Sản xuất nước ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thương gan

MẪU 14KHCN BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L ) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan Mã số đề tài 184 TP 08 Chủ nhiệm đề tài TS Trần Gia Bửu Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh 2019 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1 Tổng quan về tỏi đen Tỏi (Allium sativum).

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan Mã số đề tài: 184.TP 08 Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Gia Bửu Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh - 2019 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tỏi đen Tỏi (Allium sativum) loài thực vật thuộc họ Hành, tỏi đƣợc trồng bắt nguồn từ vùng Trung Á đƣợc ngƣời sử dụng rộng rãi nhƣ loại gia vị nhƣ tác dụng dƣợc học chúng Tỏi đƣợc cho có tính chất kháng sinh tăng khả phòng ngừa ung thƣ, chống huyết áp cao, mỡ máu ngƣời Thành phần củ tỏi có khoảng 84,09% nƣớc, 13,38% chất hữu cơ, 1,53% thành phần vơ Cịn phần lá, tỏi có 87,14% nƣớc, 11,27% chất hữuu cơ, 1,59% chất vô Tỏi có chứa hợp chất lƣu huỳnh nhƣ allicin, alliin agoene; enzyme nhƣ allinase, peroxidase miracynase; thành phần carbohydrates bao gồm sucrose glucose; lƣợng lớn khoáng chất, đặc biệt selenium; axit amin nhƣ cysteine, glutamine, isoleucine methionine; bioflavonoids nhƣ quercetin cyanidin, allistatin I II allistatin; vitamin C, E, A vitamin khác nhƣ niacin, B1 B2 hay beta carotene Tỏi đen sản phẩm chế biến từ tỏi tƣơi qua trình lên men chậm (khoảng 35- 55 ngày), dƣới kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ độ ẩm Sản phẩm tạo thành có màu đen, vị ngọt, khơng cịn mùi cay hăng tỏi thƣờng có tác dụng chống oxy hố nhiều lần so với loại tỏi thơng thƣờng (Hình 1.1) Thành phần hóa học tỏi đen chứa chủ yếu axit amin, peptide, protein, enzyme, glicozit, vitamin, … Trong trình lên men, phản ứng hóa học xảy chuyển hóa hợp chất chứa lƣu huỳnh nhƣ methionin, cystein, methanethiol thành hợp chất chứa lƣu huỳnh nhƣ : S-Allyl-L-cysteine, alliin, isoalliin, methionin, cycloalliin, dẫn xuất cysteine, dẫn chất tetrahydro-β-carboline Bên cạnh đó, hàm lƣợng chất chống oxy hố nhƣ hoạt tính chống oxy hố tỏi khơng bị mà ngƣợc lại tăng lên nhiều lần (Bảng 1.1) Theo nghiên cứu Nguyễn T.N cộng sự, sau 30 ngày lên men 60oC, hàm lƣợng hợp chất polyphenol tổng số hàm lƣợng flavonoid tổng số tỏi đen tăng 15.5 lần 6.5 lần so với tỏi tƣơi Nghiên cứu Sato E cộng cho thấy hiệu lực chống oxy hóa tỏi đen cao gấp 25 lần tỏi tƣơi sau trình lên men Khả chống oxy hóa cao tỏi đen giúp bảo vệ thể khỏi tổn hại gốc tự sản sinh thông qua trình trao đổi chất bình thƣờng thể từ tác nhân độc hại bên nhƣ khói bụi, rƣợu bia, thuốc lá, cafein, A B Hình 1.1 Tỏi đen sản phẩm chế biến từ tỏi cách lên men tỏi tƣơi nhiệt độ độ ẩm xác định khoảng thời gian dài Hình ảnh tỏi tƣơi (A) sản phẩm tỏi đen sau lên men (B) Thành phẩn tỏi đen có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nên tỏi đen trở thành loại thực phẩm lý tƣởng để hỗ trợ điều trị cho bệnh mãn tính nhƣ tiểu đƣờng, cao huyết áp, xơ vữa động mạch, rối loạn mỡ máu, bệnh Alzheimer, ung thƣ… Các nghiên cứu trƣớc tỏi đen có tác dụng ức chế tăng trƣởng tế bào ung thƣ bao tử ruột già, cải thiện tình trạng rối loạn mỡ máu, chống béo phì, kháng viêm, chống dị ứng (Kimura