Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN HUY HÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY BÌNH BÁT (Annona reticulata L.) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC NGHỆ AN - 2016 Cơng trình hồn thành tại: Phịng thí nghiệm Chun đề Hữu cơ, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trần Đình Thắng GS TS Yang-Chang Wu Phản biện 1: PGS TS Đặng Ngọc Quang Phản biện 2: PGS TS Đỗ Quang Huy Phản biện 3: PGS TS Hoàng Văn Lựu Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: vào hồi …… …… phút, ngày …… tháng …… năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin & Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Họ Na (còn gọi họ Mãng cầu - Annonaceae Juss) họ lớn có khoảng 135 chi khoảng 2500 lồi [5] Phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trung tâm đa dạng họ Na (Annonaceae) vùng nhiệt đới Indo-Malaysis nhiệt đới châu Mỹ Có vài loài phân bố khắp lục địa như: Xylopia tìm thấy Trung Nam Mỹ, châu Phi, Madagascar, châu Á châu Úc Họ Na (Annonaceae) biết khoảng 34 chi khoảng 900 loài châu Mỹ, 42 chi 450 loài châu Phi Madagascar, 51 chi 950 loài châu Á châu Họ Na (Annonaceae) việt Nam biết 183 loài, phân loài 21 thứ Về phương diện kinh tế, họ Na có giá trị kinh tế quan trọng, nguồn cung cấp ăn được; dầu hạt số loài sử dụng để sản xuất dầu ăn, xà phòng; vỏ số loài sử dụng sản xuất rượu Mùi thơm loài Cananga odorata nguyên liệu quan trọng dùng nước hoa Về phương diện y học, số loài sử dụng y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh khác nhau: mụn nhọt, kinh, hen suyễn, ho, chướng bụng, chứng khó tiêu, bệnh sốt, ngộ độc, chứng phong thấp, bệnh ghẻ, viêm da, đau răng, vết thương lở loét nhỏ, chống co thắt, trị rắn cắn, diệt sâu bọ Rễ số loài sử dụng để điều trị bệnh tiêu chảy, kiết lỵ, đau dày Trong y học đại, từ năm 1982 họ Na bắt đầu quan tâm đặc biệt nhà khoa học việc phát lớp chất acetogenin có hoạt tính kháng u, chống ung thư, chống oxi hóa, kháng HIV với liều lượng thấp, có tính chọn lọc cao tác dụng phụ [11] Ngồi acetogenin, nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy nhiều lớp chất có hoạt tính kháng u, kháng khuẩn, chống sốt rét mạnh mẽ Chi Na (Annona) có khoảng 125 lồi, mọc hoang dại châu Mĩ, châu Phi, châu Á Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Cambuchia, Lào Việt Nam Việt Nam có lồi, có ba lồi trồng gồm: Annona squamosa L., Annona muricata L., Annona reticulata L (bình bát), Annona glabra L.; nhiều cơng trình nghiên cứu ngồi nước ba lồi Annona squamosa L, Annona muricata L, Annona glabra L chứng minh lồi có hoạt tính sinh học quý giá: chống viêm khớp, kháng ung thư, chống co giật, trị đái tháo đường, giảm mỡ máu, chống viêm, chống oxi hóa, hạ huyết áp, chống kí sinh trùng, chống sốt rét, diệt côn trùng, chống co thắt dày - môn vị, chữa lành vết thương Một số sản phẩm thuốc, thực phẩm chức nghiên cứu ứng dụng thị trường có nguồn gốc từ lồi Tuy nhiên, lồi bình bát (Annona reticulata L.) chưa nhận nhiều quan tâm nghiên cứu giới khoa học Số lượng cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi cịn khiêm tốn số lượng