Luận án nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn

PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Một bệnh lây nhiễm từ thịt lợn gây nguy hiểm cho người bệnh liên cầu khuẩn lợn Đây bệnh truyền nhiễm loại liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S suis) gây Bệnh xảy hầu hết lồi động vật máu nóng, lợn người chủ yếu Dựa vào đặc điểm polysaccharid lớp vỏ bọc vi khuẩn, xác định vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết Trong đó, S suis type thường gây bệnh người động vật (Smith et al., 1999) Vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi tự nhiên, ổ chứa lợn nhà Cả lợn rừng, ngựa, chó, mèo chim mang vi khuẩn liên cầu lợn Những loài động vật mang mầm bệnh chúng không gây bệnh gây bệnh nhẹ, gặp điều kiện thuận lợi chúng gây nguy hiểm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh cs., 2001) Bệnh lợn biểu viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm nội tâm mạc viêm khớp Thông thường người bị nhiễm vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh, lợn chết ăn tiết canh lợn, thịt lợn bệnh, lợn chết chưa nấu chín kỹ (Lê Văn Tạo, 2005) Con đường lây truyền từ lợn sang người qua vết thương da, đường hô hấp, tiếp xúc với máu, dịch tiết lợn bệnh qua đường ăn uống Ruồi, gián, chuột động vật trung gia làm phát tán mầm bệnh (Vecht et al., 1992) Vi khuẩn liên cầu lợn gây hai bệnh cảnh viêm màng não nhiễm khuẩn huyết, nặng gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc Nếu không phát bệnh sớm điều trị kịp thời, người bệnh tử vong Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh để lại di chứng nặng nề bị ù tai, giảm thính lực, điếc hồn tồn… (Vecht et al., 1992) Thời gian ủ bệnh ngắn, từ vài đến ngày Khi khởi phát, người bệnh có triệu chứng sốt cao kèm theo rét run; mệt, đau mỏi người; đau đầu, buồn nôn nôn, đau bụng, tiêu chảy; mê sảng, ngủ gà, mê Những trường hợp nhiễm khuẩn huyết xuất huyết da, ban xuất huyết hoại tử lan rộng mặt, ngực, chân, tay đầu chi (Arends and Zanen, 1988; Tan et al., 2008b) Các phương pháp chẩn đoán bệnh liên cầu khuẩn lợn gây thường dùng phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn môi trường chuyên dụng, phương pháp PCR Khơng dừng lại đó, việc ứng dụng phát triển công nghệ ADN tái tổ hợp mở cho nhà khoa học nhiều hướng việc tìm phương pháp chẩn đốn xây dựng hệ thống phòng bệnh cách hiệu Các vùng gene thị S suis type biểu thành protein tái tổ hợp Tiếp theo đó, dựa sở tính ưu việt phản ứng miễn dịch liên kết đặc hiệu kháng nguyên kháng thể để phát triển phương pháp chẩn đốn có độ nhạy độ đặc hiệu cao Các phương pháp ELISA, phương pháp dot blot ứng dụng rộng rãi việc chẩn đoán bệnh nước giới (Torremorell et al., 1997; Okwumabua and Chinnapapakkagari, 2005; Mandanici et al., 2010) Trong năm gần đây, giới phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa phương pháp sắc kí miễn dịch (ICT) KIT có độ đặc hiệu, độ xác cao, khơng cần phịng thí nghiệm, khơng cần thiết bị kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu thiệt hại cho người, động vật bị bệnh Nhiều nhà khoa học nghiên cứu phát triển KIT chẩn nhanh Sheng et al (2012) nghiên cứu chế tạo KIT phát khối u cá, Wang et al (2014) với nghiên cứu chế tạo KIT phát kháng thể kháng giun tròn Paragonimiasis skrjabini Tại Việt Nam, số nhà nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật ICT để chế tạo KIT phát nhanh kháng nguyên kháng thể Đinh Thị Bích Lân cs (2009) với cơng trình nghiên cứu KIT chẩn đốn nhanh phát kháng thể kháng kí sính trùng Toxoplasma gondii Nguyễn Hồng Lộc cs (2015) với cơng trình nghiên cứu KIT phát kháng nguyên bám dính F4 Thế chưa có tác giả nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh liên cầu khuẩn type người động vật Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh liên cầu khuẩn type mang tính cấp thiết có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn KIT chẩn đoán nhanh đáp ứng tốt nhu cầu phát bệnh sớm kiểm sốt tình trạng mang mầm