S cộng sự, 2017) Thêm vào đó, Jeong J.H cộng (2013) chứng minh dịch chiết tỏi có khả làm giảm độc tính lên tế bào thần kinh Aβ cải thiện suy giảm nhận thức Gần đây, khả bảo vệ chống lại tác động có hại thứ phát q trình oxy hóa xạ trị gây tỏi đen đƣợc ghi nhận (Hồ A.S Vũ B.D, 2014) 1.2 Tổng quan nghiên cứu khả bảo vệ gan tỏi đen Gan quan thể chịu trách nhiệm việc giải độc chuyển hóa tổng hợp chất thể Tuy nhiên việc tiếp xúc với thuốc lá, hóa chất độc hại, virus, rƣợu dẫn đến tổn thƣơng gan nghiêm trọng làm suy yếu chức gan dẫn đến bệnh gan Những năm gần đây, bệnh gan nhƣ viêm gan, xơ gan, ung thƣ gan mối đe dọa sức khỏe toàn cầu Số liệu thống kê số ca tử vong toàn cầu năm 2010 cho thấy khoảng 752,100 ca tử vong ung thƣ gan 307,661 viêm gan cấp, 1,000,000 ca liên quan đến xơ gan toàn giới (Lozano R cộng sự, 2010; Mokdad A.A cộng sự, 2014) Việt Nam nƣớc có tỉ lệ ngƣời dân tử vong mắc xơ gan (18,5 ca tử vong 100,000 ngƣời) số ca tử vong xơ gan Việt Nam cao (chiếm 14,098 ca tử vong năm 2010) Một xu hƣớng nghiên cứu đại tìm hợp chất oxy hố có nguồn gốc từ động, thực vật để ứng dụng sản xuất thực phẩm, dƣợc phẩm, thực phẩm chức phục vụ cho đời sống Các chất chống oxy hoá hợp chất có khả làm chậm lại, ngăn cản, đảo ngƣợc q trình oxy hố hợp chất có tế bào thể nên có nhiều ứng dụng việc phịng chữa trị nhằm hỗ trợ ngăn ngừa điều trị tổn thƣơng gan độc tố gốc oxy hóa Một số loải dƣợc thảo nhƣ hoa cúc la mã, kế sữa, xƣơng rồng nopal, xƣơng rồng lê gai, tảo spirulina đƣợc nghiên cứu chứng minh khả bảo vệ gan chống lại tác hại gốc oxy hóa độc tố (Madrigal-Santillán E cộng sự, 2014) Khả bảo vệ gan tỏi đen đƣợc ghi nhận báo cáo gần Shin J.H cộng (2014) chứng minh khả bảo vệ gan dịch chiết tỏi đen mơ hình gây độc tính gan cấp CCl4 D-gaclactosamine mơ hình tổn thƣơng gan chế độ ăn giàu chất béo Ở ba mơ hình, dịch chiết tỏi đen giảm hoạt độ men gan (ALT, AST), số đánh giá tổn thƣơng gan, nhƣ giảm tích lũy lipid mơ gan (mơ hình chế độ ăn giàu chất béo) giảm xâm nhiễm tế bào đơn nhân vào gan (mơ hình CCl4 D-gaclactosamine) Tác động hỗ trợ điều trị tỏi đen đƣợc khẳng định mơ hình tổn thƣơng gan sử dụng cồn lâu ngày (Kim MH cộng sự, 2011) Kim M.H cộng (2011) sử dụng tỏi đen làm giảm khối lƣợng gan, khối lƣợng mỡ tổng số mỡ mào tỉnh Tỏi đen làm giảm thay đổi chất béo xung quanh không gian khoảng cửa giảm tích tụ mỡ gan Hoạt độ enzyme gan (ALT, AST, ALP, LDH) giảm đáng kể nhóm chuột sử dụng tỏi đen ethanol thƣờng xuyên, so sánh với nhóm sử dụng ethanol thƣờng xuyên Những nghiên cứu góp phần làm rõ tác động trị liệu tỏi đen lên số bệnh lý, đặc biệt bệnh liên quan đến tổn thƣơng gan Gần đây, dịch chiết tỏi đen phƣơng pháp vi sóng đƣợc chứng minh có hoạt tính bảo vệ gan chống lại tác hại carbon tetracholride lên mỡ máu, men gan hình thái mơ học gan mơ hình động vật (Tran G.B cộng sự, 2018) Tuy nhiên, hoạt tính bảo vệ gan sản phẩm nƣớc ép tỏi đen trích ly enzyme lại chƣa đƣợc nghiên cứu Xuất phát từ vấn đề thực tế trên, nhóm nghiên cứu tiến hành hành thực đề tài "Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan" Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đánh giá tác động thơng số quy trình trích ly nhƣ loại enzyme, nồng độ enzyme, thời gian trích ly, nhiệt độ thủy phân lên hoạt tính chống oxy hóa nƣớc ép tỏi đen Thành phần dinh dƣỡng tiêu vi sinh nƣớc ép tỏi đen đƣợc