chất lượng, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu lồi Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học lồi giúp đánh giá giá trị nguồn tài nguyên thiên nhiên nước ta Kết nghiên cứu loài mang lại ý nghĩa to lớn ngành dược liệu nước giới Với ý nghĩa thực tiễn cấp thiết nên thực đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học bình bát (Annona reticulata L.) Việt Nam Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu hạt bình bát (Annona reticulata L.) thuộc họ Na (Annonaceae) Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận án này, chúng tơi có nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất từ hạt bình bát (Annona reticulata L.) - Sử dụng phương pháp sắc ký kết tinh phân đoạn để phân lập hợp chất - Sử dụng phương pháp phổ để xác định cấu trúc hợp chất thu - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất tinh khiết phân lập từ bình bát Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau lấy rửa sạch, sấy khô 400C Việc xử lý tiếp mẫu phương pháp chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất dùng cho nghiên cứu nêu phần thực nghiệm - Phương pháp phân tích, tách hỗn hợp phân lập chất: sử dụng phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với pha tĩnh khác silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) pha đảo pha silica gel - Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất: Cấu trúc hoá học hợp chất phân lập xác định phương pháp vật lý đại phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D NMR) hai chiều (2D NMR) với kỹ thuật khác 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC HMBC sử dụng - Cấu trúc lập thể tương đối tuyệt đối hợp chất xác định phản ứng hoá học phương pháp phổ NMR với kỹ thuật NOE, NOESY - Thăm dò tác động ức chế sản sinh NO dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 Những đóng góp luận án Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học số chất phân lập từ hạt bình bát (Annona reticulata) lần Việt Nam Từ phần tan hexane ethyl acetate dịch chiết methanol bình bát (Annona reticulata) phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất: + hợp chất triterpenoid mới: Annonaretin A (ARLE1); hợp chất triterpenoid lần đầu phân lập từ bình bát: taraxasterol (ARLE3), taraxerol (ARLH3), uvaol (ARLE4); + hợp chất sterol: β-sitosterol (ARLH4), 6β-hydroxystigmast-4en-3-one (ARLH6) ARLH6 lần phân lập từ chi Annona + hợp chất diterpenoid: axit kaurenoic, axit 17-acetoxy-16βhydroxy-ent-kauran-19-oic (ARLH7), axit 16α-hydro-ent-kauran-17,19dioic (ARLE1), axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5) Trong đó, hợp chất phần phân lập từ + hợp chất flavonoid: (2S)-di-O-methylquiritigenin (ARLE2), rutin (ARLE5) ARLE2 lần phân lập từ chi Annona Từ phần tan ethyl acetate dịch chiết methanol hạt bình bát (Annona reticulata) phân lập 10 hợp chất: + hợp chất acetogenin: uvarigrandin A (ARSE1), cis-reticulatacin-10one (ARSE2) + hợp chất amin béo: N- (Triacontanoyl)tryptamin (ARSE3); + hợp chất triterpenoid: axit rotundic (ARSE4) pedunculoside (ARSE5); + hợp chất sterol: β-sitosterol (ARSE6) β-sitosteryl-3-O-β-Dglucopyranoside (ARSE7); + hợp chất dẫn xuất benzen là: sinapaldehyde glucoside (ARSE8); eleutheroside B (ARSE9); axit vanilic (ARSE10); Các hợp chất ARSE4, ARSE5, ARSE8, ARSE9 lần phân lập từ chi Annona Hai hợp chất ARSE1 ARSE2 lần phân lập từ Các hợp chất ARLH2, ARLH3 ARLH5, ARLH6, ARLH7, ARLE1 có khả ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 khoảng 48,6 ± 1,2 99,8 ± 0,4 μM Hợp chất ARLH5 cho thấy tác động ức chế đáng kể sản sinh NO với giá trị IC 50 nhỏ 48,6 ± 1,2 μM Đây lần hợp chất thử nghiệm khả ức chế sản sinh NO tế bào tế bào RAW 246.7 Cấu trúc luận án Luận án bao gồm 149 trang với 34 bảng số liệu, 22 hình sơ đồ với 189 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (3 trang), tổng quan (32 trang), phương pháp nghiên cứu kỹ thuật thực nghiệm (23 trang), kết thảo luận (71 trang), kết luận (1 trang), danh mục cơng trình cơng bố (1 trang), tài liệu tham khảo (18 trang) Ngồi cịn có phần phụ lục gồm 134 phổ số hợp chất chọn lọc CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Luận án tiến hành tổng quan tài liệu nội dung: Giới thiệu họ Na (Annonaceae) - Đặc điểm thực vật họ Na - Các hợp chất có hoạt tính sinh học phân lập từ chi na (Annona) Giới thiệu loài Annona reticulate L : đặc điểm chung hình thái, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Mẫu hạt bình bát thu hái Tiền Giang vào tháng 3/2010 11/2011 PGS TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật định danh, tiêu (Viet-TSWu-20101015) lưu giữ khoa Sinh, Trường Đại học Vinh Mẫu thu hái vào thời điểm thích hợp năm, rửa sạch, sấy khô tự nhiên điều kiện thường Mẫu khô xay nhỏ để trình ngâm chiết đạt hiệu suất cao 2.1.2 Các phương pháp phân lập hợp chất Để phân tích phân lập hợp chất, sử dụng phương pháp như: Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc kí lớp mỏng thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm Hiện hình đèn tử ngoại (UV) bước sóng 254 nm 365 nm, màu với iot đến quan sát thấy xuất vệt màu hiển thị dung dịch H2SO4 10% 1100 C xuất vết than đen vị trí có vết chất Sắc ký cột thường (CC) Các cao chiết phân lập phương pháp sắc kí cột thơng thường với pha tĩnh chất hấp phụ silica gel 0,063 ÷ 0,200 mm 0,04 ÷ 0,063 mm (Merck) Kích thước cột khác nhau: 150 x 10 cm; 120 x cm; 120 x cm; 110 x cm; 100 x cm; 90 x cm; 80 x 3,5 cm; 60 x 3,5 cm; 60 x cm; 80 x 2cm sắc kí cột pha đảo RP-18 với kích thước cột 80 x cm; 50 x 1,5 cm Các phương pháp kết tinh Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác chất hòa tan vào một hỗn hợp dung mơi Trong q trình để yên để dung môi bốc từ từ, thành phần khó tan kết tủa kết tinh trước Lọc lấy phần tinh thể thô kết tinh lại thu chất tinh khiết Phần dung dịch lại để bay dung mơi kết tinh để tách chất khác Có thể kết hợp việc bay dung môi với giảm nhiệt độ để q trình kết tinh hiệu Dung mơi dùng để hịa tan q trình kết tinh phân đoạn thường dung mơi hỗn hợp hay dung môi trường hợp chất khó kết tinh 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập sử dụng kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại gồm: 2.1.