Sản xuất nước ép tỏi đen (allium sativum l ) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thương gan

MẪU 14KHCN BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài Sản xuất nƣớc ép tỏi đen.

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan Mã số đề tài: 184.TP 08 Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Gia Bửu Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CÁM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu thực đề tài, nhóm nghiên cứu nhận đƣợc nhiều hỗ trợ từ phía nhà trƣờng, ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học –Thực phẩm, đồng nghiệp môn Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn đến nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm tạo điều kiện thời gian phịng thí nghiệm, dụng cụ, thiết bị hóa chất để thực khảo sát đề tài Chúng xin chân thành cảm ơn cô Đàm Sao Mai dành thời gian góp ý hỗ trợ nhóm nghiên cứu quy trình thực kinh nghiệm xử lý tình phát sinh đề tài Mặc dù cố gắng hoàn thành tốt báo cáo nhiên trình thực khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận đƣợc góp ý quý báu thành viên Hội Đồng Chúng xin chân thành cảm ơn! NHĨM NGHIÊN CỨU PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thông tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan 1.2 Mã số: 184.TP08 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên TT (học hàm, học vị) Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Viện Công nghệ sinh Chủ nhiệm đề tài thực TS Trần Gia Bửu học thực phẩm nội dung: -Nghiên cứu quy trình sản xuất tỏi đen -Phân tích hàm lƣợng chất chống oxy hóa khả chống oxy hóa sản phẩm -Phân tích thành phần dinh dƣỡng sản phẩm -Tạo mơ hình tổn thƣơng gan chuột nhắt trắng -Xử lý số liệu viết báo cáo tổng kết đề tài viết báo khoa học 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trƣờng Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh 1.5 Thời gian thực hiện: 18 tháng 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm 2019 1.5.3 Thực thực tế: 18 tháng từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng thay đổi nội dung so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 21 triệu đồng, kinh phí từ ngân sách nhà nƣớc để thực Đề tài 21 triệu đồng (Số tiền chữ: Hai mƣơi mốt triệu đồng); kinh phí từ nguồn khác: triệu đồng (Số tiền chữ: Không đồng) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Tỏi (Allium sativum L) loại thực vật đƣợc trồng rộng rãi nhiều nơi giới loại gia vị gắn liền với ăn ngƣời Việt Khơng đơn gia vị, tỏi đƣợc biết đến với vai trò dƣợc phẩm chữa bệnh với nhiều tác dụng thần kỳ Đã có nhiều nghiên cứu nhằm chứng minh lợi ích mà tỏi mang lại, chứng minh đƣợc tỏi có chứa hoạt chất chống oxy hoá, hoạt chất kháng khuẩn khả chống ung thƣ Bên cạnh ƣu điểm đó, tỏi tƣơi có nhƣợc điểm lớn mùi vị nồng đặc trƣng, gây khó chịu cho ngƣời sử dụng Cho nên ngày nay, việc sử dụng biện pháp xử lý để tạo sản phẩm tỏi khác nhƣ tỏi lão hoá, dầu tỏi đƣợc sử dụng rộng rãi Trong việc xử lý nhiệt để tạo thành tỏi đen nhận đƣợc quan tâm nhà nghiên cứu thực phẩm Bên cạnh việc khắc phục mùi, vị khó chịu tỏi tƣơi, hàm lƣợng hoạt chất chống oxy hoá tỏi đen cao gấp nhiều lần tỏi tƣơi Cụ thể, tổng hàm lƣợng polyphenol tỏi đen (25,81-58,33mg GAE/g) cao nhiều so với tỏi tƣơi (13,91mg GAE/g) tổng hàm lƣợng flavonoid tỏi đen (5,38-16,26mg RE/g) cao so với tỏi tƣơi (3,22mg RE/g) Qua trình lên men hàm lƣợng S-allyl-L-cysteine (SAC) có tỏi đen tăng lên gấp nhiều lần