Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ: 1. Lý do chọn đề tài Isoflavone là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid, thường có trong các cây họ đậu, có hoạt tính estrogen giúp chống lại các triệu chứng như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư vú, v.v…thường xuất hiện ở phụ tiền mãn kinh. Do đó, isoflavone được giới khoa học trên thế giới quan tâm nhiều thập kỷ qua và được sử dụng chế biến các sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và đồ uống trên trong nước và trên thế giới. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về isoflavone còn ít, các sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao. Vì vậy cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước và ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone làm đa dạng hóa sản phẩm trong nước, giảm giá thành sản phẩm so với sản phẩm ngoại nhập, phát triển nền nông nghiệp và công nghiệp chiết xuất các hợp chất isoflavone. Do đó đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” đã được lựa chọn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu cung cấp isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên bao gồm các quá trình trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone; Kiểm tra an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nguyên liệu thực vật dùng để nghiên cứu trích ly isoflavone: Hạt đậu nành (Glycine max (L.) Merr), hạt đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), củ sắn dây (Pueraria montana var. lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) và bã đậu nành. Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone ở một số nguyên liệu thực vật tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên; Khảo sát các phương pháp trích ly, tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế; Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe; Khảo sát hàm lượng isoflavone trên 6 hợp chất: daidzein, genistein, glycitein, daidzin, genistin và glycitin. 4. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu. Các phương pháp phân tích được sử dụng: Phân tích isoflavone theo phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC (AOAC 2008.83) và các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam. Phương pháp đánh giá cảm quan: phép thử mô tả đặc tính của sản phẩm, phép thử cho điểm thị hiếu, phép thử so hàng thị hiếu, phép thử tam giác được thực hiện. Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 2 lần, kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, so sánh sự khác nhau có nghĩa ở mức =0,05. Tính toán quy hoạch thực nghiệm toàn phần 3 yếu tố 2 mức (TYT) 23 và phân tích ANOVA thực hiện trên phần mềm Minitab 18. 5- Bố cục của luận án Luận án gồm 137 trang, 50 Bảng biểu, 62 Hình ảnh. Nội dung của luận án gồm: Mở đầu (6 trang); Chương 1:Tổng quan (18 trang); Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương 3. Kết quả và thảo luận (92 trang); Kết luận và kiến nghị (4 trang). 6- Kết quả của luận án (1) Từ 4 loại nguyên liệu thực vật có sản lượng lớn tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên, nghiên cứu đã chọn hạt đậu nành và bã đậu nành làm nguyên liệu để thu nhận isoflavone. (2) Quá trình trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành đã được nghiên cứu bằng phương pháp chiết khuấy. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hàm lượng isoflavone chiết được nghiên cứu, được tiến hành quy hoạch thực nghiệm toàn phần với 2 mức 3 yếu tố và tối ưu hóa với mô hình Box-Wilson. Kết quả của việc tối ưu hóa cho thấy điều kiện tối ưu của chiết xuất isoflavone từ đậu nành là nhiệt độ 72,5oC, thời gian chiết là 67,5 phút, và tỷ lệ dung môi/đậu nành là 26,5/1(ml/g). Tương tự, điều kiện tối ưu của chiết xuất isoflavone từ okara là nhiệt độ 74,5oC, thời gian chiết 79,0 phút, và tỷ lệ dung môi/bã đậu nành là 26,5/1 (ml/g). Lượng isoflavone tổng thu được từ đậu nành và bã đậu