Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các kết nghiên cứu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác Tác giả thực Luận án ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, cho phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh – Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng, TS Bùi Xuân Vững – Đại học Sư phạm Đà Nẵng – Đại học Đà Nẵng nhận hướng dẫn, định hướng nội dung khoa học giúp đỡ tơi đầy trách nhiệm suốt q trình hồn thành luận án Xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Đại học Đà Nẵng, Ban giám hiệu trường Đại học Bách khoa, Đại học Sư phạm, Đại học Sư phạm Kỹ thuật phòng Ban, Khoa đồng nghiệp Trường tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành nội dung nghiên cứu Xin bày tỏ mến mộ lịng tri ân đến: Bộ mơn Cơng nghiệp Dược – Đại học Dược Hà Nội; Phịng thí nghiệm hoạt tính sinh học – Viện Cơng nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu ứng dụng đậu nành Vinasoy (VSAC); Quỹ đổi sáng tạo Vingroup (VINIF) GS.TS Pau Loke Show – Đại học Nottingham – Malaysia đồng hành hỗ trợ phương pháp nghiên cứu chuyên sâu có liên quan đến nội dung luận án, tài trợ phần kinh phí tiến trình thực nghiệm Xin trân trọng cảm ơn GS, PGS, TS chủ tịch, phản biện ủy viên hội đồng dành nhiều thời gian quý báu để đọc, nhận xét tham gia hội đồng chấm luận án Cuối cùng, xin tri ân thân thiết đến gia đình, bạn bè ln quan tâm, động viên, khích lệ hỗ trợ đầy hiệu giúp tơi suốt tiến trình hồn thành luận án Nghiên cứu sinh iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC HÌNH x MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT xiv MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu isoflavone 1.1.1 Cấu trúc hóa học isoflavone 1.1.2 Công dụng isoflavone sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 1.2 Một số nguồn thực vật giàu isoflavone 12 1.2.1 Đậu nành (Glycine max (L) Merrill) 12 1.2.2 Sắn dây (Pueraria benth thomsonii Benth) 12 1.2.3 Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) 13 1.2.4 Bã đậu nành 13 1.2.5 Cỏ ba đỏ (Trifolium pratense L) 14 1.3 Cơ sở công nghệ thu nhận isoflavone 14 1.3.1 Xử lý nguyên liệu 15 1.3.2 Trích ly 15 iv 1.3.3 Thủy phân glycoside 17 1.3.4 Tinh 17 1.3.5 Hoàn thiện sản phẩm 18 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước cơng nghệ thu nhận ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone 18 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 22 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 25 2.1.1 Nguyên liệu 25 2.1.2 Hóa chất, chế phẩm sinh học nhựa macroporous 26 2.1.3 Thiết bị sử dụng 28 2.2 Nội dung nghiên cứu bố trí thí nghiệm 28 2.2.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone và số thành phần hóa học số nguồn thực vật 30 2.2.2 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone từ hạt bã đậu nành 30 2.2.3 Khảo sát số phương pháp tinh chế nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế 31 2.2.4 Kiểm tra hoạt tính sinh học tính an tồn thực phẩm cao isoflavone (TN7) 32 2.2.5 Đề xuất quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ hạt bã đậu nành 32 2.2.6 Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 32 2.2.7 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Phương pháp phân tích tiêu 34 2.3.2 Phương pháp toán học 37 2.3.3 Phương pháp đánh giá cảm quan 41 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 41 v CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone thành phần hóa học từ số nguyên liệu thực vật 42 3.1.1 Hàm lượng isoflavone 42 3.1.2 Thành phần hóa học nguyên liệu 45 3.2 Ảnh hưởng số phương pháp trích ly đến hiệu thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành 47 3.2.1 Phương pháp chiết khuấy 47 3.2.2 Phương pháp dùng sóng siêu âm 52 3.2.3 So sánh hiệu thu nhận isoflavone từ phương pháp trích ly 55 3.3 Tối ưu hóa