kiểm tra để đảm bảo yêu cầu đồ uống khơng cồn Ngồi ra, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá hoạt tính bảo vệ gan nƣớc ép tỏi đen mơ hình động vật A B C D Hình 1.2 Dịch chiết tỏi đen trích ly phƣơng pháp có tác dụng bảo vệ gan mơ hình chuột bị tổn thƣơng gan carbon tetrachloride Nhóm đối chứng (A) nhóm sử dụng tỏi đen (B) cho thấy đặc điểm mơ học hình thái bình thƣờng Gan nhóm gây tổn thƣơng gan carbon tetrachloride có dấu hiệu bất thƣờng hình thái nhƣ sƣng to, màu nâu nhạt bề mặt có nốt sần (C) Nhóm cho uống tỏi đen kết hợp với carbon tetrachloride (D) có sụ cải thiện hình thái gan nhƣ màu đỏ, khơng cịn sung bề mặt nốt sần (Tran G.B cộng sự, 2018) CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Tỏi tƣơi nhiều nhánh (Allium sativum) đƣợc thu mua huyện đảo Lý Sơn, Tỉnh Quảng Ngãi vào tháng 6/2017 (Hình 2.1) Sau thu mua tỏi, tỏi đƣợc phân loại lựa chọn củ tỏi không bị hƣ hỏng vật lý, không sâu mọt để tiến hành nghiên cứu Tỏi đƣợc bóc vỏ lên men tủ lão hóa (Shellab, Hoa Kỳ) với nhiệt độ 75oC độ ẩm tƣơng đối 90% sau 15 ngày (Nguyễn T.H.Y Trần G B., 2018) Tỏi đen sau lên men đƣợc bảo quản -20oC đƣợc sử dụng thí nghiệm A B Hình 2.1 Tỏi tƣơi tỏi đen sử dụng nghiên cứu Tỏi tƣơi đƣợc bóc vỏ (A) sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất tỏi đen (B) qua trình lên men nhiệt độ 75oC độ ẩm tƣơng đối 90% sau 15 ngày 2.2 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng thơng số trích ly dịch chiết tỏi đen pectinase lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol, hàm lƣợng flavonoid Nhằm khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme bổ sung lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền với nƣớc theo tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung pectinase (Pectinex Ultra SP, Novozymes, Đan Mạch) với tỷ lệ (0, 2, 2,5, 3, 3,5, 4%) (v/v) Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ 45oC với thời gian Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme pectinase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch lọc đƣợc sử dụng để khảo sát khả chống oxy hóa hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số Nhằm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền nhuyễn với nƣớc theo tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung pectinase với tỷ lệ 3,5% (v/v) Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ (40, 45, 50, 55, 60oC) với thời gian Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme pectinase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch lọc đƣợc sử dụng để khảo sát khả chống oxy hóa hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số Nhằm khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền nhuyễn với nƣớc theo tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung pectinase với tỷ lệ 3,5% (v/v) Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ với thời gian (4, 5, 7, giờ) để pectinase thủy phân tỏi đen Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme pectinase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch lọc đƣợc sử dụng để khảo sát khả chống oxy hóa hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số 2.3 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng thông số trích ly dịch chiết tỏi đen cellulase lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol, hàm lƣợng flavonoid Nhằm khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme bổ sung lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền nƣớc với tỷ lệ 1:10 máy xay sinh tố Sau hỗn hợp đƣợc ủ với tỷ lệ enzyme cellulase (Novozymes, Đan Mạch) nhƣ sau: 0%, 0,02%, 0,04%, 0,06%, 0,08%, 0,10% nhiệt độ 45oC Sau thủy phân cellulase, hỗn hợp nƣớc tỏi đen đƣợc đun lên nhằm bất hoạt enzyme lọc qua máy lọc chân không Dịch lọc đƣợc sử dụng để khảo sát khả chống oxy hóa hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số Nhằm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền nƣớc với tỷ lệ 1:10 máy xay sinh tố Sau hỗn hợp đƣợc ủ với tỷ lệ enzyme cellulase 0,06% nhiệt độ 40, 45, 50, 55, 60oC Sau thủy phân cellulase, hỗn hợp nƣớc tỏi đen đƣợc đun lên nhằm bất hoạt enzyme lọc qua máy lọc chân không Dịch lọc đƣợc sử dụng để khảo sát khả chống oxy hóa hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số Nhằm khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân bổ sung lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền nƣớc với tỷ lệ 1:10 (nguyên liệu: nƣớc) máy xay sinh tố Sau hỗn hợp đƣợc ủ với tỷ lệ enzyme cellulase nhƣ sau 0,06% nhiệt độ 45oC 1, 2, 3, 4, Sau thủy phân cellulase, hỗn hợp nƣớc tỏi đen đƣợc đun lên nhằm bất hoạt enzyme lọc qua máy lọc chân không Dịch lọc đƣợc sử dụng để khảo sát khả chống oxy hóa hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số 2.4 Phƣơng pháp khảo sát khả chống oxy hoá dịch chiết tỏi đen Khả chống oxy hóa dịch chiết tỏi đen đƣợc đánh giá thông qua khả bắt gốc tự DPPH Phƣơng pháp xác định khả bắt gốc tự DPPH tiến hành theo phƣơng pháp Choi I.S cộng (2014) với vài hiệu chỉnh nhỏ Khả bắt gốc tự DPPH đƣợc thể thông qua giảm độ hấp thu bƣớc sóng 517nm, gốc DPPH bị khử thành phần kháng oxy hóa mẫu khảo sát Khả bắt gốc tự DPPH đƣợc xác định theo cơng thức: Trong đó, Abs control độ hấp thu mẫu trắng gồm DPPH ethanol, đƣợc đo phút, Abs test độ hấp thu mẫu thử gồm DPPH dịch trích, đƣợc đo sau 30 phút giữ tối 2.5 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số dịch chiết tỏi đen Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu với thuốc thử Folin- Ciocalteu Dịch trích ly đƣợc đo mật độ quang bƣớc sóng 750 nm Acid gallic đƣợc sử dụng nhƣ chất chuẩn tham khảo kết đƣợc quy tƣơng 10 đƣơng theo số miligram acid gallic/1 gram chất khô nguyên liệu (mg GAE/g chất khô) 2.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen Hàm lƣợng flavonoid tổng số đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu với dung dịch AlCl3 Dịch trích ly đƣợc đo mật độ quang bƣớc sóng 415 nm Quercetin đƣợc sử dụng nhƣ chất chuẩn tham khảo kết đƣợc quy tƣơng đƣơng theo số miligram quercetin/1 gram chất khô nguyên liệu (mg QE/g chất khô) 2.7 Phƣơng pháp xác định thành phần dinh dƣỡng tiêu vi sinh sản phẩm Tỏi đen sau đƣợc lựa chọn đƣợc nghiền nhuyễn máy xay tiến hành dịch hoá tỏi đen với nƣớc với tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng 1:10 Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung cellulase với tỷ lệ 0,06% Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ tủ ấm với nhiệt độ 45oC để cellulase thủy phân tỏi đen Sau đó, hỗn hợp đƣợc đồng hóa máy xay sinh tố gia nhiệt đến 90oC phút nhằm bất hoạt enzyme cellulase Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc giấy lọc Whatman Dịch trích ly tỏi đen đƣợc