Hàm lƣợng SAC tỏi đen làm giảm phát sinh khối u ruột kết, ung thƣ gan, ung thƣ tuỵ đồng thời có tác dụng ức chế nhân lên tế bào khối u Đồng thời, tỏi đen có khả hạn chế oxy hố lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) - nguyên nhân gây xơ vữa động mạch Vì vậy, hƣớng nghiên cứu áp dụng tỏi đen vào sản phẩm ứng dụng thực tế phục vụ sống yêu cầu tất yếu xã hội Gan quan thể chịu trách nhiệm việc giải độc chuyển hóa tổng hợp chất thể Tuy nhiên việc tiếp xúc với thuốc lá, hóa chất độc hại, virus, rƣợu dẫn đến tổn thƣơng gan nghiêm trọng làm suy yếu chức gan dẫn đến bệnh gan Những năm gần đây, tình trạng bệnh nhân mắc bệnh gan nhƣ viêm gan, xơ gan, ung thƣ gan phổ biến Một xu hƣớng nghiên cứu đại tìm hợp chất oxy hố có nguồn gốc từ động, thực vật để ứng dụng sản xuất thực phẩm, dƣợc phẩm, thực phẩm chức phục vụ cho đời sống Các chất chống oxy hố hợp chất có khả làm chậm lại, ngăn cản, đảo ngƣợc trình oxy hố hợp chất có tế bào thể nên có nhiều ứng dụng việc phịng chữa trị nhằm hỗ trợ ngăn ngừa điều trị tổn thƣơng gan độc tố gốc oxy hóa Một số loải dƣợc thảo nhƣ hoa cúc la mã, kế sữa, xƣơng rồng nopal, xƣơng rồng lê gai, tảo spirulina đƣợc nghiên cứu chứng minh khả bảo vệ gan chống lại tác hại gốc oxy hóa độc tố Trong thành phần tỏi đen có chứa hàm lƣợng cao đáng kể hợp chất amino acid, orano sulfur, chất chống oxy hóa nguồn nguyên liệu thiên nhiên tiềm để ứng dụng vào nghiên cứu Gần đây, dịch chiết tỏi đen đƣợc chứng minh có hoạt tính bảo vệ gan chống lại tác hại carbon tetracholride lên mỡ máu, men gan hình thái mơ học gan mơ hình động vật Tuy nhiên, tác động q trình trích ly enzyme hoạt tính bảo vệ gan sản phẩm nƣớc ép tỏi đen trích ly enzyme lại chƣa đƣợc nghiên cứu Xuất phát từ vấn đề thực tế trên, nhóm nghiên cứu tiến hành hành thực đề tài "Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan" Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đánh giá tác động thơng số quy trình trích ly nhƣ loại enzyme, nồng độ enzyme, thời gian trích ly, nhiệt độ thủy phân lên hoạt tính chống oxy hóa nƣớc ép tỏi đen Thành phần dinh dƣỡng tiêu vi sinh nƣớc ép tỏi đen đƣợc kiểm tra để đảm bảo yêu cầu đồ uống khơng cồn Ngồi ra, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá hoạt tính bảo vệ gan nƣớc ép tỏi đen mơ hình động vật Mục tiêu * Mục tiêu tổng quát - Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất nƣớc ép tỏi đen giàu hoạt tính chống oxy hóa nhằm hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan * Mục tiêu cụ thể - Xác định đƣợc thông số thủy phân để trích ly dịch chiết tỏi đen nhằm thu đƣợc dịch chiết có khả chống oxy hóa cao (khả chống oxy hóa, tổng polyphenol, tổng flavonoid) - Khảo sát tiền lâm sảng khả hỗ trợ phục hồi tổn thƣơng han nƣớc ép tỏi đen mơ hình chuột nhắt trắng Phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Phƣơng pháp sản xuất tỏi đen từ tỏi tƣơi Tỏi nhiều nhánh đƣợc thu mua huyện đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi vào tháng 1/2018 Sau thu mua, tỏi tƣơi đƣợc phân loại, loại bỏ củ hƣ hỏng sâu mọt va chạm Tỏi đƣợc làm sơ bộ, cắt bỏ rễ cuống, tách tép lột vỏ Tỏi lột vỏ đƣợc lên men tủ lão hóa Shellab với thơng số cố định: nhiệt độ 75oC, độ ẩm tƣơng đối 90% 15 ngày Tỏi đen sau trình lên men đƣợc bảo quản nhiệt độ -20oC đƣợc sử dụng cho thí nghiệm 3.2 Phƣơng pháp trích ly dịch chiết tỏi đen enzyme pectinase Tỏi đen sau đƣợc lựa chọn đƣợc nghiền nhuyễn máy xay tiến hành dịch hoá tỏi đen với nƣớc với tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung pectinase theo tỷ lệ: 0, 1, 2, 3, 4, 5% (v/v) Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ (40, 45, 50, 55, 60oC) với thời gian (4, 5, 7, giờ) để pectinase thủy phân tỏi đen Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme pectinase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch trích ly tỏi đen đƣợc sử dụng để khảo sát ảnh hƣớng tỷ lệ enzyme, nhiệt độ thủy phân thời gian thủy phân lên khả chống oxy hóa, polyphenol tổng số, flavonoid tổng số Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại lần, kết đƣợc trình bày dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn 3.3 Phƣơng pháp trích ly dịch chiết tỏi đen enzyme cellulase Tỏi đen sau đƣợc lựa chọn đƣợc nghiền nhuyễn máy xay tiến hành dịch hoá tỏi đen với nƣớc với tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung cellulase theo tỷ lệ tỉ lệ: 0, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1% (w/w) Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ (30, 35, 40, 45, 50, 55oC) với thời gian (1, 2, 3, 4, giờ) để cellulase thủy phân tỏi đen Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme cellulase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch trích ly tỏi đen đƣợc sử dụng để khảo sát ảnh hƣớng tỷ lệ enzyme, nhiệt độ thủy phân thời gian thủy phân lên khả chống oxy hóa, polyphenol tổng số, flavonoid tổng số Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại lần, kết đƣợc trình bày dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn 3.4 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hố dịch chiết tỏi đen Hiệu chống oxy hoá dịch chiết tỏi đen đƣợc đánh giá thông qua khả bắt gốc tự DPPH Khả bắt gốc tự DPPH đƣợc thể thông qua giảm độ hấp thu bƣớc sóng 517nm, gốc DPPH bị khử thành phần chống oxy hóa mẫu khảo sát Khả bắt gốc tự DPPH đƣợc xác định theo công thức: Trong đó, Abs control độ hấp thu mẫu trắng gồm DPPH ethanol, đƣợc đo phút, Abs test độ hấp thu mẫu thử gồm DPPH dịch trích, đƣợc đo sau 30 phút giữ tối 3.5 Phƣơng pháp hàm lƣợng polyphenol tổng số dịch chiết tỏi đen Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu với thuốc thử Folin- Ciocalteu Dịch trích ly đƣợc đo mật độ quang bƣớc sóng 750 nm Acid gallic đƣợc sử dụng nhƣ chất chuẩn tham khảo kết đƣợc quy tƣơng đƣơng theo số miligram acid gallic/1 gram chất khô nguyên liệu (mg GAE/g chất khô) 3.6 Phƣơng pháp hàm lƣợng flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen Hàm lƣợng flavonoid tổng số đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu với dung dịch AlCl3 Dịch trích ly đƣợc đo mật độ quang bƣớc sóng 415 nm Quercetin đƣợc sử dụng nhƣ chất chuẩn tham khảo kết đƣợc quy tƣơng đƣơng theo số miligram quercetin/1 gram chất khô nguyên liệu (mg QE/g chất khô) 3.7 Phƣơng pháp xác định thành phần dinh dƣỡng tiêu vi sinh sản phẩm Tỏi đen sau đƣợc lựa chọn đƣợc nghiền nhuyễn máy xay tiến hành dịch hoá tỏi đen với nƣớc với tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung cellulase với tỷ lệ 0,06% Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ 45oC để cellulase thủy phân tỏi đen Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme cellulase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch trích ly tỏi đen đƣợc đóng chai 200ml trùng nhiệt độ 90oC phút Sau đó, mẫu dịch chiết tỏi đen đƣợc chọn ngẫu nhiên gửi đến phân tích Trung Tâm Phân Tích Kỹ Thuật Cao Sài Gòn nhằm xác định thành phần dinh dƣỡng tiêu vi