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy đo máy Kofler micro-hotstage Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.1.3.2 Độ quay cực ([α]D) Độ quay cực đo máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2.1.3.3 Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) đo máy Brucker Dailtonics APEX II 30eV spectrometer khoa Dược, Trường Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan máy micr OTOF-QII 10187 thuộc Phịng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh 2.1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ NMR đo máy Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội TMS), Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân sử dụng bao gồm:  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều: 1H-NMR,13C-NMR DEPT  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY NOESY Dung môi sử dụng bao gồm dung môi DMSO-d6, CD3OD, CDCl3 Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào chất mẫu, theo ngun tắc dung mơi phải hịa tan hồn tồn mẫu thử 2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính kháng viêm Hoạt tính kháng viêm hợp chất đuợc đánh giá dựa khả ức chế sản sinh NO điều kiện đại thực bào RAW 264.7 kích thích với LPS 2 Chiết xuất, phân lập hợp chất phân lập từ bình bát 2.2.1 Chiết xuất, phân lập 11 2.2.2 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ hạt bình bát Hạt bình bát rửa sạch, sấy khơ 40oC 3kg, sau xay dập để tạo điều kiện thn lợi cho q trình trích ly rắn lỏng Mẫu sau xay chiết với methanol thời gian ngày (3 x 5L), dịch chiết cất thu hồi dung môi thu 184 g cao chiết methanol Cao chiết methanol hòa vào 1L nước cất, chiết với dung môi n-hexane (3 x 1L), ethyl acetate (5 x 1L), butanol (3 x 1L) thu dịch chiết tương ứng, dịch chiết cất thu hồi dung môi thu 10 g cao n-hexane, 94,5 g cao ethyl acetate 12 g cao butanol Các cao chiết n-hexane butanol thu q nên khơng tiến hành phân lập Cao ethyl acetate tiến hành sắc ký cột silica gel gradient nồng độ với dung môi rửa giải n-haxane - acetone 50:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1 (v/v), thu phân đoạn, ký hiệu từ ARSE-1 đến ARSE-8 Hạt Bình bát(3,0 kg) Ngâm với metanol Cất thu hồi metanol Cao metanol (184 g) - Phân bố nước Chiết với n-hexane - Thu hồi n-hexane Cao n-hexane (10 g) Dịch nước Chiết với ethyl acetate - Thu hồi etyl acetate Cao etyl axetate (94,5g) Dịch nước Chiết với butanol - Thu hồi butanol Cao butanol (12 g) Dịch nước Sơ đồ 2.4: Sơ đồ chiết xuất hạt bình bát 12 Cao ethyl acetate 94,5 g H/A 50:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1 ARSE-1 1,8 g ARSE-2 3,2 g ARSE-3 4,7 g ARSE-4 4,1 g ARSE-5 3,4 g ARSE-6 2,7 g ARSE-7 H/E 20:1, 15:1, 9:1 ARSE-2-1 ARSE-2-2 0,7 g H/E 15:1 ARSE6 34 mg D/M 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1 ARSE-2 0,45 g ARSE-4-1 H/E 9:1 ARSE-4-2 0,35 g ARSE-4-3 ARSE-3-2 0,34 g ARSE7 21 mg H/E 8:1 ARSE8 17 mg ARSE-3-3 0,42 g H/E 6:1 ARSE9 11,5 mg ARSE-6-1 ARSE-6-2 0,57 g ARSE-6-3 D/M 4:1 H/E 4:1 ARSE-6-2-1 25 mg ARSE3 12,1 mg H/E 15:1, 9:1, 6:1, 2:1 ARSE-3-1 ARSE-8 D/M 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1 ARSE-3-4 0,47 g H/E 4:1 