMBC hợp chất AO2 34 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học hợp chất AO2 35 Hình 3.15 Phổ MS hợp chất AO5 35 Hình 3.16 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất AO5 37 Hình 3.17 Phổ 13C-NMR hợp chất AO5 37 Hình 3.18 Phổ HSQC giãn rộng hợp chất AO5 38 Hình 3.19 Phổ HMBC giãn rộng hợp chất AO5 38 Hình 3.20 Một số tương tác phổ HMBC hợp chất AO5 39 Hình 3.21 Cấu trúc hóa học hợp chất AO5 39 Hình 3.22 Các hợp chất alkaloid phân lập từ củ Ráy dại 39 Hình 3.23 Tác dụng ức chế enzyme XO củ Ráy dại (Alocasia odora) 41 41 Kết Bảng 3.4 cho thấy, tác dụng ức chế enzym XO cặn chiết EtOAc tăng dần theo nồng độ Ở nồng độ 128 µg/mL, cặn chiết ức chế hoạt động enzyme XO 74%, với giá trị IC50 50.58 ± 3.57 µg/mL Trong hợp chất alkaloid phân lập từ cặn EtOAc, hợp chất AO2 (Hyrtiosin B) thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro mạnh với % ức chế 87% nồng độ 128 µg/mL, giá trị IC50 14.19 ± 1.5 µg/mL Tiếp theo hợp chất AO1 (Alocasin A) với % ức chế đạt 85% nồng độ 128 µg/mL, giá trị IC50 28.57 ± 2.46 µg/mL Hợp chất AO5 (Hyrtiosulawesine) thể tác dụng ức chế enzym XO với giá trị IC50 32.0 ± 1.37 µg/mL Ở nồng độ 128 µg/mL, hợp chất ức chế enzyme XO 82 % Tiến hành với mẫu thử, Allopurinol cho thấy tác dụng ức chế enzyme XO mạnh với giá trị IC50 2.17 ± 0.15 µg/mL 60 50,58 Giá trị IC50 50 40 32 28,57 30 20 14,19 10 2,17 Cặn EtOAc AO1 AO2 AO5 Allopurinol Hình 3.23 Tác dụng ức chế enzyme XO củ Ráy dại (Alocasia odora) Allopurinol thuốc sử dụng rộng rãi lâm sàng để điều trị tăng gút, có tác dụng hạ acid uric máu thông qua chế ức chế hoạt động enzym XO, thường sử dụng làm chất đối chứng thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO Trong phương pháp này, Allopurinol thể ức chế enzym XO rõ rệt với giá trị IC50 thấp Giá trị tương đối sát với khảo sát tiến hành trước đây, dùng để đối chứng trực 42 tiếp với giá trị IC50 cặn chiết hợp chất thu từ nghiên cứu [38], [39] Từ kết thử nghiệm cho thấy, củ Ráy dại có tiềm hỗ trợ điều trị bệnh gout, nhiên đến chưa có báo cáo tác dụng ức chế enzyme XO lồi thực vật Do cần có thêm nghiên cứu chuyên sâu để khẳng định sở khoa học tác dụng chữa bệnh củ Ráy dại (Alocasia odora K Kock) 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất alkaloid alocasin A (AO1), hyrtiosin B (AO2) hyrtiosulawesine (AO5) từ cặn chiết EtOAc củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch) - Đã đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase mơ hình invitro cặn chiết EtOAc chất phân lập Kết thử nghiệm cho thấy hợp chất AO2 (Hyrtiosin B) thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro mạnh với giá trị IC50 14.19±1.5 µg/mL Tiếp theo hợp chất AO1 (Alocasin A) với giá trị IC50 28.57±2.46 µg/mL Hợp chất AO5 (Hyrtiosulawesine) thể tác dụng ức chế enzym XO với giá trị IC50 32.0±1.37 µg/mL Chất tham khảo Allopurinol cho thấy tác dụng ức chế enzyme XO mạnh với giá trị IC50 2.17±0.15 µg/mL KIẾN NGHỊ Dựa vào kết đạt được, đề nghị tiếp tục thử nghiệm khả hạ axit uric cặn chiết củ Ráy dại mơ hình động vật thực nghiệm invivo 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Singh G., Lingala B., and Mithal A., 2019, Gout and hyperuricaemia in the USA: prevalence and trends, Rheumatology (Oxford), 58(12), pp 2177– 2180 [2] Conen D et al., 2004, Prevalence of hyperuricemia and relation of serum uric