sinh dịch chiết tỏi đen Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm đƣợc đánh giá tổng số sinh vật hiếu khí (TCVN 4884-1:2015), tổng số bào tử nấm men, nấm mốc (TCVN 8275-1:2010), diện Coliforms (TCVN 6848:2007), E coli (TCVN 7924-2:2008), S aureus (TCVN 4830-1:2005), C perfringens (TCVN 4991:2005), S feacal (TCVN 6189-2:2009), P.aeruginosa (ISO 16266:2006) Thành phần dinh dƣỡng sản phẩm đƣợc xác định qua hàm lƣợng protein tổng số (AOAC 991.20), chất béo (AOAC 996.06), carbonhydrate (EC 152-2009), hàm lƣợng khoáng: Mg, K, Fe, Mn, Zn, Na, Se (AOAC 986.15), P ( AOAC 995.11), hàm lƣợng acid amin (AOAC 994.12), kim loại nặng: chì, asen, cadimi (AOAC 986.15), thủy ngân (AOAC 974.14), vitamin A (AOAC 2001.13) vitamin C (phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao) Khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol tổng số hàm lƣợng flavonoid tổng số đƣợc xác định tƣơng tự với phƣơng pháp xác định dịch trích ly tỏi đen mục 3.4, 3.5, 3.6 3.8 Phƣơng pháp khảo sát khả phục hồi tổn thƣơng gan nƣớc ép tỏi đen mơ hình chuột a Tạo mơ hình chuột tổn thƣơng gan thioacetamide Chuột, giới tính đực, 10 tuần tuổi, có trọng lƣợng từ 30-32g đƣợc cung cấp Viện Pasteur TP HCM Sau đó, chuột đƣợc ni từ 3-5 chuồng có lót trấu điều kiện phịng thí nghiệm đƣợc cho đồ ăn nƣớc uống bình thƣờng tuần để thích nghi Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành lô sau, với con/lô: - Lô (Nƣớc): Lơ chuột bình thƣờng Cho chuột uống nƣớc vịng 18 tuần - Lơ (TĐ): Lơ chuột uống tỏi đen Cho chuột uống nƣớc 10 tuần đầu, sau cho chuột uống tỏi đen với liều lƣợng 200 mg/kg ngày vòng tuần - Lô (TAA): Lô chuột uống TAA Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l ngày 10 tuần Sau đó, chuột tiếp tục đƣợc cho uống nƣớc tuần - Lô (TAA+TĐ): Lô chuột uống TAA dịch chiết tỏi đen Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l ngày 10 tuần Sau đó, cho chuột uống dịch chiết tỏi đen với liều lƣợng 200 mg/kg ngày tuần - Lô (TAA+Sily): Lô chuột uống TAA với Silymarin Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l ngày 10 tuần Sau đó, cho chuột uống silymarin với liều lƣợng 50 mg/kg ngày tuần b Phƣơng pháp đánh giá khả hỗ trợ diều trị tổn thƣơng gan Sau kết thúc thời gian gây bệnh điều trị, chuột đƣợc cho nhịn đói qua đêm để hạn chế tác động thức ăn lên tiêu sinh hóa máu Chuột đƣợc gây mê diethyl ether hộp kín với thời gian phút, sau chúng tơi tiến hành lấy máu từ tim chuột vào ống thu máu có chứa chất chống đơng (heparin) Các tiêu sinh hóa mẫu máu: alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), triglyceride (TG) cholesterol tổng số (TC), đƣợc phân tích máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động Khoa sinh hóa, Bệnh viện quân y 175 Sau đó, tiến hành giải phẫu thu nhận gan chuột giữ dung dịch formaline 4% Mẫu gan đƣợc phân tích mơ học phƣơng pháp nhuộm Hemotoxyline Eosin môn Giải phẩu bệnh, Trung tâm chẩn đoán điều trị ung bƣớu, Bệnh viện quân y 175 Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Ảnh hƣởng yếu tố trích ly pectinase lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol tổng số flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen a Ảnh hƣởng tỷ lệ pectinase lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol tổng số flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen Khi xử lý tỏi đen pectinase khả chống oxy hóa dịch chiết tỏi đen tăng từ 20,76 ± 0,91% (mẫu không xử lý) lên 38,69 ± 0,55% (mẫu xử lý 2%) (p