bệnh gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu chăn nuôi 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chế tạo KIT phục vụ cơng tác chẩn đốn nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type lợn 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: lợn lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis type phân lập từ mẫu dịch mũi lợn Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017 Địa điểm nghiên cứu: + Các lò giết mổ lợn địa bàn Thừa Thiên Huế; + Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam; + Phịng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học Vắc xin, Viện Cơng nghệ Sinh học, Đại học Huế 1.4 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây cơng trình nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S suis type lợn giết mổ địa bàn Thừa Thiên Huế Mẫu vi khuẩn S suis type phân lập phân tích đặc tính sinh học sinh học phân tử KIT chẩn đoán S suis type đề tài nghiên cứu có độ nhạy độ đặc hiệu cao, cho kết tương tự với KIT chẩn đoán S suis type Ju et al (2010) công bố 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu tài liệu tham khảo dùng giảng dạy nghiên cứu bệnh vi khuẩn S suis type gây lợn Trường, Viện nghiên cứu chuyên ngành thú y 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S suis type lợn khỏe lò giết mổ lợn địa bàn Thừa Thiên Huế, sở để đánh giá mức độ nguy hiểm nguy lây nhiễm bệnh vi khuẩn liên cầu lợn type gây người động vật Sản phẩm KIT chẩn đốn vi khuẩn S suis type có độ nhạy độ đặc hiệu cao thích hợp cho cơng tác chẩn đốn lâm sàng thực địa, từ cán thú y người làm công tác dịch tễ đưa chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh liên cầu lợn type từ lợn sản phẩm lợn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis nước giới 2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis giới Bệnh liên cầu khuẩn lợn Streptococcus suis (S suis) gây nên, bệnh xảy nhiều nơi giới gây tổn thất lớn kinh tế Bệnh liên cầu lợn lây cho người Chính xếp vào nhóm bệnh chung người động vật Windsor and Elliott (1975) phân lập chủng Streptococcus tương ứng với nhóm R Moor phân lập đề nghị gọi Streptococcus suis type Những chủng có phản ứng với huyết type gọi type ½ S suis phát nhiều nơi giới nơi chăn nuôi lợn như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan Trung Quốc… (Vecht et al., 1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006) Từ năm 1983 đến năm 1995 có 32 số 35 type Streptococcus phân lập Hầu hết chủng phân lập từ lợn bệnh thuộc số type định, từ – Mặc dù type phân lập hầu tỷ lệ có sai khác vùng địa lý Chẳng hạn, Canada tỷ lệ phân lập S suis type tương đối thấp (dưới 25%) (Higgins and Gottschalk, 2001) Ở Nhật, tỷ lệ phân lập S suis type cao (28%) (Kataoka et al., 1993); Châu Âu tỷ lệ thấp nước Pháp, Ý Tây Ban Nha (Smith et al., 1999; Gottschalk et al., 2007) Bệnh vi khuẩn liên cầu lợn gây người với trường hợp viêm màng não trường hợp nhiễm trùng nặng đến mức tử vong mô tả lần Đan Mạch (Perch et al., 1968) Sau đó, bệnh vi khuẩn dần báo cáo Hà Lan, Anh nhiều nước khác Từ đến nay, vi khuẩn thu hút quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học nhiều nước giới Các trường hợp người mắc bệnh thông báo nước giới: Hà Lan, Đan Mạch, Đức, Bỉ, Anh, Pháp, Tây Ban Nha, Thụy Điển, Úc, Hungari, Hồng Kông, Croatia, Nhật, Singapore, Đài Loan, New Zealand, Argenetina, Trung Quốc… Trên giới phát khoảng 490 ca bệnh liên cầu lợn người, tỷ lệ tử vong 17,5% (Sihvonen et al., 1988; Touil et al., 1988) S suis vi sinh vật thường xuyên cư trú niêm mạc hốc tự nhiên thể lợn, đồng thời phân bố rộng rãi môi trường thiên nhiên, vi khuẩn động vật có trạng thái cân (Wei et al., 2009) Theo Perch et al (1983), vi khuẩn Streptococcus suis xâm nhập vào đàn lợn khỏe mang mầm bệnh amidan hay đường mũi Lợn khỏe bị bệnh viêm màng não sau vài tháng mang mầm bệnh amidan Việc nhập lợn khỏe mang mầm bệnh (lợn giống, lợn đực giống lợn cai sữa) lợn sinh đàn mang bệnh lan truyền vi