Nghiên Cứu Matrix Metalloproteinase-12 (Mmp-12) Trong Bệnh Phổi Tắc Nghẽn Mạn Tính

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN CƠNG TRUNG NGHIÊN CỨU MATRIX METALLOPROTEINASE-12 (MMP-12) TRONG BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH Chun ngành: Nội Hơ Hấp Mã số: 62.72.01.44 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2021 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN TRÍ PGS.TS HỒNG ANH VŨ Phản biện 1: PGS TS NGƠ Q CHÂU Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN THỊ THU BA Phản biện 3: TS PHẠM HÙNG VÂN Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào 13 30 ngày tháng 10 năm 2021 Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (BPTNMT) nguyên nhân gây tử vong bệnh tật mạn tính tồn giới Tại Việt Nam tỉ lệ mắc bệnh BPTNMT 6,7% [62] Các thuốc thường sử dụng điều trị BPTNMT thuốc giãn phế quản thuốc kháng viêm giúp cải thiện triệu chứng, giảm tần số mức độ nặng đợt cấp, cải thiện sức khỏe Tuy nhiên, nay, chưa có loại thuốc có chứng lâm sàng làm giảm tắc nghẽn tiến triển bệnh Do đó, nhà nghiên cứu ý nhiều đến gen có vai trị chế bệnh sinh dẫn đến BPTNMT [34], nhằm mục đích can thiệp vào gen Gen Matrix Metalloproteinase-12 (MMP-12) nhà nghiên cứu ý nhiều nhất, lí là, gen MMP-12 bị kích hoạt khói thuốc - yếu tố nguy dẫn đến gia tăng sản xuất proteinase MMP-12 gây cân proteinase - antiproteinase dẫn đến thối hóa chất (elastin, collagen) phổi dẫn đến BPTNMT [15], [115], [122] Nghiên cứu Hautamaki (1997) [61] sử dụng chất ức chế gen MMP-12 (MMP-12 inhibitor) chuột cho thấy có hiệu ngăn chặn khí phế thũng khói thuốc Nghiên cứu Churg A (2012) [34] kết luận: can thiệp vào bệnh BPTNMT với chất ức chế gen MMP-12 liệu pháp hữu hiệu cho BPTNMT Nghiên cứu Kraen M (2019) [85] khói thuốc liên quan đến bệnh BPTNMT xơ vữa động mạch cảnh, tác giả kết luận “proteinase MMP-12 MMP-1 dấu sinh học hữu ích lâm sàng, cần có nghiên cứu để làm sáng tỏ vai trò proteinase chúng” Tổ chức GOLD 2020 kết luận gen MMP-12 liên quan đến giảm chức phổi, liên quan đến yếu tố nguy BPTNMT [54] Gen MMP-12 liên quan đến giảm chức phổi, gen MMP-12 bị kích hoạt khói thuốc [54] Tuy nhiên, mối liên quan khói thuốc kích hoạt biểu gen MMP-12 dẫn đến BPTNMT mối liên quan không đồng nhất, mối liên quan biểu gen MMP-12 với biểu lâm sàng chưa rõ ràng; lí là, bệnh học, có nhiều người không hút thuốc mắc bệnh BPTNMT Ngược lại, có nhiều người hút thuốc khơng mắc bệnh BPTNMT Vì vậy, nghiên cứu nhằm tìm kiếm mối liên quan khói thuốc dẫn đến kích hoạt gia tăng biểu gen MMP-12 dẫn đến BPTNMT, tìm kiếm mối liên quan biểu gen MMP-12 với biểu lâm sàng BPTNMT Từ đó, có thêm sở số liệu vấn đề này, để góp phần hiểu rõ gen MMP-12 BPTNMT Mục tiêu nghiên cứu Mô tả đặc điểm dịch tễ, lâm sàng đặc điểm biểu gen MMP-12 tế bào đàm nhóm nghiên cứu Khảo sát mối liên quan khói thuốc với biểu gen MMP-12 dẫn đến BPTNMT nhóm nghiên cứu Đánh giá