ARSE10 13,1 mg ARSE-5-1 ARSE-5-2 0,43 g D/M 10:1 ARSE4 21 mg ARSE-5-3 0,52 g D/M 7:1 ARSE5 14,3 mg Sơ đồ 2.5: Sơ đồ phân lập hợp chất từ hạt bình bát ARSE-5-4 RP-18, MeOH ARSE1 11,3 mg ARSE2 13,2 mg 13 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập xác định cấu hợp chất từ bình bát 3.1.1 Phân lập hợp chất Quá trình phân lập chất từ bình bát trình bày cụ thể phần thực nghiệm Trong q trình nghiên cứu chúng tơi tập trung nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết metanol bình bát cách kết hợp phương pháp chiết xuất, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với hệ dung môi rửa giải khác phù hợp với phân đoạn Kết trình nghiên cứu thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Các hợp chất phân lập từ bình bát TT Ký hiệu Tên hợp chất CTPT C33H56O3 ARLH1 annonaretin A (chất mới) C20H30O2 ARLH2 axit kaurenoic C30H50O ARLH3 Taraxerol C29H50O ARLH4 β-sitosterol C20H30O3 ARLH5 axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic C29H48O2 ARLH6 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on C20H32O3 ARLH7 axit 16β-hydroxy-17-acetoxy ent-kauran-19-oic C20H30O4 ARLE1 axit 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic C17H16O4 ARLE2 (2S)-di-O-methylquiritigenin C30H50O 10 ARLE3 Taraxasterol C30H50O2 11 ARLE4 Uvaol C27H30O16 12 ARLE5 Rutin 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất ARLH1 (Chất mới) Hợp chất ARLH1 chất bột khơng màu, điểm nóng chảy 120-121°C Phổ khối luợng phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử [M+Na]+ m/z 523,4122 (C33H56O3Na theo tính tốn m/z 523,4127) tuơng ứng với cơng thức C33H56O3 Trong phổ 1H-NMR, có nhóm methyl gồm: tín hiệu singlet δH 0,82 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-21), 0,97 (3H, s, CH3-22), 0,98 (3H, s, CH319) 1,60 (3H, s, CH3-30) hai tín hiệu doublet δH 0,80 (3H, d, J = 9,5 Hz, CH3-32) 0,93 (3H, d, J = 6,0 Hz, CH3-33) Đặc biệt, hai tín hiệu doublet proton cyclopropyl δH 0.40 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-20) 0,62 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-20) từ cho ta dự đốn dẫn xuất triterpen có kiểu khung cycloartanol Phổ 13C-NMR cho thấy có tổng số 33 nguyên tử carbon phân tử, bao gồm nhóm methylen cuối mạch (δC 111,9, 147,4), ba carbon gắn với 14 oxy (δC 62,8, 71,0, 83,2) nhóm methyl (δC 15,1, 18,1, 19,0, 19,3, 20,7, 21,3, 25,7) Ngoài ra, vùng truờng thấp có tín hiệu proton liên kết với carbon gắn với oxy δH 3,01 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 3,54 (1H, dd, J = 11,0, 6,0 Hz, H-24), 3,64 (1H, br dd, J = 16,0, 9,0 Hz, H-2), 3,70 (1H, br d, J = 11,0 Hz, H-24) đuợc gắn với C-2, C-3, C-24 xác định tương tác xa H-2 với C-3 (δ 83,2), C-4 (δ 40,3); H-3 với C-1, C-2, C-4, C-18; H-24 với C-23, C-25 Vị trí nhóm methylen cuối mạch δH 4,64 (1H, br s, H29) 4,77 (1H, br s, H-29) đuợc xác định dựa phổ HMBC thông qua tương tác H-29 C-27, C-30 Trong phổ HMBC, có tuơng tác xa H-32 C-33, C-31, C-27; H-33 C-32, C-31, C-27, cho thấy nhóm isopropyl đuợc liên kết với C-27 Các tín hiệu doublet vùng trường cao δH 0,40 0,62 cho thấy mối tuơng tác xa với nguyên tử