khuẩn S suis cho lợn Lợn mang mầm bệnh phân vào chuồng nuôi gây nhiễm cho lợn khác S suis ảnh hưởng tới lợn lứa tuổi Nhưng hầu hết trường hợp xảy lợn nằm 3-12 tuần tuổi đặc biệt sau lợn cai sữa nhốt chung với Các nhà nghiên cứu Anh phát thấy đàn lợn giống mang S suis amidan 5-12 ngày Vecht et al (1985) nghiên cứu phương thức thông thường làm lan truyền vi khuẩn S suis đàn lợn thông qua nhập lợn mang bệnh, vật môi giới xác chết mang vi khuẩn S suis sống ruồi ngày Khi ruồi tiếp xúc với thức ăn, nước uống lợn hay đàn lợn với Ruồi môi giới truyền bệnh nguy hiểm Theo Windsor (1977), ruồi tự bay xa bám phương tiện “xe cộ” để xa nhiều nữa, điều kiện thuận lợi cho bệnh dịch lây lan Trước yếu tố gây lây lan mầm bệnh, biện pháp phòng bệnh khâu vệ sinh chuồng trại chăn ni, chăm sóc ni dưỡng quản lý đàn yếu tố vô quan trọng công việc chăn nuôi lợn (Vasconcelos et al., 1994) Do tính chất nghiêm trọng bệnh, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh liên cầu lợn gây Với cơng trình nghiên cứu tạo dịng biểu kháng nguyên bề mặt liên cầu lợn type vào năm 2008 Tan et al (2009) nghiên cứu thành cơng vắc xin phịng chống liên cầu lợn type gây bệnh lợn Với mục đích phịng chống bệnh liên cầu lợn gây ra, nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập vi khuẩn S suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004) Đặc biệt, để đáp ứng nhu cầu phát nhanh kháng thể kháng kháng S suis type 2, Yang et al (2007), phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT) với nguồn nguyên liệu điều chế kháng thể kháng S suis type lớp vỏ polysaccharide vi khuẩn KIT phát nhanh kháng thể kháng S suis type có độ nhạy độ đặc hiệu 97,1% 86,3% so với phương pháp ELISA Cũng với mục đích phát vi khuẩn S suis type gây bệnh lợn, Ju et al (2010) thành công việc chế tạo KIT chẩn đoán nhanh dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch Hiện nay, có số tác giả giới tiến hành nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp, vắc xin thô để phòng bệnh liên cầu khuẩn như: Li et al (2006); Tan et al (2009) Tuy nhiên hiệu chưa đánh giá đầy đủ 2.1.1.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis nước Trước khả gây bệnh nguy hiểm vi khuẩn liên cầu lợn, nhiều nhà nghiên cứu Việt Nam tiến hành nghiên cứu nơi cư trú vi khuẩn, lưu hành hay khả gây bệnh vi khuẩn Nguyễn Như Thanh cs (2001) xác định nơi cư trú liên cầu lợn lợn đường tiêu hoá sinh dục Vi khuẩn S suis thường xuyên phân lập vịm họng đường hơ hấp lợn khỏe, tồn họng, xoang mũi Những lợn khỏe mạnh mang trùng nhốt chung với đàn lợn chưa bị bệnh, bệnh phát ra, lợn mẹ truyền cho lợn qua đường hơ hấp, từ truyền cho khác lúc nhập đàn hay cai sữa Trong nghiên cứu biện pháp phòng bệnh S suis Phạm Sĩ Lăng cs (2002) rằng, để phòng bệnh, việc xác định loại thải lợn nái mang bệnh chia đàn, phân ô chuồng trang trại cần thiết Cần chia lợn cai sữa thành ô chuồng nhỏ để đạt độ tăng trưởng tối đa chúng Việc diệt trừ tận gốc mầm bệnh cách giảm mật độ nuôi ô chuồng điều kiện cần thiết có hiệu Nên định kỳ di chuyển lợn ô chuồng nuôi, kết hợp với tẩy uế chuồng trại cần thiết vô quan trọng cơng tác phịng chống bệnh Trong biện pháp quản lý đàn phải hạn chế tối đa tác động mật độ đông hệ thống thơng gió Chỉ số thơng gió lưu thơng khơng khí chuồng phải thích hợp với mật độ đàn ni chuồng Nếu số thơng gió số mắc bệnh cao Khi có dịch xảy phải cách ly phân chia riêng biệt thành khu vực lợn khỏe lợn ốm để tránh lây lan Trong trình cách ly theo dõi, lợn già yếu, ốm yếu khơng có hy vọng chữa khỏi phải loại sớm để tạo điều kiện thu hẹp toán sớm đàn lợn bị bệnh Trong trình theo dõi, cách ly tuyệt đối không nhập lợn vào, phải thường xuyên tiêu độc, tẩy uế chuồng trại loại sát trùng Crezil, dung dịch xút (Nguyen Thi Hoang Mai et al., 2008; Tran Vu Thieu Nga et al., 2011) Hiện có type liên cầu lợn thường gây bệnh lợn, type hay gây dịch bệnh lẻ tẻ đàn lợn tuần tuổi, type gây bệnh nhiều lứa tuổi khác Cả type cư trú amidal Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh cs., 2001) Lê Văn Tạo (2005) công bố nghiên cứu lan vi khuẩn S Suis type từ lợn bệnh sang người cho S suis type tồn kéo dài năm amiđan lợn mang mầm bệnh kể điều trị penicilline Vi khuẩn S suis thường xuyên phân lập lợn khỏe cảnh báo khả lây nhiễm bệnh từ lợn cho người chăn nuôi, người tham gia công tác giết mổ, người tiêu dùng Hiện nay, nghiên cứu tỉnh Thừa Thiên Huế có báo cáo lưu hành vi khuẩn S suis lợn khỏe Theo Bùi Thị Hiền cs (2016), tỷ lệ nhiễm S suis lợn khỏe 17,31% 2.