nành lần lượt là là 1932,4µg / g chất khô và 160,0µg / g chất khô. (3) Luận án đã nghiên cứu cụ thể sự hấp phụ và giải hấp phụ tĩnh học của các hợp chất isoflavone thu nhận từ đậu tương và đậu bắp lên nhựa macroporous D101. Sự hấp phụ đã được chứng minh là phù hợp với các mô hình đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich. Trong nghiên cứu hiện tại này, các điều kiện hấp phụ động cho quá trình tinh chế isoflavone trên cột đóng gói nhựa D101 đã được lựa chọn ở thể tích cột (BV) là 200 mL, thể tích nạp cột là 3,75 BV và tốc độ dòng 1,5 BV/h. Quá trình giải hấp động được thực hiện với dung dịch rửa giải 70% etanol, thể tích rửa giải 2,5 BV, và tốc độ dòng 1 BV / h. Hàm lượng isoflavone đạt được ở cao tinh chế đã cao gấp 8,7 lần so với cao thôđậu nành và hiệu suất thu hồi gần 80%. Sử dụng nhựa của macroporous D101 cho kết quả: chiết xuất tinh khiết / chiết xuất thô (mg / g chiết xuất) là 144,664 / 16,624. Kết quả cho thấy khả năng cao cho việc sản xuất isoflavone quy mô lớn để ứng dụng hơn nữa trên các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm. (4) Đề tài đã nâng cao hàm lượng aglycone trong dịch chiết tinh khiết nhờ sự thủy phân hoàn toàn liên kết -1-4-glycosidic giữa gốc glucose và aglycone của hợp chất glycoside bằng enzyme thương mại Celluclast 1,5 L có hoạt tính endoglucane. Trong thời gian thủy phân 360 phút, tỷ lệ thu hồi của daidzein, glycitein và genistein lần lượt là 91,8%, 71,6% và 84,3% và không có sự khác biệt có ý nghĩa (p> 0,05) so với 420 phút và 480 phút. Kết quả thí nghiệm cho thấy nhóm -glycoside đã được thủy phân hoàn toàn, tỷ lệ aglycone chiếm hơn 95% trong tổng lượng isoflavone. (5) Các chiết xuất isoflavone khô được đánh giá về hoạt tính sinh học (hoạt tính estrogen in vitro và in vivo, hoạt tính bảo vệ gan ngoại vi, hoạt tính chống viêm, lipid peroxide bằng MDA-test) và an toàn thực phẩm (hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp, ...). Các chiết xuất isoflavone thô và tinh khiết cho thấy có hoạt tính sinh học cao và an toàn thực phẩm. (6) Từ dịch chiết isoflavone thô và tinh khiết, luận án đã nghiên cứu xây dựng hai quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu isoflavone đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe, được Hội đồng cho điểm thị hiếu trên 4 chỉ tiêu cơ bản (trạng thái, màu sắc, mùi, vị) đạt điểm trung bình> 7 trên thang điểm 9. Đóng góp của luận án • Quá trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành bằng chiết khuấy đạt được thông số trích ly tối ưu, với việc tăng nhiệt độ trích ly và lượng dung môi sử dụng nên rút ngắn thời gian trích ly. • Tinh chế isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành bằng sắc ký cột D101 là đề xuất mới cho quy trình tinh chế isoflavone quy mô công nghiệp, đáp ứng “SẢN XUẤT XANH”, thân thiện với môi trường. • Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính sinh học của cao thô và cao tinh isoflavone trên dòng tế bào MCF-7 (estrogen), dòng tế bào HepG2 (bảo vệ gan), hoạt tính chống peroxy hóa lipid màng tế bào trên dịch đồng thể gan được thực hiện đầu tiên tại Việt Nam. • Đề xuất 2 quy trình sản xuất sữa chua đậu nành - nước cốt dừa và nectar chanh dây đáp ứng các tiêu chuẩn của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN TRẦN THỊ NGỌC THƯ THƯ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ THU NHẬN ISOFLAVONE TỪ MỘT SỐ NGUỒN THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 54 01 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT Đà Nẵng, 2022 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh TS Bùi Xuân Vữngpgs TS Trương Thị Minh Hạnh TS Bùi Xuân Vững Phản biện 1: ……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Phản biện 3: ……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án tiến sĩ cấp trường họp Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng vào hồi ……giờ, ngày …… tháng …… năm 2022 