acid with cardiovascular risk factors in a developing country, BMC Public Health, 4(9) :762820 doi:10.1155/2015/762820 [3] Perlstein TS et al, 2006, Uric Acid and the Development of Hypertension, Hypertension, 48(6), pp 1031–1036 [4] Dehghan A., Hoek H., Sịbrands EJ et al, 2008, High serum uric acid as a novel risk factor for type diabetes, Diabetes Care, 31(2), pp 361–362 [5] Desai RJ., Franklin JM., Spoendlin A et al, 2018, An evaluation of longitudinal changes in serum uric acid levels and associated risk of cardiometabolic events and renal function decline in gout, PLoS One, 13(2): e0193622 [6] Pillinger MH., Rosenthal P and Abeles AM., 2007, Hyperuricemia and gout: New insights into pathogenesis and treatment, Bull NYU Hosp Jt Dis., 65(3), pp 215–221 [7] Oliveira EP., Burini RC., 2012, High plasma uric acid concentration: causes and consequences, Diabetol Metab Syndr 4(1), pp 1–7 [8] Zarepour M., Kaspari K., Stagge R et al, 2010, Xanthine dehydrogenase AtXDH1 from Arabidopsis thaliana is a potent producer of superoxide anions via its NADH oxidase activity, Plant Mol Biol., 72(3), pp 301–310 [9] Cotelle N., 2001, Role of flavonoids in oxidative stress, Curr Top Med Chem., 1(6), pp 569–590 [10] Đỗ Tất Lợi, 2000, “Cây Ráy”, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, p 122 [11] Ongpoy RC, 2017, The Medicinal Properties of the Alocasia Genus  : A Systematic Review, JAASP, 6(1), pp 25–33 [12] Moon JM., Lee BK., and Chun BJ., 2011, Toxicities of raw Alocasia odora,” 45 Hum Exp Toxicol., 30(10), pp 1720–1723 [13] Nguyễn Văn Dư, Bùi Văn Hướng, Nguyễn Thị Vân Anh cộng sự, 2013, Cây Ráy (Alocasia odora K Koch), kinh nghiệm sử dụng, chế biến đặc điểm phân biệt với loài khác, Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 5, pp 993–997 [14] Đỗ Huy Bích, 2003, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [15] Huang W., Yi X., Feng J el al, 2017, Piperidine alkaloids from Alocasia macrorrhiza, Phytochemistry, 143, pp 81–86 [16] Elsbaey M., Ahmed KFM., Elsabai MF el al, 2017, Cytotoxic constituents of Alocasia macrorrhiza, Z Naturforsch C., 72(1–2), pp 21–25 [17] Zhu LH., Chen C., Wang H et al, 2012, Indole Alkaloids from Alocasia macrorrhiza, Chem Pharm Bull (Tokyo)., 60(5), pp 670–673 [18] Peng Q., Cai H., Sun X et al, 2013, Alocasia cucullata exhibits strong antitumor effect in vivo by activating antitumor immunity, PLoS One, 8(9):e75328 [19] Prasad SK., Bose A., Bhattacharjee A et al, 2019, Radioprotective effect of ethanolic extract of Alocasia indica on γ-irradiation-induced reproductive alterations in ovary and uterus, Int J Radiat Biol., 95(11), pp 1529–1542 [20] Islam MK., Mahmud I., Saha S et al, 2013, Preliminary pharmacological evaluation of Alocasia indica Schott tuber, J Integr Med., 11(5), pp 343– 351 [21] Trương Thị Diệu Thuần, Lê Ngọc Kính, 2003, Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Ráy (Alocasia odora Roxb.) Huế, Tạp chí Y học Việt Nam, 6, pp 47–49 [22] Lê Ngọc Kính, 2007, Tác dụng hạ cholesterol huyết thỏ dịch chiết từ thân rễ Ráy, Tạp chí Dược học, 6, pp 17–19 [23] Viet LD., Houghton PJ., Forbes B et al, 2006, Wound healing activity of Alocasia odora (Roxb.) Koch, Planta Med., 72(11), p P_024 [24] Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Trần Hậu Lự, 2006, Một số kết 46 nghiên cứu thành phần hóa