mối liên quan biểu gen MMP-12 với biểu lâm sàng, với độ nặng bệnh nhóm bệnh nhân BPTNMT Đánh giá mối liên quan biểu gen MMP-12 với dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Tính cấp thiết của đề tài luận án BPTNMT chưa có thuốc điều trị khỏi hẳn, chưa có loại thuốc có chứng lâm sàng làm giảm tắc nghẽn tiến triển bệnh BPTNMT [54] Do đó, nhà nghiên cứu ý nhiều đến gen có vai trị chế bệnh sinh dẫn đến BPTNMT nhằm mục đích can thiệp vào gen [34] Trong số gen có vai trị chế bệnh sinh BPTNMT, gen MMP-12 ý nhiều Tổ chức GOLD 2020 kết luận “gen MMP-12 liên quan đến giảm chức phổi, liên quan đến yếu tố nguy BPTNM” gen MMP-12 bị kích hoạt khói thuốc [54] Vì vậy, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu Matrix Metalloproteinase-12 BPTNMT nhằm tìm kiếm mối liên quan khói thuốc dẫn đến kích hoạt gia tăng biểu gen MMP-12 dẫn đến BPTNMT, tìm kiếm liên quan biểu gen MMP-12 với biểu lâm sàng BPTNMT Từ đó, có thêm sở số liệu vấn đề này, để góp phần hiểu rõ vai trị gen MMP-12 BPTNMT góp phần phòng ngừa điều trị BPTNMT gen MMP-12 Những đóng góp của luận án Góp phần hiểu rõ vai trò gen MMP-12 BPTNMT: ➢ Mức độ biểu gen MMP-12 khác biệt (khơng đồng nhất) nhóm liên quan với BPTNMT / khói thuốc ➢ Biểu gen MMP-12 tăng cao bệnh nhân BPTNMT, cho dù bệnh nhân có hút thuốc hay khơng hút thuốc (p =0,001) ➢ Khói thuốc yếu tố nguy kích hoạt gia tăng biểu gen MMP-12 phổi Ngồi khói thuốc lá, khói bụi, khí độc hại khác…cũng dẫn đến tăng cao biểu gen MMP-12 dẫn đến BPTNMT ➢ Sự tăng cao biểu gen MMP-12 phổi điều kiện cần, mà chưa có điều kiện đủ để dẫn đến BPTNMT ➢ Sự tăng cao biểu gen MMP-12 đàm dấu sinh học có hữu ích tiên đốn bệnh nặng lâm sàng tiên đoán suy giảm FEV1 chức phổi theo thời gian ➢ Biện pháp ngưng hút thuốc biện pháp hữu hiệu làm giảm biểu gen MMP-12 phổi, giúp giảm bớt tình trạng suy giảm chức phổi bệnh nhân BPTNMT ➢ Xét nghiệm đo mức biểu gen MMP-12 đàm giúp phát người có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ (FEF 25-75% < 60%) người hút thuốc dai dẳng Từ đó, có sở để khuyến cáo ngưng hút thuốc người này, giúp góp phần ngăn chặn tắc nghẽn nhỏ sớm tiến triển, giúp góp phần giảm tần suất BPTNMT Bớ cục luận án Luận án có 122 trang, bố cục gồm: mở đầu: trang; tổng quan tài liệu: 34 trang; đối tượng phương pháp nghiên cứu: 17 trang; kết nghiên cứu: 27 trang; bàn luận: 38 trang; kết luận kiến nghị: trang Luận án có 31 bảng, 19 biểu đồ, 15 sơ đồ 155 tài liệu tham khảo, có 11 tài liệu tiếng Việt, 144 tài liệu tiếng Anh, 49 tài liệu năm chiếm tỉ lệ 31% CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa BPTNMT: Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính bệnh thường gặp, bệnh ngăn ngừa điều trị được, đặc tính bệnh triệu chứng hơ hấp tình trạng giới hạn luồng khí dai dẳng bất thường đường dẫn khí / phế nang, thường phơi nhiễm với phân tử độc hại khí độc hại, bị ảnh hưởng yếu tố thể tạng, bao gồm phát