C-1, C-11, C-5 khẳng định có mặt nhóm cyclopropyl C-20 nối với C-9 C-10 Số liệu phổ cộng hưởng từ hợp chất ARLH1 xác định bảng 3.2 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR hợp chất ARLH1 C DEPT CH2 CH CH C CH CH2 CH2 10 CH C C 11 CH2 12 13 14 CH2 C C 15 CH2 16 17 18 19 20 CH2 CH CH3 CH3 CH2 ARLH1 δH 1,53 (2H, m) 3,64 (1H, dt, 9,5; 6,5 Hz) 3,01 (1H, d, 9,5 Hz) 1,38 (1H, dd, 12,0; 3,5 Hz) 1,58 (1H, m) 0,79 (1H, m) 1,35 (1H, m 1,10 (1H, m) 1,53 (1H, m) 2,02 (1H, m) 1,16 (1H, m) 1,31 (2H, m) 1,66 (1H, m) 1,60 (1H, m) 1,64 (1H, m) 1,42 (1H, m) 0,82 (3H, s) 0,98 (3H, s) 0,61 (1H, d, 4,0 Hz) δC 39,7 71,0 83,2 40,4 HMBC H→C C-2, C-3, C-5, C-20, C-9 C-1, C-3 C-1, C-4, C-18, C-19 47,1 C-18, C-20, C-4, C-9 20,9 C-5, C-10, C-7, C-4, C-8 25,7 47,7 25,1 19,2 C-9, C-20, C-10, C-5 26,5 C-10, C-20, C-9 35,3 45,1 48,7 C-13, C-21 31,8 C-13, C-22, C-16 26,8 43,1 15,1 25,7 29,7 C-13, C-12, C-4, C-5, C-3, C-19 C-4, C-5, C-3, C-18 C-1, C-8, C-11, C-9, C-10 15 C DEPT 21 22 23 CH3 CH3 CH 24 CH2 25 CH2 26 CH2 27 28 CH C 29 CH2 30 31 32 33 CH3 CH CH3 CH3 ARLH1 δH 0,40 (1H, d, 4,5 Hz) 0,91 (3H, s) 0,97 (3H, s) 1,90 (1H, m) 3,70 (1H, d, 10,5 Hz) 3,54 (1H, dd, 11,0; 6,0 Hz) 1,41 (1H, m) 1,12 (1H, m) 1,86 (1H, m) 1,33 ( (1H, m) 1,57 (1H, m) 4,77 (1H, br s) 4,64 (1H, br s) 1,60 (3H, s) 1,52 (1H, m) 0,81 (3H, d, 6,0 Hz) 0,93 (3H, d, 6,0 Hz) δC HMBC H→C 19,3 18,1 46,3 C-12, C-13, C-14, C-17 C-8, C-13, C-14, C-15 C-26, C-13 62,8 C-25, C-23 27,7 C-27 27,3 C-23 55,4 147,3 111,9 C-30, C-27, C-28 19,0 30,2 21,3 20,7 C-27, C-28, C-29 C-27, C-28 C-31, C-33 C-31, C-32 H (500 MHz , CDCl3 + CD3OD) C (125 MHz, CDCl3+ CD3OD) Hợp chất ARLH1 hợp chất mới, lần phân lập từ Annona reticulata đặt tên annonaretin A Hình 3.1 Phổ khối lượng (HR-ESI-MS) hợp chất ARLH1 16 Hình 3.2 Phổ 1H hợp chất ARLH1 Hình 3.3 Phổ 13C hợp chất ARLH1 17 Hình 3.4 Phổ HSQC hợp chất ARLH1 Hình 3.5 Phổ COSY hợp chất ARLH1 18 Hình 3.6 Phổ HMBC hợp chất ARLH1 Annonaretin A 3.2 Phân lập xác định cấu hợp chất từ hạt bình bát Bảng 3.13: Danh sách hợp chất phân lập từ hạt bình bát Ký hiệu TT Tên hợp chất CTPT hợp chất C37H66O7 ARSE1 Uvarigrandin A C37H67O6 ARSE2 Cis-reticulatacin-10-on C40H70ON2 ARSE3 N- (Triacontanoyl)tryptamin 19 axit rotundic C30H48O5 Pedunculoside C36H58O10 β-sitosterol C29H50O -sitosteryl-3-O--DC35H60O6 ARSE7 glucopyranoside C17H22O9 ARSE8 Sinapaldehyde glucoside C17H24O9 ARSE9 Eleutheroside B C8H8O4 10 ARSE10 axit vanilic 3.3 Tác động ức chế sản sinh NO số hợp chất phân lập từ bình bát Chín hợp chất phân lập từ bình bát ARLH1-ARLH7, ARLE1ARLE2 sàng lọc tác động chúng sản sinh NO tế bào RAW 246.7 bị kích ứng với LPS Đại học Chang Gung, Đài Loan Các tế bào nuôi cấy hợp chất ARLH1-ARLE2 nồng độ khác với có mặt 100 mg/mL LPS thời gian 24h (Bảng 3.25) Các hợp chất ARLH1, ARLH2, ARLH4, ARLE2 thể độc tính tế bào, hợp chất khác không cho thấy ảnh hưởng lên khả sống sót tế bào Sự sản sinh NO giảm đáng kể xử lý với chất ARLH2, ARLH3 ARLH5-ARLE1 theo phụ thuộc vào liều lượng, với giá trị IC50 khoảng 48,6 ± 1,2 99,8 ± 0,4 μM (Bảng 3.25) Các tác động ức chế ARLH1, ARLH4, ARLE2 rõ ràng