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Isoflavone hợp chất thuộc nhóm flavonoid, thường có họ đậu, có hoạt tính estrogen giúp chống lại triệu chứng loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa bệnh tim mạch, ung thư vú, v.v…thường xuất phụ tiền mãn kinh Do đó, isoflavone giới khoa học giới quan tâm nhiều thập kỷ qua sử dụng chế biến sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát đồ uống nước giới Tuy nhiên, nghiên cứu nước isoflavone cịn ít, sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao Vì cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu dồi nước ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone làm đa dạng hóa sản phẩm nước, giảm giá thành sản phẩm so với sản phẩm ngoại nhập, phát triển nông nghiệp cơng nghiệp chiết xuất hợp chất isoflavone Do đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ số nguồn thực vật ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” lựa chọn Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn ngun liệu cung cấp isoflavone sẵn có khu vực miền Trung-Tây Ngun bao gồm q trình trích ly, tinh chế nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone; Kiểm tra an tồn thực phẩm hoạt tính sinh học cao isoflavone; Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone Nội dung luận án Đánh giá thành phần hàm lượng isoflavone số nguyên liệu thực vật khu vực miền Trung-Tây Nguyên; Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone từ hạt bã đậu nành; Khảo sát phương pháp tinh chế nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế; Kiểm tra chất lượng an tồn thực phẩm hoạt tính sinh học cao isoflavone; Đề xuất quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone; Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe; Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu luận án phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết tổng hợp tài liệu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Luận án sử dụng quy hoạch thực nghiệm tồn phần 23 mơ hình thực nghiệm leo dốc Box-Wilson để tìm điều kiện trích ly isoflavone tối ưu từ hạt bã đậu nành Luận án nghiên cứu cụ thể hấp phụ giải hấp phụ hợp chất isoflavone từ cao trích ly hạt bã đậu nành theo mơ hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir Freundlich Quá trình hấp phụ giải hấp phụ động học hợp thực sắc kí cột D101, sở để xây dựng quy trình tinh chế quy mơ lớn Luận án xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ hạt bã đậu nành với số cơng đoạn cải tiến: trích ly chiết khuấy, tinh chế nhựa macroporous D101 nâng cao hàm lượng aglycone chế phẩm enzyme Celluclast1.5L Quy trình thu nhận isoflavone dễ vận hành, chi phí thấp, an tồn giảm thiểu nhiễm mơi trường thơng qua việc sử dụng dung môi ethanol nước Hai sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung giàu isoflavone từ cao isoflavone sữa chua đậu nành nước cốt dừa nectar chanh dây kiểm tra đánh giá đảm bảo tiêu chuẩn nước Bố cục luận án Luận án gồm 137 trang, 50 Bảng biểu, 62 Hình ảnh Nội dung luận án gồm: Mở đầu (6 trang); Chương 1: Tổng quan (18 trang); Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương Kết thảo luận (92 trang); Kết luận kiến nghị (4 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Trình bày nghiên cứu giới nước vấn đề: 1.1 Giới thiệu isoflavone Isoflavone phân nhánh thuộc nhóm flavonoid, có nhiều loại thực vật họ đậu (leguminosae) Các nguồn nguyên liệu thực vật giàu isoflavone nghiên cứu đậu nành, cỏ ba đỏ, cỏ linh lăng, đậu trắng, củ sắn dây, v.v… Các nhóm aglycone (genistein, daidzein glycitein) có hoạt tính sinh học cao dạng -glycoside (genistin, daidzin glycitin) ổn định với nhiệt độ, chiếm lượng lớn tổng số thành phần isoflavone nên chúng quan tâm nhiều để trích ly sử dụng 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước công nghệ thu nhận ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone Trên giới, nhằm đáp ứng hàm lượng bổ sung vào sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe isoflavone, nhiều cơng trình nghiên cứu phương pháp trích ly tinh chế công bố ứng dụng vào quy mô sản xuất công nghiệp, tuân theo kỹ thuật trích ly “xanh”, dựa vào yếu tố nguồn nguyên liệu công nghệ khai thác “xanh” Tại Việt Nam, có lợi nguồn nguyên liệu giàu isoflavone, song nghiên cứu nước thu nhận isoflavone sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung cao isoflavone chưa nghiên cứu cách toàn diện CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu thực vật dùng nghiên cứu trích ly isoflavone: Hạt đậu nành (Glycine max (L.) Merr), hạt đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) thu nhận Đại Lộc-Quảng Nam, củ sắn dây (Pueraria montana var lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) thu nhận Thiệu Hóa, Thanh Hóa bã đậu nành thu nhận sở chế biến đậu phụ, sữa đậu nành Đà Nẵng Nguyên liệu làm sạch, sấy khô, trộn đều, xay mịn bảo quản hộp kín nhiệt độ -20±2oC 2.1.2 Hóa chất, chế phẩm sinh học thiết bị sử dụng Các chất chuẩn isoflavone, hóa chất phân tích sử dụng nghiên cứu có xuất xứ từ hãng Merck (Đức), Sigma (Hoa kỳ) hãng khác, đạt chuẩn phân tích Các loại nhựa macroporous sử dụng để nghiên cứu gồm: D101, AB8 (Anhui Sanxing Resin Technology Co., Ltd, Trung Quốc), Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Corporation, Nhật Bản) Amberlite XAD4 (Acros, Pháp) Giống vi khuẩn lactic thương mại Yoflex Express 1.0 (Chr Hansen Đan Mạch), chế phẩm enzyme thương mại Celluclast 1,5L (Novozymes, Đan Mạch) sử dụng nghiên cứu 2.2 Bố trí thí nghiệm 2.2.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone thành phần số loại nguyên liệu thực vật Khảo sát hàm lượng isoflavone số thành phần hóa học loại nguyên liệu: hạt đậu nành, hạt đậu xanh, củ sắn dây bã đậu nành Hàm lượng isoflavone loại nguyên liệu đánh giá theo hợp chất gồm: daidzein, genistein glycitein (thuộc nhóm aglycone), daidzin, glycitin genistin (thuộc nhóm -glycoside) 2.2.2 Khảo sát phương pháp trích ly đến hiệu thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành bã đậu nành Khảo sát điều kiện trích ly isoflavone nguyên liệu lựa chọn phương pháp: chiết khuấy dùng sóng siêu âm; tiến hành tối ưu hóa điều kiện trích ly theo hàm lượng isoflavone quy hoạch thực nghiệm toàn phần mức yếu tố leo dốc tìm cực trị theo mơ hình Box-Wilson 2.2.3 Khảo sát phương pháp tinh chế cao isoflavone thu nhận từ hạt bã đậu nành Khảo sát lựa chọn tinh chế isoflavone gồm trích ly rắn-lỏng sắc ký cột (hạt pha tĩnh loại nhựa macroporous) Khảo sát nâng cao hàm lượng aglycone thủy phân glycoside isoflavone sử dụng chế phẩm enzyme Celluclast1.5L 2.2.4 Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm hoạt tính sinh học cao isoflavone Cao isoflavone kiểm tra an toàn thực phẩm (hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp v.v ) kiểm tra hoạt tính sinh học (hoạt tính estrogen in vitro in vivo, hoạt tính bảo vệ gan ex vivo, hoạt tính chống peroxy hóa lipid v.v ) 2.2.5 Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt bã đậu nành Đề xuất quy trình cơng nghệ với số giải pháp công nghệ cải tiến 2.2.6 Ứng dụng isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe Xây dựng quy trình sản xuất sữa chua đậu nành-nước cốt dừa nectar chanh dây bổ sung isoflavone từ đậu nành bã đậu nành đạt chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo tiêu chuẩn Việt Nam 2.2.7 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone Đánh giá thành phần hóa học đề xuất giải pháp sử dụng phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone ứng dụng chế biến sản phẩm thực phẩm 2.3 Phương pháp nghiên cứu Một số phương pháp nghiên cứu sử dụng: Phân tích isoflavone theo phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC (AOAC 2008.83) tiêu hóa lý, vi sinh thực theo tiêu chuẩn Việt Nam Phương pháp đánh giá cảm quan: phép thử mơ tả đặc tính sản phẩm, phép thử cho điểm thị hiếu, phép thử so