triển bất thường phổi Những bệnh đồng mắc nghiêm trọng tác động đến tỉ lệ mắc bệnh tử vong” [54] 1.2 Dịch tễ học: Trên giới có 6-10% dân số người lớn mắc bệnh BPTNMT Tại Việt Nam có 6,7% dân số mắc bệnh BPTNMT [62], [153] 1.3 Yếu tớ nguy cơ: Khói thuốc lá, nhiễm mơi trường nhà, nghề nghiệp, gen, trưởng thành phát triển phổi, giới tính, già hóa dân số, nhiễm khuẩn hô hấp, hen, lao phổi, kinh tế xã hội nghèo nàn, rối loạn dinh dưỡng, bệnh đồng mắc 1.4 Cơ chế bệnh sinh BPTNMT: cân proteinase antiproteinase, viêm dai dẳng, stress oxy hóa, cân miễn dịch, yếu tố gen, giả thuyết cytokine, giả thuyết nhiễm khuẩn, dẫn đến phá hủy chất phổi tái cấu trúc đường dẫn khí dẫn đến BPTNMT [30] (Sơ đồ 1.2) 1.5 Vai trò MMP-12 chế bệnh sinh: khói thuốc kích hoạt gen MMP-12 sản xuất proteinase MMP-12 dẫn đến cân proteinase - antiproteinase, dẫn đến phá vỡ chất phổi (elastin, collagen) dẫn đến BPTNMT giảm chức phổi (Sơ đồ 1.3) 1.6 Khái niệm biểu gen (expression gene): Biểu gen trình chuyển đổi thơng tin di truyền chứa gen thành sản phẩm tế bào sống, trình tổng hợp phân tử chức sinh học phân tử RNA hay protein [36] Khói thuốc phân tử, khí độc hại Đại thực bào Elastase bạch cầu đa nhân trung tính Lão hóa/chết tế bào theo chương trình Vi khuẩn Yếu tố khuếch đại: Viruses Stress oxy hóa Yếu tố gen Vi Chất nhầy Đ khuẩn Biểu mô Kháng thể kháng biểu mô/ elastin ại BC đa nhân thực bào Protease huyết Lympho B Cơ trơn đường dẫn khí Hóa ứng động/ di cư đa nhân trung tính Viêm hệ thống Tế bào trơn đường thở Viêm / tái cấu trúc đường thở Tăng tiết nhầy Tắc nghẽn đường thở CRP, Sơ đồ 1.2: Cơ chế bệnh sinh BPTNMT “Nguồn: Chung K F, 2008” [30] IL-6, TNF-alpha PHÁ HỦY CHẤT NỀN CỦA PHỔI Proline Glycine Proline TUYỂN MỘ CÁC TẾ BÀO Bạch cầu đa nhân Đại thực bào Tế bào biểu mô Tế bào lympho Th1 Tế bào đơn nhân Sơ đồ 1.2: Cơ chế bệnh sinh BPTNMT MMP-12 “Nguồn: Houghton, 2015” [63] 1.7 Mối liên quan chu kì ngưỡng với mức độ biểu gen: Số chu kì ngưỡng thấp mức độ biểu gen cao ngược lại [67] 1.8 Khái niệm tỉ lệ biểu gen: tỉ lệ số lượng gen (số lượng DNA RT-PCR) nhóm mẫu NC -T mơ CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang 2.2 Đối tượng NC: gồm nhóm: (1) nhóm BPTNMT - hút thuốc lá, (2) nhóm BPTNMT - khơng hút thuốc lá, (3) nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc lá, (4) nhóm khơng BPTNMT - không hút thuốc 2.3 Thời gian NC: từ tháng - 2016 đến 12 - 2018 2.4 Địa điểm NC: BV Nguyễn Trãi BV Đại Học Y Dược TPHCM 2.5 Cỡ mẫu NC: công thức so sánh giá trị trung bình biến số (z 1- + z 1-/2 )2 (12 + 22) n= (µ1 - µ2 )2 2.6 Xác định các biến sớ độc lập và biến số phụ thuộc Bảng 2.1: Tên biến số và cách tính các biến số nghiên cứu TÊN BIẾN SỐ Tuổi Giới tính Đối tượng - khơng hút thuốc Đối tượng - hút thuốc Số gói-năm (pack-years) Nhóm BPTNM – khơng hút thuốc Nhóm BPTNMT – hút thuốc Nhóm khơng BPTNMTkhơng hút thuốc (nhóm chứng ) Nhóm khơng BPTNMThút thuốc Nhóm