đóng chai 200ml trùng nhiệt độ 90oC phút Sau đó, mẫu dịch chiết tỏi đen đƣợc chọn ngẫu nhiên gửi đến phân tích Trung Tâm Phân Tích Kỹ Thuật Cao Sài Gòn nhằm xác định thành phần dinh dƣỡng tiêu vi sinh dịch chiết tỏi đen Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm đƣợc đánh giá tổng số sinh vật hiếu khí (TCVN 4884-1:2015), tổng số bào tử nấm men, nấm mốc (TCVN 8275-1:2010), diện Coliforms (TCVN 6848:2007), E coli (TCVN 7924-2:2008), S aureus (TCVN 4830-1:2005), C perfringens (TCVN 4991:2005), S feacal (TCVN 6189-2:2009), P.aeruginosa (ISO 16266:2006) Thành phần dinh dƣỡng sản phẩm đƣợc xác định qua hàm lƣợng protein tổng số (AOAC 991.20), chất béo (AOAC 996.06), carbonhydrate (EC 152-2009), hàm lƣợng khoáng: Mg, K, Fe, Mn, Zn, Na, Se (AOAC 986.15), P ( AOAC 995.11), hàm lƣợng acid amin (AOAC 994.12), kim loại nặng: chì, asen, cadimi (AOAC 986.15), thủy ngân (AOAC 974.14), vitamin A (AOAC 2001.13) vitamin C (phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao Albalá-Hurtado S et al (1997)) 11 Khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol tổng số hàm lƣợng flavonoid tổng số đƣợc xác định tƣơng tự với phƣơng pháp xác định dịch trích ly tỏi đen mục 2.4, 2.5, 2.6 2.8 Phƣơng pháp khảo sát khả phục hồi tổn thƣơng gan nƣớc ép tỏi đen mơ hình chuột Chuột, giới tính đực, 10 tuần tuổi, có trọng lƣợng từ 30-32g đƣợc cung cấp Viện Pasteur TP HCM Sau đó, chuột đƣợc ni từ 3-5 chuồng có lót trấu điều kiện phịng thí nghiệm đƣợc cho đồ ăn nƣớc uống bình thƣờng tuần để thích nghi Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành lô sau, với con/lơ: - Lơ (Nƣớc): Lơ chuột bình thƣờng Cho chuột uống nƣớc vịng 18 tuần - Lơ (TĐ): Lô chuột uống tỏi đen Cho chuột uống nƣớc 10 tuần đầu, sau cho chuột uống tỏi đen với liều lƣợng 200 mg/kg ngày vòng tuần - Lô (TAA): Lô chuột uống TAA Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l ngày 10 tuần Sau đó, chuột tiếp tục đƣợc cho uống nƣớc tuần - Lô (TAA+TĐ): Lô chuột uống TAA dịch chiết tỏi đen Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l ngày 10 tuần Sau đó, cho chuột uống dịch chiết tỏi đen với liều lƣợng 200 mg/kg ngày tuần - Lô (TAA+Sily): Lô chuột uống TAA với Silymarin Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l ngày 10 tuần Sau đó, cho chuột uống silymarin với liều lƣợng 50 mg/kg ngày tuần Sau kết thúc thời gian gây bệnh điều trị, chuột đƣợc cho nhịn đói qua đêm để hạn chế tác động thức ăn lên tiêu sinh hóa máu Chuột đƣợc gây mê diethyl ether hộp kín với thời gian phút, sau chúng tơi tiến hành lấy máu từ tim chuột vào ống thu máu có chứa chất chống đơng (heparin) Các tiêu sinh hóa mẫu máu: alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), triglyceride (TG) cholesterol tổng số (TC), đƣợc phân tích máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động Khoa sinh hóa, Bệnh viện quân y 175 Sau đó, tiến hành giải phẫu thu nhận gan chuột giữ dung dịch formaline 4% Mẫu gan đƣợc phân tích mơ học phƣơng pháp nhuộm Hemotoxyline Eosin mơn Giải phẩu bệnh, Trung tâm chẩn đốn điều trị ung bƣớu, Bệnh viện quân y 175 12 nhiệt độ đến 45oC (59,00 ± 3,51%) Khi tiếp tục tăng nhiệt độ đến 55oC khả chống oxy hóa dịch chiết khơng đổi (58,62 ± 1,10%, p>0,05) Tƣơng tự, hàm lƣợng polyphenol flavonoid dịch chiết tỏi đen tăng dần gia tăng nhiệt độ thủy phân Cụ thể, hàm lƣợng polyphenol (10,10 ± 0,20 mgGAE/g chất khô) flavonoid (0,57 ± 0,02 mg QE/g chất khô) cùa dịch chiết tỏi đen thủy phân nhiệt độ 35oC cao so mẫu xử lý nhiệt độ 30oC (9,13 ± 0,11 mgGAE/g chất khô 0,41 ± 0,03 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng) Sau đó, hàm lƣợng polyphenol flavonoid đạt giá trị cực đại tỏi đen đƣợc xử lý nhiệt độ 45oC (11,02 ± 0,23 mgGAE/g chất khô 0,69 ± 0,03 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng) Khi nhiệt độ tiếp tục tăng đến 55oC flavonoid dịch chiết tỏi đen không khác biệt thống kê với mẫu xử lý 45oC, hàm lƣợng polyphenol giảm so với mẫu xử lý 45oC Từ kết trên, ta chọn nhiệt độ thủy phân 45oC để tạo dịch chiết tỏi đen giàu hoạt tính chống oxy hóa chất hoạt tính sinh học nhƣ polyphenol flavonoid Sở dĩ nhiệt độ tăng hiệu suất thu đƣợc hàm lƣợng hợp chất polyphenol tăng tăng nhiệt độ, tăng khuếch tán phân tử từ bên bên ngoài, cấu trúc nguyên liệu bị suy yếu nhiệt độ, tạo điều kiện cho việc giải phóng chất từ tế bào nguyên liệu bên Mỗi enzyme lại có khoảng nhiệt độ hoạt động tối ƣu, nhiệt độ dịch hóa dƣới khoảng tối ƣu hoạt tính enzyme giảm, đó, khả trích ly hợp chất polyphenol khả chống oxy hóa dịch chiết ngồi nhiệt độ tối ƣu enzyme giảm Một số nghiên cứu công bố cho thấy mối liên hệ chặt chẽ nhiệt độ dịch hoá với hàm lƣợng polyphenol, flavonoid tổng khả chống oxy hoá dịch trích từ thực vật (Vuong Q.S cộng sự, 2013; Samuagam L cộng sự, 2013) Theo Pan S Wu S (2014), nhiệt độ tối thích cho q trình trích ly polysaccharides hợp chất chống oxy hóa từ tỏi cellulase 45 o C Kết tƣơng đồng với kết chúng tơi, chúng tơi trích ly tỏi đen với nhiệt độ 45 o C hàm lƣợng polyphenol flavonoid tổng số nhƣ khả chống oxy hóa dịch chiết tỏi đen đạt giá trị cực đại (11,02 ± 0,23 mg GAE/g, 0,69 ± 0,03 mgQE/g chất khơ 59,00 ± 3,51%) 22 23 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân sung lên khả chống oxy hóa (A), hàm lƣợng polyphenol (B) flavonoid tổng số (C) dịch chiết tỏi đen trích ly cellulase 3.6 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân lên khả chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol tổng số flavonoid tổng số dịch chiết tỏi đen trích ly cellulase Cũng tƣơng tự nhƣ yếu tố nhiệt độ thời gian trích ly dài hiệu suất trích ly hợp chất phenolic cao, polymer hợp chất phenolic hòa tan vào dung mơi trích ly nhiều (Spigno G cộng sự, 2007) Tuy nhiên, trình khuếch tán đạt đƣợc trạng thái cân hay nói cách khác, nồng độ chất khuếch tán bên nguyên liệu bên ngồi đặt trạng thái cân bằng, không tồn chênh lệch gradient nồng độ Điều dẫn đến trình khuếch tán chậm lại khơng diễn Thời gian trích ly q dài khơng có tác động tích cực cho việc trích ly hợp chất phenolic (Silva E.M cộng sự, 2007) Theo Kankara S.S cộng (2014), thời gian trích ly dài dịch chiết tiếp xúc nhiều với nhiệt độ, ánh sáng, oxy, yếu tố gây phản ứng oxy hóa hợp chất phenol phân hủy enzyme Chúng ta nhận thấy thời gian thủy phân tăng dần khả chống oxy hóa dịch chiết tỏi đen tăng dần tƣơng ứng Cụ thể là, khả chống oyx hóa dịch chiết tỏi đen xử lý (41,62 ± 2,66%) cao so với mẫu không xử lý (22,93 ± 1,62%, p0,05) Thêm vào đó, hàm lƣợng polyphenol dịch chiết tỏi đen tăng dần gia tăng thời gian thủy phân đạt giá trị cực đại thời gian xử lý tăng lên Cụ thể, hàm lƣợng polyphenol (11,00 ± 0,16 mgGAE/g chất khô) cao so mẫu xử lý (9,41 ± 0,08 mgGAE/g chất khô, p