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA LIÊN CẦU KHUẨN LỢN Vào thập niên 1950, Anh Hà Lan, nhà nghiên cứu thuộc ngành thú y phát tác nhân thuộc nhóm vi khuẩn S suis gây viêm màng não viêm khớp lợn (Vecht et al., 1985; Sihvonen et al., 1988) Đây nhóm liên cầu xếp vào nhóm D theo phân loại Lancefied đặt tên Streptococcus suis (Streptococcus nghĩa Latin liên cầu khuẩn, suis nghĩa lợn) Ngày nay, nhiễm Streptococcus suis lợn ghi nhận Mỹ, Canada, nước Tây Âu, Nhật, Trung Quốc, Hồng Công Streptococcus suis gây bệnh lợn bao gồm triệu chứng viêm màng não mủ, nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm nội tâm mạc viêm khớp (Trịnh Quang Hiệp cs., 2004) Năm 1968, trường hợp nhiễm S suis người mô tả lần đầu Đan Mạch Sau đó, bệnh ghi nhận người bệnh lây truyền từ động vật sang người nhiều nơi giới Tính đến năm 2007, toàn giới ghi nhận khoảng 400 trường hợp người nhiễm S suis, hầu hết châu Âu Châu Á (Yu et al., 2006) 2.2.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn S suis có hình cầu, hình trứng, đường kính có đến μm, chúng xếp thành chuỗi chuỗi hạt, có độ dài ngắn khơng Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S suis Nguồn: Hughes et al (2009) Các vi khuẩn nuôi cấy sau 18 chủ yếu dạng hình cầu Ở mơi trường ni cấy có 5% huyết hình thái chuỗi nhìn thấy rõ Vi khuẩn làm tiêu trực tiếp từ động vật có hình cầu Nhưng mơi trường phân lập ban đầu, nhầm với trực khuẩn ngắn Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với số loại thuốc nhuộm thông thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt màu Gram (+) (Mahon et al., 2000; Tan et al., 2008a) 2.2.2 Đặc tính ni cấy sinh hóa Vi khuẩn S suis vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, liên cầu khuẩn lợn mọc thành khóm nhỏ với đường kính khoảng 0,5-1 mm, màu xanh nhạt hay suốt nhầy khơng mọc dung dịch có chứa 6,5% NaCl… (Đỗ Ngọc Thuý cs., 2009) Vi khuẩn S suis gây bệnh thích hợp nhiệt độ 37ºC (có thể phát triển rộng từ 10ºC - 45º C, pH thích hợp từ – 7.2) phát triển nhiều loại môi trường: - Môi trường nước thịt: Vi khuẩn S suis hình thành hạt bơng, lắng xuống đáy ống Sau nuôi cấy mơi trường trong, đáy ống có cặn - Mơi trường thạch thường: Vi khuẩn S suis hình thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, trịn, lồi, bóng, màu xám - Trên mơi trường đặc: Có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 ni cấy với kích thước khoảng - mm Sau 72 kích thước khuẩn lạc lớn nhất, đạt tới - mm Nếu nuôi điều kiện có - 10% CO2 khuẩn lạc phát triển nhanh rộng Khuẩn lạc thường tạo chất nhầy mạnh, độ nhầy rõ tăng vi khuẩn nuôi cấy vài vào môi trường 32 nước thịt có bổ sung huyết trước cấy sang môi trường đặc thạch máu Dạng khuẩn lạc môi trường thạch thường nhỏ khô mơi trường có bổ sung dinh dưỡng (Nguyễn Như Thanh cs., 2001; Phạm Sỹ Lăng cs., 2005) - Trên môi trường MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 ni cấy, hình thành khuẩn lạc nhỏ đầu đinh ghim (Trịnh Phú Ngọc cs., 1999; Phạm Sỹ Lăng cs., 2005) - Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trịn, gọn, vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 nuôi cấy Đặc biệt, môi trường này, dựa vào tính chất dung huyết, người ta thấy liên cầu có type khuẩn lạc quan sát độ phóng đại gấp 60 lần (Nguyễn Như Thanh cs., 2001) + Type anpha (α): khuẩn lạc bao quanh vịng hồng cầu cịn ngun hình màu xanh, xa khuẩn lạc chút có vong trịn tan máu; + Type beta (β): bao quanh khuẩn lạc vịng tan máu hồn tồn