điều kiện trích ly isoflavone từ hạt bã đậu nành phương pháp chiết khuấy 57 3.3.1 Hạt đậu nành 57 3.3.2 Bã đậu nành 61 3.4 Ảnh hưởng phương pháp tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt bã đậu nành 64 3.4.1 Tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt đậu nành phương pháp trích ly lỏng-rắn 64 3.4.2 Khảo sát số loại nhựa macroporous dùng tinh chế isoflavone từ hạt đậu nành 66 3.4.3 Nghiên cứu tinh chế isoflavone từ cao thô thu nhận từ hạt đậu nành nhựa macroporous D101 69 3.4.4 Nâng cao hàm lượng aglycone cao isoflavone tinh chế chế phẩm enzyme cellulase 76 3.4.5 Nghiên cứu tinh chế isoflavone thu nhận từ bã đậu nành nhựa macroporous D101 81 3.5 Kiểm tra hoạt tính sinh học tính an tồn thực phẩm cao isoflavone 85 3.5.1 Kiểm tra hoạt tính sinh học cao isoflavone 86 vi 3.5.2 Kiểm tra tính an tồn thực phẩm cao isoflavone 93 3.6 Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt bã đậu nành 97 3.7 Ứng dụng cao isoflavone sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 99 3.7.1 Thử nghiệm sản xuất sữa chua đậu nành nước cốt dừa bổ sung isoflavone thu nhận từ đậu nành 99 3.7.2 Thử nghiệm sản xuất nectar chanh dây bổ sung cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành 115 3.8 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone 130 3.8.1 Chỉ tiêu chất lượng phụ phẩm phụ phẩm bột đậu nành 130 3.8.2 Đề xuất quy trình cơng nghệ chế biến sản phẩm thực phẩm từ phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly 131 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 134 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO 140 vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng bảng Trang 2.1 Đặc tính vật lý loại nhựa macroporous 27 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 2.3 Mức quy hoạch thực nghiệm yếu tố 37 3.1 Thành phần hàm lượng nhóm isoflavone đậu nành hạt 42 3.2 Thành phần hàm lượng nhóm isoflavone củ sắn dây 44 3.3 Thành phần hàm lượng nhóm isoflavone bã đậu nành 45 3.4 Thành phần hóa học loại nguyên liệu nghiên cứu 45 3.5 Hàm lượng hợp chất isoflavone mẫu phân tích 47 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 Hiệu quét gốc tự DPPH• dịch trích ly ứng với phương pháp Kết thực nghiệm hàm lượng thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành theo mơ hình thí nghiệm TYT 23 Kết phân tích phương sai hàm lượng isoflavone tổng trích ly từ hạt đậu nành (Minitab 18) Bảng quy hoạch theo hướng gradient từ hạt đậu nành Kết thực nghiệm theo mơ hình thí nghiệm TYT23 hàm lượng isoflavone từ bã đậu nành Kết phân tích phương sai hàm lượng isoflavone trích ly bã đậu nành (Minitab 18) Bảng quy hoạch theo hướng gradient từ bã đậu nành Các thông số đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir Freundlich isoflavone thu nhận từ hạt đậu nành Các đại lượng hấp phụ cột mở D101 isoflavone hạt đậu nành 56 58 58 60 61 62 63 70 73 viii Số hiệu Tên bảng bảng 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 Các đại lượng giải hấp phụ cột nhồi D101 isoflavone thu nhận từ hạt đậu nành Thành phần cao isoflavone tinh chế thô từ hạt đậu nành Các thông số đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir Freundlich isoflavone từ bã đậu nành Các đại lượng hấp phụ sắc kí cột mở D101 (isoflavone bã đậu nành) Các đại lượng giải hấp phụ cột mở D101 isoflavone thu nhận bã đậu nành Trang 74 74 82 83 84 3.20 Thành phần cao isoflavone tinh chế cao thô từ bã đậu nành 85 3.21 Tỉ lệ tế bào tăng sinh tác động mẫu nghiên cứu 86 3.22 Khối lượng chuột trước sau thử nghiệm 88 3.23 Khối lượng tử cung chuột lơ thí nghiệm 88 3.24 Hiệu bảo vệ tế bào HepG2 mẫu nghiên cứu 91 3.25 3.26 3.27 Khả ức chế trình peroxy hóa lipid mẫu nghiên cứu dịch đồng thể gan Giá trị IC50 % mẫu So sánh tiêu hóa học cao isoflavone thô tinh từ hạt bã đậu nành 92 93 94 3.28 Đặc tính cảm quan loại mẫu