hàng thị hiếu, phép thử tam giác thực Các thí nghiệm thực lần, kết trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, so sánh khác có nghĩa mức =0,05 Tính tốn quy hoạch thực nghiệm toàn phần yếu tố mức TYT23 phân tích ANOVA thực phần mềm Minitab 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone thành phần hóa học từ số nguyên liệu thực vật Hàm lượng isoflavone tổng đậu nành cao nhất, gấp 14,30 lần so với bã đậu nành, gấp 4,25 lần so với củ sắn dây Đậu xanh hạt xuất genistein với hàm lượng thấp Mặt khác đậu nành ngắn ngày, thâm canh từ 2-3 vụ năm, cho sản lượng lớn, giá rẻ Trong sắn dây thu hoạch lần/năm nên giá thành cao Việc sử dụng bã đậu nành để trích ly isoflavone vừa đóng vai trị quan trọng mặt tận dụng giá trị dinh dưỡng lại, vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường Do nghiên cứu chọn nguyên liệu đậu nành bã đậu nành để tiến hành khảo sát trích ly nhóm hợp chất isoflavone 3.2 Ảnh hưởng số phương pháp trích ly đến hiệu thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành 3.2.1 Phương pháp chiết khuấy Nghiên cứu khảo sát đơn biến yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly sử dụng phương pháp chiết khuấy Giữa mẫu trích ly có khác pH mơi trường (pH 2,5, pH 7,1; pH 9), mẫu có pH 7,1 cho hàm lượng isoflavone cao khơng có khác biệt có nghĩa mẫu (p>0,05) Kết cho yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ DM/NL, nhiệt độ thời gian trích ly có tác dụng đáng kể đến hàm lượng isoflavone thu nhận (hình 3.5 3.7) 3.2.2 Phương pháp dùng sóng siêu âm Qua phân tích chiều ANOVA hàm lượng isoflavone mẫu thí nghiệm, nghiên cứu chọn điều kiện siêu âm đạt giá trị hàm lượng isoflavone tổng cao 70% mức NLSA-15 phút (1773,0±21,7g/g chất khô) (hình 3.11) 3.2.3 So sánh hiệu thu nhận isoflavone từ phương pháp trích ly thực nghiệm Trích ly isoflavone sóng siêu âm mức NLSA 70% giữ hoạt tính chống oxi hóa hợp chất isoflavone rút ngắn thời gian trích ly khó ứng dụng cơng nghiệp Phương pháp trích ly chiết khuấy cho hiệu trích ly cao đơn giản, dễ vận hành, chi phí lượng thấp so với phương pháp siêu âm (hình 3.12) Vì nghiên cứu tiếp theo, phương pháp chiết khuấy lựa chọn để trích ly isoflavone 11 Cụ thể, khả hấp phụ tổng số isoflavone, daidzin genistin nằm khoảng 4,89-5,32 mg/g, 1,31 -1,45 mg/g hạt nhựa 2,19-2,35 mg/g hạt nhựa , tương ứng Tỷ lệ hấp phụ loại nhựa nằm khoảng 76,1-82,1% isoflavone tổng số, 64,0-71,0% daidzin 79,3-85,1% genistin Tương tự, khả giải hấp tỷ lệ giải hấp tổng số isoflavone, genistin daidzin giảm theo thứ tự Amberlite® XAD4> D101> AB-8> HP-20 Khả giải hấp daidzin, genistin tổng số isoflavone nhựa D101 1,45 mg/g hạt nhựa, 2,21 mg/ g hạt nhưa 4,48 mg/g hạt nhựa có khác biệt không đáng kể (p> 0,05) nhựa D101 Amberlite® XAD4 So với nhựa Amberlite® XAD4 có thành cao, nhựa D101 lại có giá thành rẻ lực hấp phụ giải hấp phụ tương tự XAD-4 Do đó, nhựa D101 lựa chọn nguyên liệu cho trình tinh chế isoflavone 3.4.3 Nghiên cứu tinh chế isoflavone từ cao thô thu nhận từ hạt đậu nành nhựa macroporous D101 Theo đồ thị hình 3.20 cho thấy trình hấp phụ đẳng nhiệt isoflavone từ đậu nành phù hợp với mơ hình Langmuir Freundlich 12 Trên mơ hình hấp phụ sắc kí cột (hình 3.22) chọn thể tích dung dịch isoflavone hấp phụ 3,75 BV, tức 750ml với tốc độ với tốc độ hấp phụ 1,5 BV/h Kết thực nghiệm khảo sát khả giải hấp phụ qua cột D101 (hình 3.23) cho thấy lượng ethanol 70% cần để rửa giải hợp chất isoflavone hoàn toàn 2,5BV với tốc độ rửa giải BV/h Trong đó, đường cong rửa giải tập trung từ 0,5BV đến 1,5BV, đạt đỉnh 0,625BV cho daidzin, genistin isoflavone tổng cho thấy khả rửa giải hấp phụ nhanh chóng (hình 3.22 3.23) Cao isoflavone tinh chế đạt 144,664±1,214 (mg/g), gấp 8,73±0,06 lần so với cao thô gấp lần so với cao dichlomethane/ethanol thực phương pháp trích ly rắn lỏng 3.4.4 Khảo sát điều kiện nâng cao hàm lượng aglycone từ cao isoflavone tinh chế chế phẩm enzyme Celluclast 1.5L Nghiên