suốt có bờ rõ ràng; + Type gama (γ): xung quanh khuẩn lạc khơng có thay đổi nào, hồng cầu thạch giữ màu hồng nhạt Ở môi trường đặc nhìn thấy khuẩn lạc sau 24 ni cấy, kích thước từ - mm khuẩn lạc lớn sau 72 giờ, khuẩn lạc thường đạt tới 3-4 mm Nếu nuôi cấy điều kiện có 10% CO2 khuẩn lạc phát triển nhanh rộng (Trịnh Phú Ngọc cs., 1999) Dạng khuẩn lạc môi trường thạch thường nhỏ khơ mơi trường có bổ sung chất dinh dưỡng Khuẩn lạc mọc môi trường thạch máu dạng nhỏ vồng trắng trong, rìa gọn, màu vàng chanh vàng thẫm Đa số vi khuẩn gây bệnh cho lợn gây dung huyết nuôi cấy thạch máu cừu, bò, dê, S suistạo dung huyết dạng α β (Biền Văn Minh, 2003) Vi khuẩn S suis có khả lên men loại đường glucoza, lactoza, saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men loại đường: sorbit, dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin Tính chất khơng lên men đường innulin đặc tính để phân biệt tính chất độc chủng gây bệnh (Smith et al., 1999) S suis tăng trưởng kỵ khí hiếu khí, khơng thể tăng trưởng 6,5% dung dịch NaCl S suis không chứa men catalaza oxidaza phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-) Vi khuẩn không di động Vi khuẩn có kháng ngun giáp mơ sinh hai loại men streptokinaza (diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn Minh, 2003) 2.2.3 Sức đề kháng Enright et al (1987) khẳng định nhóm vi khuẩn khơng hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mơ, hình thành giáp mơ xác định vi khuẩn sinh sống mơ mọc mơi trường ni cấy có chứa huyết S suis sống điều kiện nhiệt độ 60oC vòng 10 phút, nhiệt độ 50oC sống xác súc vật đến tuần 10oC S suis type tồn phân, bụi Ở 0oC tồn phân đến 104 ngày tồn bụi 54 ngày Khi nhiệt độ 9oC sống phân 10 ngày sống bụi 25 ngày Nhưng vi khuẩn S suis type tồn 10 86 Shim W., Z Yang, J Kim, J Kim, S Kang, G Woo, Y Chung, S A Eremin and D Chung (2007) Development of immunochromatography strip-test using nanocolloidal gold-antibody probe for the rapid detection of aflatoxin B1 in grain and feed samples Journal of microbiology and biotechnology Vol 17 (10) pp 1629-1637 87 Sihvonen L., D Kurl and J Henrichsen (1988) Streptococcus suis isolated from pigs in Finland Acta Veterinaria Scandinavica Vol 29 (1) pp 9-13 88 Silva L.M., C.G Baums, T Rehm, H.J Wisselink, R Goethe and P ValentinWeigand (2006) Virulence-associated gene profiling of Streptococcus suis isolates by PCR Veterinary microbiology Vol 115 (1-3) pp 117-127 89 Singer J.M and C.M Plotz (1956) The latex fixation test: I Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis The American journal of medicine Vol 21 (6) pp 888-892 90 Smith H.E., M Damman, J van der Velde, F Wagenaar, H.J Wisselink, N Stockhofe-Zurwieden and M.A Smits (1999) Identification and Characterization of thecps Locus of Streptococcus suis Serotype 2: the Capsule Protects against Phagocytosis and Is an Important Virulence Factor Infection and immunity Vol 67 (4) pp 1750-1756 91 Stills H.F (1994) Chapter 20 - Polyclonal Antibody Production**Supported in part by Public Health Service Grant RR06222 from the National Center for Research Resources, National Institutes of Health In P J Manning, Ringler D H & Newcomer C E (Eds.), The Biology of the Laboratory Rabbit (Second Edition) (https://doi.org/10.1016/B978-0-12-469235-0.50026-9pp 435-448) San Diego: Academic Press 92 Sun P., J.-Q Wang, Y.-T Zhang and S.-G Zhao (2014) Evaluating the immune responses of mice to subcutaneous immunization with Helicobacter pylori urease B subunit Journal of animal science and biotechnology, 5(1) pp 14 doi:10.1186/2049-1891-5-14 93 Tan C., M Liu, J Liu, F Yuan, S Fu, Y Liu, M Jin, W Bei and H Chen (2009) Vaccination with Streptococcus suis serotype recombinant 6PGD protein provides protection against S suis infection in swine FEMS microbiology letters Vol 296 (1) pp 78-83 99 94 Tan C., M Liu, M Jin, J Liu, Y Chen, T Wu, T Fu, W Bei and H Chen (2008a) The key virulence-associated genes of Streptococcus suis