Các hợp chất ARLH2, ARLH3 ARLH5- ARLE1 độc tính tế bào đáng kể khoảng nồng độ 12,5 - 100 μM (Bảng 3.25) Axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5), cho thấy tác động ức chế đáng kể sản sinh NO với giá trị IC50 nhỏ 48,6 ± 1,2 μM Trong kết thực nghiệm chúng tôi, hợp chất ARLH2, ARLH3, ARLH5 thể tác động ức chế NO tương tự báo cáo kháng viêm Bảng 3.24: Tác động ức chế NO tế bào RAW 264.7 ARSE4 ARSE5 ARSE6 Kiểm soát LPS Liều (μM) (−) (+) Tế bào sống sót (%) 100,0 ± 4,9 98,7 ± 8,0 Mức độ NO −0,5 ± 0,1 45,4 ± 2,7 ### Sự ức chế NO (%) (−) (−) IC50 (μM) (−) (−) ARLH1 12,5 88,0 ± 1,5 36,6 ± 1,9 19,3 ± 4,2 (−) 20 ARLH2 ARLH3 ARLH4 ARLH5 ARLH6 ARLH7 ARLE1 ARLE2 Liều (μM) Tế bào sống sót (%) Mức độ NO Sự ức chế NO (%) 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 12,5 25 50 100 81,2 ± 1,8 73,0 ± 3,6 * 66,9 ± 5,5 ** 98,0 ± 2,2 91,0 ± 3,6 82,9 ± 1,2 65,7 ± 8,6 ** 93,5 ± 1,8 92,6 ± 3,1 88,7 ± 1,8 81,4 ± 2,3 82,8 ± 2,7 80,7 ± 3,8 65,3 ± 2,3 ** 55,8 ± 2,7 ** 98,9 ± 5,2 96,5 ± 9,2 95,9 ± 8,6 80,2 ± 5,7 94,8 ± 3,1 83,7 ± 3,5 83,5 ± 3,0 81,3 ± 2,8 98,6 ± 3,1 93,6 ± 4,0 92,5 ± 2,8 83,7 ± 1,6 98,4 ± 3,2 94,0 ± 2,6 88,6 ± 2,6 82,4 ± 1,2 99,9 ± 4,8 90,0 ± 1,6 82,6 ± 2,7 76,2 ± 1,1 * 33,5 ± 0,9 (−) (−) 34,3 ± 4,7 35,1 ± 1,2 22,7 ± 0,5 ** (−) 38,5 ± 2,3 39,5 ± 0,6 35,6 ± 0,9 * 22,6 ± 0,4 ** 38,4 ± 0,7 38,6 ± 3,3 (−) (−) 38,3 ± 1,3 33,1 ± 1,0 * 22,1 ± 1,5 ** 14,8 ± 0,7 *** 37,0 ± 1,8 33,1 ± 2,4 * 22,9 ± 1,1 ** 15,1 ± 0,3 *** 42,6 ± 0,7 40,6 ± 2,8 23,7 ± 0,2 ** 14,3 ± 0,3 *** 39,8 ± 1,2 35,4 ± 0,8 * 23,5 ± 0,9 ** 14,4 ± 0,3 *** 42,0 ± 1,2 40,4 ± 0,7 25,9 ± 2,3 (−) 26,2 ± 2,0 (−) (−) 24,5 ± 10,2 22,7 ± 2,6 50,0 ± 1,0 (−) 15,2 ± 5,0 13,1 ± 1,2 21,6 ± 2,0 50,1 ± 0,9 15,5 ± 1,5 15,1 ± 7,3 (−) (−) 15,5 ± 2,8 27,1 ± 2,3 51,4 ± 3,2 67,3 ± 1,5 18,5 ± 4,0 27,1 ± 5,3 49,5 ± 2,4 66,7 ± 0,6 6,2 ± 1,5 10,6 ± 6,1 47,7 ± 0,3 68,5 ± 0,7 12,3 ± 2,6 21,9 ± 1,8 48,2 ± 2,0 68,3 ± 0,7 7,5 ± 2,7 11,0 ± 1,6 42,9 ± 5,0 (−) Số liệu trình bày dạng trung bình ± SD ### IC50 (μM) 50,0 ± 0,3 99,8 ± 0,4 (−) 48,6 ± 1,2 51,5 ± 0,5 55,5 ± 0,3 54,5 ± 0,8 (−) So sánh với mẫu nhóm đối chứng * p < 0,05; ** p < 0,01 *** p < 0,001 so sánh với nhóm LPS-alone (−): khơng xác định 21 Các hợp chất hóa học phân lập từ bình bát Annonaretin A (ARLH1) 17-acetoxy-16β-ent-kauran-19-oic (ARLH7) Kaurenoic acid (ARLH2) 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic (ARLE1) 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5) Taraxerol (ARLH3) Taraxasterol (ARLE3) Uvaol (ARLE4) β-sitosterol (ARLH4) 6β-hydroxystigmast-4-en-3-one (ARLH6) (2S)-di-O-methylquiritigenin (ARLE2) Rutin (ARLE5) 22 Các hợp chất hóa học phân lập từ hạt bình bát Uvarigrandin A (ARSE1) Cis-reticulatacin-10-one (ARSE2) N- (Triacontanoyl)tryptamin (ARSE3) Axit rotundic (ARSE4) -sitosterol (ARSE6) Pedunculoside (ARSE5) -sitosteryl-3-O--D-glucopyranoside (ARSE7) HO O OCH3 OH Sinapaldehyde glucoside (ARSE8) Vanilic (ARSE10) Eleutheroside B (ARSE9) 23 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học hạt bình bát (Annona reticulata) Việt Nam, thu số kết sau: Từ phần tan hexane ethyl acetate dịch chiết