cứu nhằm mục tiêu nâng cao hàm lượng aglycone 13 cao isoflavone tinh chế phương pháp thủy phân nhóm -glycoside sử dụng chế phẩm enzyme Celluclast1.5 L Khảo sát cho thấy yếu tố thủy phân nồng độ enzyme, nồng độ chất thời gian thủy phân ảnh hưởng đến hiệu chuyển hóa hợp chất -glycoside sang hợp chất aglycone tương ứng Tại thời điểm thủy phân 360 phút, hiệu suất thủy phân daidzin, glycitin genistin đạt 96% đạt hiệu suất thu hồi daidzein, glycitein genistein 91,8, 71,6 84,3 khơng có khác biệt có nghĩa (p>0,05) so với thời điểm 420 phút 480 phút Kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm enzyme Celluclast1.5 nồng độ với nồng độ enzyme 0,16%, thời gian 360 phút nồng độ chất 17,5 mg/ml thủy phân hồn tồn nhóm -glycoside thu hàm lượng nhóm aglycone chiếm 95% hàm lượng isoflavone tổng Hình 3.27 thể hàm lượng aglycone tăng pic hàm lượng glycoside không xuất sau thủy phân 3.4.5 Nghiên cứu tinh chế isoflavone thu nhận từ bã đậu nành nhựa macroporous D101 Isoflavone từ bã đậu nành cho thấy phù hợp với mơ hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir Freundlich (hình 3.30) Trên mơ hình sắc kí cột, cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành đạt 36,216 (mg isoflavone /g cao), tăng gấp 7,090 lần so với cao thô, đạt hiệu suất thu hồi 74,82% 14 Như kết tinh chế isoflavone từ hạt bã đậu nành nhựa D101 thu đáp ứng mục tiêu đề nhằm gia tăng hàm lượng isoflavone để bổ sung vào sản phẩm thực phẩm Mặt khác, phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ D101 để tinh isoflavone phương pháp hiệu công nghệ kinh tế sử dụng dung mơi nước cất ethanol nên an tồn, không gây độc hại, dễ thu hồi dung môi, hiệu suất thu hồi cao 3.5 Kiểm tra hoạt tính sinh học tính an tồn thực phẩm cao tinh chế 3.5.1 Kiểm tra hoạt tính sinh học cao isoflavone Thử nghiệm hoạt tính estrogen in vitro loại cao isoflavone dòng tế bào MCF7 cho thấy cao tinh chế từ hạt đậu nành tăng sinh 14,94% tế bào từ bã đậu nành 7,41% tế bào Kết thực nghiệm thử nghiệm hoạt tính estrogen in vivo cao isoflavone từ hạt đậu nành chuột chủng dòng BALB/c làm suy giảm buồng trứng 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) cho thấy lơ chuột có bổ sung mẫu cao chiết khơng ảnh hưởng đến trọng lượng thể chuột, làm tăng khối lượng tử cung chuột so với mẫu đối chứng bệnh lý bị suy giảm buồng trứng Hình 3.33 thể tử cung chuột mẫu thử nghiệm có biểu bị teo nhỏ so với mẫu đối chứng âm lô chuột sử dụng VCD 15 Hình 3.33: Hình ảnh tử cung chuột lơ thí nghiệm Mặt khác mẫu cao chiết isoflavone làm tăng phát triển nang trứng, hàm lượng estradiol huyết so với lô chuột đối chứng bệnh lý Như cao chiết isoflavone thể chức estrogen, cải thiện tình hình chuột suy giảm buồng trứng cao so với chuột xử lý VCD Thử nghiệm hoạt tính chống peroxy hóa lipid ex-vivo tế bào gan chuột, mẫu cao tinh chế có giá trị EC50(µg/ml) 360,65±17,49 (g/ml) 418,13±9,19(g/ml), thể khả chống peroxide hóa lipid Ngồi ra, bốn mẫu cao isoflavone thử hoạt tính bảo vệ gan mơ hình nuôi cấy tế bào HepG2 tác động CCl4 Kết khảo sát hiệu quét gốc tự DPPH cao isoflavone cho thấy hiệu quét gốc tự tỉ lệ thuận với hàm lượng isoflavone mẫu Giá trị IC50(µg/ml) cao tinh chế từ hạt đậu nành bã đậu nành đạt 352,3 (µg/mL) 853,6 (µg/mL) 3.5.2 Kiểm tra tính an tồn thực phẩm cao tinh chế Kết thử nghiệm hoạt tính độc cấp mẫu cao isoflavone khơng thể khả gây độc cấp tính cho chuột nhắt trắng dòng BALB/c theo đường uống thử nghiệm uống liều cao 10 gram/kg thể trọng, đảm bảo an tồn thực phẩm Kết phân tích hàm lượng kim loại nặng Pb, Cd, As Hg cao tinh chế đậu nành bã đậu nành giới hạn định lượng phương pháp phân tích (AOAC 999.10) 16 Tóm lại, qua phân tích cho thấy cao isoflavone từ đậu nành bã đậu nành đảm bảo an toàn thực phẩm thể hoạt tính sinh học bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng 3.6 Đề xuất quy trình trích ly, tinh chế nâng cao chất lượng cao isoflavone từ hạt bã đậu nành Quy trình cơng