type are upregulated and differentially expressed in vivo FEMS microbiology letters Vol 278 (1) pp 108-114 95 Tan C., S Fu, M Liu, M Jin, J Liu, W Bei and H Chen (2008b) Cloning, expression and characterization of a cell wall surface protein, 6- phosphogluconate-dehydrogenase, of Streptococcus suis serotype Veterinary microbiology Vol 130 (3-4) pp 363-370 96 Tarradas C., A Arenas, A Maldonado, I Luque, A Miranda and A Perea (1994) Identification of Streptococcus suis isolated from swine: proposal for biochemical parameters Journal of Clinical Microbiology Vol 32 (2) pp 578-580 97 Terkawi M.A., K Kameyama, N.H Rasul, X Xuan and Y Nishikawa (2013) Development of an immunochromatographic assay based on dense granule protein for serological detection of Toxoplasma gondii infection Clinical and Vaccine Immunology Vol pp CVI 00747-00712 98 Thobhani S., S Attree, R Boyd, N Kumarswami, J Noble, M Szymanski and R A Porter (2010) Bioconjugation and characterisation of gold colloid-labelled proteins Journal of immunological methods Vol 356 (1-2) pp 60-69 99 Torremorell M., P Carlos and T Emilio (1997) Vaccination against Streptococcus suis: effect on nursery mortality Journal of Swine Health and Production Vol (4) pp 139-143 100 Touil F., R Higgins and M Nadeau (1988) Isolation of Streptococcus suis from diseased pigs in Canada Veterinary microbiology Vol 17 (2) pp 171-177 101 Tran Vu Thieu Nga, Ho Dang Trung Nghia, Le Thi Phuong Tua, To Song Diep, Nguyen Thi Hoang Mai, Tran Thi Hong Chau, Dinh Xuan Sinh, Nguyen Hoan Phu, Tran Thi Thu Nga, Nguyen Van Vinh Chau, C James, Ngo Thi Hoa, Nguyen Tran Chinh, Tran Tinh Hien, F Jeremy and C Schultsz (2011) Real-time PCR for detection of Streptococcus suis serotype in cerebrospinal fluid of human patients with meningitis Diagn Microbiol Infect Dis Vol 70 (4) pp 461-467 102 Vanden Bout D.A (2002) Metal Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Applications Edited by Daniel L Feldheim (North Carolina State University) and Colby A Foss, Jr (Georgetown University) Marcel Dekker, Inc New York and 100 Basel 2002 x+ 338 pp $150.00 ISBN: 0-8247-0604-8 Journal of the American Chemical Society Vol 124 (26) pp 7874-7875 103 Vanier G., M Segura, P Friedl, S Lacouture and M Gottschalk (2004) Invasion of porcine brain microvascular endothelial cells by Streptococcus suis serotype Infect Immun Vol 72 (3) pp 1441-1449 104 Vasconcelos D., D.M Middleton and J.M Chirino-Trejo (1994) Lesions caused by natural infection with Streptococcus suis type in weaned pigs J Vet Diagn Invest Vol (3) pp 335-341 105 Vecht U., H.J Wisselink, J.E van Dijk and H.E Smith (1992) Virulence of Streptococcus suis type strains in newborn germfree pigs depends on phenotype Infect Immun Vol 60 (2) pp 550-556 106 Vecht U., L.A van Leengoed and E.R Verheijen (1985) Streptococcus suis infections in pigs in the Netherlands (Part I) Vet Quart Vol (4) pp 315-321 107 Verwey E.J.W and J.T.G Overbeek (1948) The free energy of a double layer system Theory of the Stability of Lyophobic Colloids Elsevier, New York Vol pp 51 108 Wang Y., L Wang, J Zhang, G Wang, W Chen, L Chen and X Zhang (2014) Preparation of colloidal gold immunochromatographic strip for detection of Paragonimiasis skrjabini PloS one, 9(3) pp.e92034 doi:10.1371/journal.pone.0092034 109 Wei Z., R Li, A Zhang, H He, Y Hua, J Xia, X Cai, H Chen and M Jin (2009) Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007 Vet Microbiol Vol 137 (1-2) pp 196-201 110 Windsor R S (1977) Meningitis in pigs caused by Streptococcus suis type II Vet Rec Vol 101 (19) pp 378-379 111 Windsor R.S and S.D Elliott (1975) Streptococcal infection in young pigs IV An outbreak of streptococcal meningitis in weaned pigs J Hyg (Lond) Vol 75 (1) pp 69-78 112 Wui S.R., J.E Han, Y.H Kim, G.E Rhie and N.G Lee (2013) Increased longterm immunity to Bacillus anthracis protective antigen in mice immunized with a CIA06B-adjuvanted anthrax vaccine Arch