methanol bình bát (Annona reticulata) phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất: + hợp chất triterpenoid mới: annonaretin A (ARLE1); hợp chất triterpenoid lần đầu phân lập từ bình bát: taraxasterol (ARLE3), taraxerol (ARLH3), uvaol (ARLE4); + hợp chất sterol: β-sitosterol (ARLH4), 6β-hydroxystigmast-4-en-3one (ARLH6) ARLH6 lần phân lập từ chi Annona + hợp chất diterpenoid: axit kaurenoic, axit 17-acetoxy-16β-hydroxyent-kauran-19-oic (ARLH7), axit 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic (ARLE1), axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5) Trong đó, hợp chất phần phân lập từ + hợp chất flavonoid: (2S)-di-O-methylquiritigenin (ARLE2), rutin (ARLE5) ARLE2 lần phân lập từ chi Annona Từ phần tan ethyl acetate dịch chiết methanol hạt bình bát (Annona reticulata) phân lập 10 hợp chất: + hợp chất acetogenin: uvarigrandin A (ARSE1), cis-reticulatacin-10-one (ARSE2) + hợp chất amin béo: N- (Triacontanoyl)tryptamin (ARSE3); + hợp chất triterpenoid: axit rotundic (ARSE4) pedunculoside (ARSE5); + hợp chất sterol: β-sitosterol (ARSE6) β-sitosteryl-3-O-β-Dglucopyranoside (ARSE7); 24 + hợp chất dẫn xuất benzen là: sinapaldehyde glucoside (ARSE8); eleutheroside B (ARSE9); axit vanilic (ARSE10); Các hợp chất ARSE4, ARSE5, ARSE8, ARSE9 lần phân lập từ chi Annona Hai hợp chất ARSE1 ARSE2 lần phân lập từ Các hợp chất ARLH2, ARLH3 ARLH5, ARLH6, ARLH7, ARLE1 có khả ức chế sản sinh NO với giá trị IC 50 khoảng 48,6 ± 1,2 99,8 ± 0,4 μM Hợp chất ARLH5 cho thấy tác động ức chế đáng kể sản sinh NO với giá trị IC50 nhỏ 48,6 ± 1,2 μM Đây lần hợp chất thử nghiệm khả ức chế sản sinh NO tế bào tế bào RAW 246.7 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Dinh Thang, Ping-Chung Kuo, Nguyen Huy Hung, Guan-Jhong Huang, Bow-Shin Huang, Mei-Lin Yang, Ngo Xuan Luong and TianShung Wu (2013), Chemical constituents from the leaves of Annona recticulata and their iNOs inhibiting activity, Molecules, 18 (4), pp 4477-4486 (SCI) Nguyễn Huy Hùng, Đồn Mạnh Dũng, Trần Đình Thắng (2013), Các hợp chất diterpenoit steroit từ bình bát (Annona reticulata L.) Việt Nam, Tạp chí Hóa học, T.51 (6ABC), 64-67 Nguyễn Huy Hùng, Bùi Thị Hoa, Đỗ Xuân Hưng, Trần Đình Thắng (2015), Các hợp chất triterpenoit flavonoit bình bát (Annona reticulata L.) Việt Nam, Tạp chí Hóa học, T.53 (6E1,2), 251-254 Nguyễn Huy Hùng (2016), Chemical constituents from the seeds of Annona reticulata L in vietnam, Journal of Science and Technology, T 54 (4A), 221-226 ... tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học bình bát (Annona reticulata L.) Việt Nam 3 Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu hạt bình bát (Annona reticulata L.) thuộc họ Na (Annonaceae)... KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học hạt bình bát (Annona reticulata) Việt Nam, thu số kết sau: Từ phần tan hexane ethyl acetate dịch chiết methanol bình bát (Annona reticulata) ... bình bát (Annona reticulata L.) chưa nhận nhiều quan tâm nghiên cứu giới khoa học Số lượng cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi cịn khiêm tốn số lượng chất lượng, Việt