nghệ trích ly, tinh chế nâng cao chất lượng cao isoflavone từ hạt bã đậu nành trình bày hình 3.39 cho nhóm sản phẩm: sản phẩm bột cao isoflavone thô, sản phẩm bột cao isoflavone tinh chế sản phẩm bột cao giàu aglycone 17 3.7 Ứng dụng cao isoflavone sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 3.7.1 Thử nghiệm sản xuất sữa chua đậu nành-nước cốt dừa bổ sung isoflavone thu nhận từ đậu nành Nghiên cứu lựa chọn công thức phối chế sữa chua đậu nành-nước cốt dừa với tỉ lệ nước cốt dừa bổ sung 15% so với dịch sữa đậu nành phù hợp để dùng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone Sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt dừa với liều lượng cao isoflavone thô bổ sung g cao thơ/100g sản phẩm (kí hiệu SoCY) kiểm tra đảm bảo tiêu hóa lý, tiêu vi sinh lượng (theo QCVN 5-5:2010/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm sữa lên men, Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7030:2016 Sữa lên men) Hàm lượng isoflavone có sản phẩm 21,15 mg/100g sản phẩm, đạt 15% so với liều dùng tối thiểu khuyến cáo ngày từ 30-90 mg/ngày Hình 3.41 thể sắc ký đồ HPLC isoflavone mẫu sữa chua, minh chứng cho gia tăng hàm lượng isoflavone mẫu bổ sung cao thô isoflavone (SoCY) so với mẫu đối chứng không bổ sung isoflavone Sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt dừa bổ sung isoflavone Hội đồng cảm quan thị hiếu cho điểm đạt tiêu điểm, cao có nghĩa so với mẫu sữa chua khác khác biệt so với mẫu sữa chua nước cốt dừa không bổ sung isoflavone (p>0,05) Luận án đề xuất quy trình chế biến sản phẩm bảo vệ sức khỏe sữa chua đậu nành-nước cốt dừa mô tả chi tiết hình 3.45 Sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt dừa xây dựng “Bản 18 công bố sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone”, đáp ứng điều kiện cần thực phẩm bảo vệ sức khỏe Nghị định 15/2018 NĐ-CP Luật thực phẩm 19 3.7.2 Thử nghiệm sản xuất nectar chanh dây bổ sung cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành Hàm lượng cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm nectar chanh dây 0,5g/100ml để đảm bảo hàm lượng isoflavone tổng 17,87mg/100 ml sản phẩm (bảng 3.41) Sản phẩm nectar chanh dây bổ sung isoflavone (hình 3.54) đảm bảo tiêu chất lượng hóa lý vi sinh theo TCVN 7946:2008 Nước nectar -Quy định kỹ thuật QCVN 6-2:2010/BYT Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia Đồ uống không cồn Đồng thời 200ml sản phẩm nectar chanh dây cung cấp gần 40mg isoflavone, phù hợp với liều lượng isoflavone khuyến nghị cho người tiêu dùng Sản phẩm đạt điểm thị hiếu >7,5 điểm tiêu cảm quan, khác biệt có nghĩa so với sản phẩm đối chứng không bổ sung isoflavone (p>0,05) hội đồng đánh giá cảm quan gồm 100 thành viên Điều chứng minh sản phẩm bổ sung isoflavone không ảnh hưởng đến tính chất cảm quan tiêu hóa lý sản phẩm nectar chanh dây Quy trình cơng nghệ chế biến sản phẩm bảo vệ sức khỏe nectar chanh dây bổ sung isoflavone đề xuất hình 3.53 Với kết nghiên cứu này, sản phẩm nectar chanh dây xây dựng “Bản công bố sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone”, đáp ứng điều kiện cần thực phẩm bảo vệ sức khỏe 20 3.8 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone So với mẫu bột đậu nành nguyên liệu, bột đậu nành sau trích ly isoflavone giữ lại hầu hết thành phần hóa học protein tổng (32,692g/100g), lipid (17,810g/100g), xơ tổng(12,897g/100g) khoáng chất (Ca, P, K, Mg) Hàm lượng acid béo linoleic chiếm gần 50%, oleic acid palmitic acid, tương tự bột đậu nành Từ phân tích cho thấy bột đậu nành sau trích ly isoflavone nguồn nguyên liệu giàu thành phần protein lipid, đề xuất ứng dụng chế biến cao protein đậu nành dầu ăn 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận 1- Từ loại nguyên liệu thực vật có sản lượng lớn khu vực miền Trung-Tây nguyên, nghiên cứu chọn hạt đậu nành bã đậu nành làm nguyên liệu để thu nhận isoflavone Hàm lượng hợp chất (mg/g chất khô) hạt đậu nành 