Pharm Res Vol 36 (4) pp 464-471 101 113 Yang J., M Jin, J Chen, Y Yang, P Zheng, A Zhang, Y Song, H Zhou and H Chen (2007) Development and evaluation of an immunochromatographic strip for detection of Streptococcus suis type antibody J Vet Diagn Invest Vol 19 (4) pp 355-361 114 Yu H., H Jing, Z Chen, H Zheng, X Zhu, H Wang, S Wang, L Liu, R Zu, L Luo, N Xiang, H Liu, X Liu, Y Shu, S.S Lee, S.K Chuang, Y Wang, J Xu and W Yang (2006) Human Streptococcus suis outbreak, Sichuan, China Emerg Infect Dis Vol 12 (6) pp 914-920 115 Zaytseva N.V., R.A Montagna, E.M Lee and A.J Baeumner (2004) Multianalyte single-membrane biosensor for the serotype-specific detection of Dengue virus Analytical and bioanalytical chemistry Vol 380 (1) pp 46-53 116 Zhang C.P., Y.B Ning, Z.Q Zhang, L Song, H.S Qiu, H.Y Gao and X.Z Fan (2009) Distributions of pathogenic capsular types and in vitro antimicrobial susceptibility of different serotypes of Streptococcus suis isolated from clinically healthy sows from 10 provinces in China Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi Vol 30 (3) pp 235–238 102 PHỤ LỤC Phụ lục Phương pháp tinh sản phẩm PCR Sau thực phản ứng PCR, số lượng lớn phân tử ADN vùng cần nghiên cứu nhân lên Sản phẩm tinh dùng để giải trình trình tự trực tiếp dịng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp nhận cao Tiến hành tinh sản phẩm PCR sử dụng hóa chất hãng Promega (Wizard®SV Gel and PCR CleanUp System) Bước 1: Thêm dung dịch Membrane Binding Solution (MBS) vào sản phẩm PCR theo tỷ lệ 1:1 trộn Bước 2: Chuyển toàn dung dịch lên màng cột lọc, ủ phút, ly tâm 13.000 vòng/phút phút, đổ bỏ dịch phía cột lọc Bước 3: Thêm 700 µl dung dịch Membrane Wash Solution (WB), ly tâm 13.000 vòng/phút phút, đổ bỏ dịch Bước 4: Lặp lại bước với 500 µl WB, ly tâm 13.000 vịng/phút phút Bước 5: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl Nuclease Free Watervào màng lọc, để nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13.000vòng/phút phút, thu sản phẩm PCR tinh Ký hiệu bảo quản -200C sử dụng 103 Phụ lục Tách ADN plasmid tái tổ hợp Sử dụng hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp hãng Invitrogene (PureLink® Quick Plasmid ADN Miniprep Kits) sử dụng Tách chiết ADN plasmid thực nhờ dung dịch có khả làm ly giải tế bào vi khuẩn, loại bỏ ADN hệ gene vi khuẩn khỏi ADN plasmid loại muối vơ có dung mơi Kit Sau dung dịch chứa ADN palsmid chuyển sang cột lọc, có cấu tạo màng lọc tích điện dương (+), giữ lại ADN plasmid tích điện âm (-), qua nhiều lần ly tâm Các bước tiến hành tách ADN plasmid tái tổ hợp (phương pháp Hãng sinh phẩm Invitrogene - Chuyển dịch nuôi cấy sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút phút để thu tế bào Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên (dùng pipet hút hết dịch giữ lại cặn tế bào) - Thêm 250 µl dung dịch (R3) vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho - Thêm 250 µl dung dịch (L7) vào hỗn dịch để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn cách lắc xi ngược tồn vài lần, ủ nhiệt độ phòng phút - Thêm 350 µl dung dịch (N4), trộn nhẹ nhàng, sau đem ly tâm 13000 vịng/phút 10 phút, nhiệt độ 40C - Chuyển toàn phần dịch bên lên màng cột lọc Ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch - Thêm 500 µl dung dịch (W10) lên màng lọc, để nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch bên - Thêm 700 µl dung dịch (W9) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Ly tâm lại để làm khô cột - Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, thêm 75 µl dung dịch TE lên màng lọc, để nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ cột lọc thu dịch chứa ADN plasmid Ký hiệu mẫu bảo quản - 200C 104 Phụ lục Tách chiết tinh kháng thể Econo-Pac protein A kit Sử dụng dụng cụ Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad) với mục đích tinh tất phân lớp kháng thể IgG, kể IgG1 Việc chuẩn bị mẫu đơn giản hóa cách sử dụng cột tách muối Econo-Pac 10DG Quá trình