cao isoflavone 95 3.29 Chỉ tiêu vi sinh vật mẫu bột cao isoflavone 95 3.30 Khối lượng chuột lơ thử nghiệm độc tính cấp 96 3.31 3.32 Ảnh hưởng liều lượng nước cốt dừa bổ sung lên tiêu hóa lý mẫu sữa chua Phân tích cảm quan mẫu sữa chua đậu nành-nước cốt dừa 101 103 ix Số hiệu Tên bảng bảng 3.33 3.34 3.35 3.36 3.37 3.38 Một số tiêu hóa lý mẫu sữa chua đậu nành-nước cốt dừa Hàm lượng isoflavone sản phẩm mẫu sữa chua Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến tiêu hóa lý số lượng chủng VSV khởi động sữa chua Chất lượng cảm quan sữa chua đậu nành-dừa bổ sung isoflavone theo thời gian bảo quản Các tiêu hóa lý chất lượng sữa chua đậu nành nước cốt dừa bổ sung isoflavone Chỉ tiêu vi sinh vật sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt dừa bổ sung isoflavone Trang 105 105 107 109 110 110 3.39 Kí hiệu mẫu bổ sung GG-NaC 119 3.40 So sánh tiêu mẫu nectar chanh dây 122 3.41 3.42 3.43 3.44 3.45 3.46 3.47 Thành phần isoflavone nectar chanh dây bổ sung isoflavone Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến tiêu hóa lý nectar chanh dây bổ sung isoflavone Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến đặc tính cảm quan nectar chanh dây Các tiêu hóa lý chất lượng nectar chanh dây giàu isoflavone Chỉ tiêu vi sinh vật nectar chanh dây bổ sung isoflavone Thành phần hóa học bột đậu nành trước sau trích ly isoflavone Thành phần acid béo mẫu dầu trích ly 123 124 125 125 126 130 131 x DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình 1.1 1.2 1.3 Công thức cấu tạo hợp chất isoflavone đậu nành Sơ đồ chuyển hóa hợp chất isoflavone Cơng thức cấu tạo cấu hình khơng gian 17-estradiol Trang S-equol 1.4 1.5 Quy trình tổng quát sản xuất chế phẩm isoflavone thương mại Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu trích ly (phương pháp truyền thống) 14 15 2.1 Nguyên liệu giàu isoflavone dùng nghiên cứu 25 2.2 Các loại nhựa macroporous sử dụng 27 2.3 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu bố trí thí nghiệm 29 3.1 Sắc ký đồ HPLC isoflavone đậu nành 42 3.2 Sắc ký đồ HPLC isoflavone đậu xanh 43 3.3 Sắc ký đồ HPLC isoflavone củ sắn dây 44 3.4 Sắc ký đồ HPLC isoflavone bã đậu nành 45 3.5 3.6 3.7 3.8 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả thu nhận isoflavone Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả thu nhận isoflavone Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến khả thu nhận isoflavone Ảnh hưởng thời gian trích ly đến khả thu nhận isoflavone 48 49 50 51 89 4.6.2.3 Các bảng số liệu đánh giá cảm quan Phép thử tam giác PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN Phép thử tam giác Người thử:……………………………….Ngày thử:…………………… Bạn nhận mẫu chanh dây gắn mã số, hai mẫu giống mẫu khác Hãy thử mẫu theo thứ tự cho sẵn, từ trái sang phải lựa chọn mẫu khác hai mẫu lại Ghi kết vào bảng Hãy vị nước sau mẫu Banh không phép nếm lại mẫu Mẫu thử Mẫu khác (đánh dấu ) 471 ☐ 580 ☐ 427 ☐ Bảng mã số mẫu sản phẩm Mẫu A Mẫu B 219 470 157 423 356 427 123 245 593 144 256 384 471 580 151 276 397 442 A: Mẫu nectar chanh dây bổ sung isoflavone; B: Mẫu nectar đối chứng Phép thử cho điểm thị hiếu 90 Chỉ tiêu trạng thái Chỉ tiêu màu sắc Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 9 8 8 8 7 8 7 8 8 8 8 7 7 7 8 7 9 8 8 8 8 8 8 7 8 9 7 7 8 7 8 8 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 7 8 7 8 7 8 9 9 8 6 9 9 7 9 8 8 8 7 8 8 7 9 7 7 8 9 9 7 9 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 8 8 9 8 7 8 9 8 7 7 7 8 9 8 8 8 8 8 8 8 7 8 9 9 7 7 7 7 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 9 9 9 8 7 8 9 9 8 7 8 8 7 9 8 8 9 8 9 9 9 8 7 9 9 9 8 7 8 7 7 8 9 9 8 8 91 Chỉ tiêu mùi Chỉ tiêu vị Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 8 8 7 8 7 8 8 8 7 7 7 7 8 9 7 7 8 7 8 8 7 8 7 8 7 8 7 6 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 7 8 7 8 8 5 7 