1,579 bã đậu nành chứa 0,111 2- Đã nghiên cứu sử dụng phương pháp trích ly: chiết khuấy siêu âm cho kết thu nhận isoflavone có dịch chiết thơ sau:  Chiết khuấy: Sử dụng tỉ lệ dung môi ethanol 80%:nguyên liệu chiết (ml/g) 26,5:1 − Dịch trích ly thơ từ hạt đậu nành chứa 1,932 (mg/g chất khơ) isoflavone trích ly nhiệt độ 72,5°C, thời gian 67,5 phút − Từ bã đậu nành, dịch chiết thơ chứa 0,160 (mg/g chất khơ) isoflavone trích ly nhiệt độ 74,5oC, thời gian 79,0 phút Các thông số công nghệ sử dụng phương pháp kiểm chứng quy hoạch thực nghiệm toàn phần với mức yếu tố tối ưu hóa theo mơ hình Box-Wilson  Siêu âm Dịch chiết thơ thu chứa 1,773 (mg/g chất khô) isoflavone (tại 75% mức NLSA 15 phút) Với kết thu từ phương pháp trích ly, đủ để chọn phương pháp chiết khuấy có gia nhiệt vừa cho hiệu thu nhận isoflavone cao, vừa rẻ dễ sử dụng 3- Với mục tiêu tinh chế isoflavone cao chiết thô làm giàu cấu tử aglycone, nghiên cứu tiến hành:  Tinh chế isoflavone cao chiết thô hạt đậu nành: 22 Sử dụng hạt nhựa macroporous D101 cho kết quả: cao sau tinh chế/cao thô (mg/g cao) 144,664/16,624  Làm giàu aglycone thuộc nhóm isoflavone: Sử dụng chế phẩm enzyme Celluclast1.5L cho kết quả: aglycone chiếm tỉ lệ >95% isoflavone tổng, gấp 4,57 lần so với aglycone có cao tinh 4- Đánh giá chất lượng cao thô cao tinh chứa isoflavone thu nhận từ hạt bã đậu nành  Hoạt tính nội tiết tố estrogen: − Tỉ lệ tăng sinh tế bào MCF-7 cao tinh/cao thô (%) đạt 14,94/3,90 từ hạt đậu nành 7,41/1,07 từ bã đậu nành − Bằng phương pháp in vivo lô chuột trắng nhận thấy: • Khi sử dụng 4-vinylclohexene diepoxide (VCD) làm giảm khối lượng tử cung chuột từ 29,8 cịn 20,7 (mg/10g thể trọng chuột) • Bổ sung isoflavone [cao thô (M1)/cao tinh (M3)] với liều lượng 2000/1000 (mg/kg thể trọng chuột) cho phục hồi đáng kể khối lượng tử cung chuột (mg/10g thể trọng chuột) từ 20,7 lên 27,3/từ 20,7 lên 26,6  Hoạt tính sinh học: • Hoạt tính bảo vệ dịng tế bào gan HepG2 cao tinh/cao thô (%) đạt giá trị 15,39/2,32 từ hạt đậu nành; 22,17/4,55 từ bã đậu nành • Sử dụng phương pháp MDA-test đánh giá khả chống peroxy hóa lipid màng tế bào isoflavone cao tinh thông qua giá trị IC50 (g/ml): 360,65 từ hạt đậu nành 418,13 từ bã đậu nành 23 5- Đề xuất cải tiến số cơng đoạn dây chuyền trích ly isoflavone từ hạt bã đậu nành Các cơng đoạn là:  Trích ly chiết khuấy: Điều kiện: • Nhiệt độ cho hạt bã đậu nành là: 72,5 74,5 oC • Thời gian cho hạt bã đậu nành lần lượt: 67,5 79,0 phút • Tỉ lệ ethanol 80%/nguyên liệu (ml/g): 26,5/1  Tinh chế hoạt chất isoflavone nhựa D101 Hiệu thu nhận isoflavone cao tinh gấp 8,7 lần so với cao thô chiết tách từ hạt đậu nành; gấp 7,09 lần so với cao thô từ bã đậu nành  Nâng cao hàm lượng aglycone - cấu tử mang hoạt tính sinh học cao chế phẩm enzyme Celluclast 1.5L Điều kiện: pH 5; nhiệt độ (oC) 50; thời gian (h) 6- Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung isoflavone  Sữa chua đậu nành-nước cốt dừa  Nectar chanh dây Hai quy trình đề xuất xây dựng cơng bố Sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo Nghị định 15/2018 NĐ-CP hội đồng đánh giá cảm quan thị hiếu cho điểm tiêu (trạng thái, màu, mùi, vị) với điểm trung bình >7 theo thang điểm 7- Đề xuất hướng tận thu nguồn đậu nành sau thu nhận isoflavone dành cho sản phẩm:  Dầu đậu nành  Cao protein thực vật ... chất isoflavone Do đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ số nguồn thực vật ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng? ?? lựa chọn Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình. .. Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt bã đậu nành Đề xuất quy trình cơng nghệ với số giải pháp công nghệ cải tiến 2.2.6 Ứng dụng isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe Xây dựng. .. nhiên, nghiên cứu nước isoflavone cịn ít, sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao Vì cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu dồi nước ứng dụng