gắn, tách rửa, thu sản phẩm hồn tất với cột lượng dung dịch đệm định cho bước, tạo nên quy trình nhanh dễ dàng Thành phần KIT bao gồm: Cột Econo-Pac protein A (chứa 2ml thạch Affi-Gel protein A), Cột tách muối Econo-Pac 10DG, dung dịch đệm để gắn protein (Binding bufer), dung dịch tách rửa (Elution buffer), dung dịch rửa hoàn nguyên (Regeneration buffer, rửa cột để tái sử dụng) - Chuẩn bị đệm + Binding buffer: hòa tan 37,68g binding buffer với nước cất, định mức 120 ml Khuấy 10 phút, lọc qua lọc nylon 0,22 µm pH ± 0,2 + Elution buffer: hòa tan 2,64g Elution buffer với nước cất, định mức 120ml pH 3,0 ± 0,2 Chuẩn bị mẫu + Bước 1: Loại bỏ dung dịch đệm (phía trên) cột Econo-pac 10DG + Bước 2: Cho ml dung dịch đệm gắn (binding buffer) vào cột (đổ từ phía trên) bẻ gãy phần nhọn đáy để dịng chảy cột lưu thơng + Bước 3: Cho ml huyết vào cột Nếu lượng mẫu ml cho thêm dung dịch đệm để đạt thể tích cuối 3ml + Bước 4: Đợi để huyết chảy hết vào cột Loại bỏ ml dung dịch tách rửa + Bước 5: Cho vào cột ml dung dịch đệm gắn (binding buffer), thu ml dịch từ cột + Bước 6: Rửa cột Econo-pac 10DG với 20 ml đệm gắn để sử dụng lại lần sau, rửa với 20 ml nước chứa 0.02% sodium azide để bảo quản lâu dài + Bước 7: Loại bỏ dung dịch đệm (phía trên) cột Econo-pac protein A + Bước 8: Cho vào cột 10 ml đệm gắn Để cho đệm rút từ từ khỏi mặt cột + Bước 9: Cho mẫu (đã chuẩn bị bước trên) vào cột Thể tích mẫu tối đa 2ml + Bước 10: Cho vào cột 20 ml dung dịch đệm gắn (binding buffer) + Bước 11: Cho vào cột 10 ml dung dịch đệm tách rửa, hứng dịch chảy qua cột vào cốc dịch chứa IgG (Sử dụng thêm 20 ml dung dịch đệm tách rửa đảm bảo trình tách rửa triệt để Tuy nhiên, hầu hết IgG tách rửa với 10 ml dung dịch đệm ban đầu) 105 + Bước 12: Chuẩn bị cột Econo-pac 10DG (mới, chưa sử dụng) cân trước với 20 ml PBS đệm thích hợp để bảo quản globulin miễn dịch + Bước 13: Cho ml IgG thu bước 11 vào cột Econo-pac 10DG chuẩn bị bước 12 Loại bỏ ml dịch + Bước 14: Cho tiếp vào cột Econo-pac 10DG ml PBS, thu (hứng vào cốc) ml dịch chảy từ cột Đây dung dịch chứa IgG Làm nhắc lại hết dịch mẫu Sau thu dung dịch chứa IgG, tiến hành điện di SDS-PAGE để kiểm tra độ huyết sau tinh chế 106 Phụ lục Mức độ tương đồng trình tự nucleotic đoạn gene mã hóa kháng ngun 6PGD phân lập từ chủng vi khuẩn TTHSS2 với trình tự nucleotic đoạn gene mã hóa kháng ngun 6PGD công bố Genebank 107 108 Phụ lục Một số Kết ELISA 5.1 Xác định tính sinh miễn dịch 0.001 0.001 0.002 0.001 0.005 0.002 0.003 0.003 0.003 0.001 0.001 0.003 0.004 0.090 2.321 2.333 2.256 2.455 2.232 0.002 0.003 0.001 0.002 0.003 0.002 0.003 0.001 0.003 0.004 0.005 0.181 1.520 2.661 2.521 2.628 2.629 2.624 0.000 0.095 0.005 0.001 0.004 0.003 0.001 0.135 0.001 0.003 0.003 0.004 0.004 0.159 0.002 0.003 0.001 0.003 0.003 0.143 0.001 0.043 0.004 0.004 0.002 0.122 0.002 0.003 0.002 0.004 0.002 0.132 0.001 0.001 0.003 0.022 0.002 0.003 0.034 0.003 0.004 0.002 0.005 0.004 0.004 0.005 0.002 0.002 0.001 0.002 0.001 0.003 0.002 0.003 0.003 0.004 0.001 0.002 0.003 0.002 0.002 0.002 0.003 0.003 0.002 0.005 0.003 0.180 1.514 2.610 2.534 2.642 2.635 2.638 0.001 5.2 Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp 0.189 0.211 0.178 0.219 0.185 0.184 0.183 0.192 1.635 1.612 1.557 1.550 1.551 1.548 1.432 1.423 2.601 2.639 2.620 2.632 2.641 2.642 2.313 2.301 2.512 2.504 2.492 2.512 2.528 2.523 2.225 2.291 2.615 2.599 2.611 2.638 2.599 2.639 2.312 2.318 2.621 2.629 2.628 2.634 2.614 2.642 2.333 2.341 2.632 2.639 2.634 2.632 2.621 2.642 2.403 2.351 0.000 0.001 0.002 0.001 0.001 0.001 0.001 0.003 0.186 1.442 2.311 2.299 2.310 2.315 2.321 0.001 0.187 1.442 2.331 2.301 2.343 2.349 2.351 0.003 Kiểm tra sai khác nhóm thí nghiệm t-Test: Paired Two Sample for Means nhóm nhóm Variable Variable 2.112714286 2.110857 0.869457905 0.87215 7 0.999966854 0.635344332 0.274326312 1.943180274 0.548652624 2.446911846 Mean Variance Observations Pearson Correlation Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T