7 8 8 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 9 8 8 8 8 7 7 9 9 9 9 9 9 9 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 8 8 8 8 8 8 7 8 9 7 7 8 8 8 8 8 8 7 8 7 8 8 8 7 7 7 8 8 8 9 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 9 9 8 9 9 8 7 7 9 9 9 8 8 8 9 9 8 7 8 8 9 7 7 8 8 9 9 9 8 8 8 92 Mức chấp nhận chung Người thử NCI NC-ctrl Người thử NCI NC-ctrl 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 8 8 8 7 8 7 8 9 8 8 8 8 7 8 9 8 8 8 8 7 8 9 8 7 8 7 7 8 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 8 8 7 8 7 7 7 8 7 7 9 9 9 9 9 8 9 7 8 8 6 7 7 7 7 9 9 9 8 7 93 4.6.2.4 Các phân tích Trung tâm kiểm nghiệm - Kết phân tích tiêu vi sinh nectar chanh dây bổ sung isoflavone (lần 1) 94 - Kết phân tích tiêu vi sinh nectar chanh dây bổ sung isoflavone (lần 2) 95 - Kết phân tích tiêu vi sinh nectar chanh dây bổ sung isoflavone (lần 3) 96 4.6.2.5 Bản công bố sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Nectar chanh dây bổ sung isoflavone CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc BẢN CÔNG BỐ SẢN PHẨM Số: 02/TTNT/2021 I Thông tin tổ chức, cá nhân công bố sản phẩm Tên tổ chức, cá nhân: Trần Thị Ngọc Thư Địa chỉ: Khoa CN Hóa học-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng Điện thoại: 0905150880 Fax: E-mail: ttnthu@ute.udn.vn Mã số doanh nghiệp: Số Giấy chứng nhận sở đủ điều kiện ATTP: ……………… Ngày Cấp/Nơi cấp: …………… (đối với sở thuộc đối tượng phải cấp Giấy chứng nhận sở đủ điều kiện an toàn thực phẩm theo quy định) II Thông tin sản phẩm Tên sản phẩm: Thực phẩm bảo vệ sức khỏe: nectar chanh dây bổ sung isoflavone Thành phần: Nước ép chanh dây (hàm lượng chất khô 15%), siro đường sucrose 50%, nước, chất ổn định (0,06 %g/ml gellan gum+natri citrat) Khơng có chất bảo quản Chỉ tiêu chất lượng chủ yếu tạo nên công dụng sản phẩm (đối với sản phẩm bảo vệ sức khỏe) Hàm lượng isoflavone tổng số: 17,54 mg/100mlsản phẩm với hợp chất cụ thể Hợp chất isoflavone Hàm lượng isoflavone Hàm lượng isoflavone (mg/100g) Tỉ lệ hợp chất (%) Daidzin 1,95±0,04 11,1 Glycitin 0,41±0,05 2,31 Genistin 3,13±0,05 17,86 97 Daidzein 5,14±0,09 29,32 Glycitein 1,27±0,08 7,26 Genistein 5,64±0,09 32,15 Tổng 17,54±0,24 100 Hàm lượng isoflavone tổng sản phẩm nectar chanh dây đạt 15% so với liều dùng khuyến cáo ngày (Liều dùng ngày isoflavone khuyến cáo 40-90 mg/ngày/người) Khơng có chất bảo quản Thời hạn sử dụng sản phẩm: 80 ngày kể từ ngày sản xuất, hạn sử dụng ngày sản xuất: Xem nhãn Quy cách đóng gói chất liệu bao bì: 5.1 Quy cách đóng gói Khối lượng tịnh: 200mL/lọ (sai số định lượng phù hợp quy định Thông tư số 21/2014/TT-BKHCN Bộ Khoa học Công nghệ) 5.2 Chất liệu bao bì: Sản phẩm đóng gói hộp thủy tinh chuyên dùng cho thực phẩm, đảm bảo yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm theo QCVN 12-4:2015/BYT Tên địa sở sản xuất sản phẩm (trường hợp thuê sở sản xuất): III Mẫu nhãn sản phẩm (đính kèm mẫu nhãn sản phẩm mẫu nhãn sản phẩm dự kiến) IV Yêu cầu an toàn thực phẩm Tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh thực phẩm đạt yêu cầu an toàn thực phẩm theo: - Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia số: QCVN 6-2:2010/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm đồ uống không cồn, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7946:2008 (CODEX STAN 247:2005) nước nectar Bảng 1: Chỉ tiêu hóa lý chất lượng nectar chanh dây bở sung isoflavone Thành phần Hàm lượng Hàm lượng protein (g/100g) 0,21 Hàm lượng acid (g/100g) 0,60 Hàm lượng đường tổng số tính theo glucose (g/100g) 16,2 Hàm lượng isoflavone (mg/100ml) 17,54±0,24 98 Bảng 2: Chỉ tiêu vi sinh vật nectar chanh dây bổ sung isoflavone Mức cho phép(*) Kết kiểm tra lần (ngày bảo quản thứ 60) Kết kiểm tra lần (ngày bảo quản thứ 70) Kết kiểm tra lần (ngày bảo quản thứ 80) Tổng số vi sinh vật CFU/ml hiếu khí 100 KPH (