học Ráy (Alocasia macrorrhiza L Scott) Việt Nam, Tạp chí Dược học, 12, pp 4–6 [25] Nguyễn Quyết Tiến, 2004, Nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học ráy, (Alocasia macrorrhiza (L.) schott, aracae), Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội [26] Lành Thị Ngọc, 2012, Phân lập xác định cấu trúc hóa học thành phần có hoạt tính diệt tế bào ung thư kháng vi sinh vật kiểm định từ Cỏ roi ngựa (Verbena officinalis L.) Ráy (Alocasia macrorrhizos (L.) G Don.), Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện hóa học hợp chất thiên nhiên, Hà Nội [27] Đào Thị Vui, Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Hồng Tuyến, 2011, Nghiên cứu tác dụng hạ axit uric máu thực nghiệm thuốc từ chuối hột củ ráy thực nghiệm, Tạp chí Dược học, 428, pp 45–47 [28] Bộ Y tế, 2015, Dược liệu học tập II, Nhà xuất Y học, Hà Nội [29] Harrison R., 2002, Structure and function of xanthine oxidoreductase: where are we now?, Free Radic Biol Med., 33(6), pp 774–797 [30] Aziz N., Jamil RT., 2021, Biochemistry, Xanthine Oxidase, In: StatPearls Treasure Island (FL): StatPearls Publishing [31] Kumar R., None D., Sharma S et al, 2011, Xanthine oxidase inhibitors: a patent survey, Expert Opin Ther Pat., 21(7), pp 1071–1108 [32] Pacher P., Nivorozhkin A., and Szabó C., 2006, Therapeutic effects of xanthine oxidase inhibitors: renaissance half a century after the discovery of allopurinol, Pharmacol Rev., 58(1), pp 87–114 [33] El Ridi R., Tallima H., 2017, Physiological functions and pathogenic potential of uric acid: A review, J Adv Res., 8(5), pp 487–493 [34] Wang CH., Zhang C., and Xing XH., 2016, Xanthine dehydrogenase: An old enzyme with new knowledge and prospects, Bioengineered, 7(6), pp 395–405 [35] Battelli MG., Polito L., Bortolotti M et al, 2016, Xanthine OxidoreductaseDerived Reactive Species: Physiological and Pathological Effects, Oxid 47 Med Cell Longev., vol 2016 [36] Kobayashi J., Tetsuya M., Masami I et al, 1990, Hyrtiosins A and B, new indole alkaloids from the Okinawan marine sponge Hyrtios erecta, Tetrahedron, 46(23), pp 7699–7702 [37] Salmoun M., Devijver C., Daloze C et al, 2002, 5-HydroxytryptamineDerived Alkaloids from Two Marine Sponges of the Genus Hyrtios, J Nat Prod, 65(8), pp 1173–6 [38] Quy T., Xuan T., 2019, Xanthine Oxidase Inhibitory Potential, Antioxidant and Antibacterial Activities of Cordyceps militaris (L.) Link Fruiting Body, Med (Basel, Switzerland), 6(1), p 20 [39] Kazazi F., Halkes S., Ufford HQ et al, 2009, Inhibition of xanthine oxidase activity by Filipendula species, Planta Med., 75(9), p PA3 48 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ MS hợp chất AO1 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất AO1 49 Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất AO1 Phụ lục Phổ HSQC giãn rộng hợp chất AO1 50 Phụ lục Phổ HMBC hợp chất AO1 Phụ lục Phổ MS hợp chất AO2 51 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất AO2 Phụ lục Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất AO2 52 Phụ lục Phổ HSQC giãn rộng hợp chất AO2 Phụ lục 10 Phổ HMBC hợp chất AO2 53 Phụ lục 11 Phổ MS hợp chất AO5 Phụ lục 12 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất AO5 54 Phụ lục 13 Phổ 13C-NMR hợp chất AO5 Phụ lục 14 Phổ HSQC giãn rộng hợp chất AO5 55 Phụ lục 15 Phổ HMBC giãn rộng hợp chất AO5