BPTNMT- ngưng hút thuốc Nhóm khơng BPTNMTcó dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Đối tượng BPTNMT- có CÁCH TÍNH BIẾN SỐ Số tuổi = năm nghiên cứu – năm sinh đối tượng Nam, Nữ Đối tượng hồn tồn khơng hút thuốc hút < 100 điếu đời, tính thời điểm vấn [29] Đối tượng hút thuốc ≥ 10 điếu ngày (≥ 0,5 gói/ ngày) thời gian hút thuốc ≥ 35 năm Số gói hút ngày x số năm đối tượng hút Có FEV1/FVC < 0,7 sau thuốc giãn phế quản, có triệu chứng lâm sàng khơng hút thuốc [29], [79] Đối tượng có đủ tiêu chuẩn BPTNMT (theo GOLD 2020), hút thuốc [29], [79] Đối tượng có FEV1/ FVC > 0, sau thuốc giãn phế quản, khơng hút thuốc [29], [79] Đối tượng có FEV1/ FVC > 0, sau thuốc giãn phế quản, hút thuốc [29], [79] Đối tượng có đủ tiêu chuẩn BPTNMT (theo GOLD 2020) ngưng hút thuốc ≥ năm (12 tháng ) Các đối tượng nhóm khơng BPTNMT- hút thuốc, họ có FEF25-75%- dự đốn < 60% (căn theo phế dung kí) Đối tượng có số điểm từ thang điểm mMRC ≥ và/ nhiểu triệu chứng Đối tượng BPTNMT- có nguy cao Đối tượng có đợt cấp nặng phải nhập viện (trong năm vừa qua) điểm CAT ≥ 10 Khi có ≥ đợt cấp vòng 12 tháng qua, đợt cấp phải nhập viện Đối tượng có đợt cấp nặng phải nhập viện vòng 12 tháng trước, đợt cấp nằm viện ≥ ngày (1 tuần) CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ, LÂM SÀNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MMP-12 TRONG TẾ BÀO ĐÀM Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU Nghiên cứu 351 đối tượng gồm có: (1) nhóm BPTNMT- hút thuốc, (2) nhóm BPTNMT- khơng hút thuốc, (3) nhóm khơng BPTNMThút thuốc lá, (4) nhóm khơng BPTNMT- khơng hút thuốc (nhóm chứng) có số đối tượng tương ứng là: 112, 61, 115, 63 3.1.1 Tuổi: nhóm BPTNMT - chung 65,1 ± 8,6; thấp 55 tuổi, cao 93 tuổi 3.1.2 Giới tính: nhóm BPTNMT - chung có 173 đối tượng, đó: nam: n=153 (88,4%); nữ: n=20 (11,6%) Tỉ lệ nam nữ 7,6 lần 3.1.3 Số đối tượng GOLD I, II, III IV: 42 (24,3%), 47 (27,2%), 48 (27,7%), 36 (20,8%) 3.1.4 Số gói thuốc-năm (pack-years): Nhóm GOLD I, II, III, IV là: 28,62 ± 15,08; 45,11 ± 22,15; 48,30 ± 18,10; 56,13 ± 15,33; p = 0,032, r =0,231, p*=0,006 Nhóm BPTNM - hút thuốc so với nhóm khơng BPTNMT- hút thuốc 50,65 ± 16,75 46,57 ± 19,62, p=0,093 3.1.5 Giá trị trung bình các thơng sớ hơ hấp Nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc có FEV1/FVC = 0,72 ± 0,10; giá trị gần trị số mắc bệnh BPTNMT có FEF 25-75% - dự đốn 0,49 ± 0,12 cho thấy nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ 3.1.6 Tỉ lệ đới tượng - có dấu hiệu sớm của tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ: Nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc có 75 đối tượng có dấu hiệu sớm tắc nghẽn, chiếm tỉ lệ 65,2% (75/115) Nhóm khơng BPTNMT khơng hút thuốc có đối tượng chiếm tỉ lệ 9,5% (6/63) 3.1.7 Số đối tượng nhóm A, B, C, D; nhiều triệu chứng; nguy cao: Nhóm A, B, C, D 27 (15,6%), 29 (16,8%), 51 (29,5%), 66 (38,1%); nhóm BPTNMT - nhiều triệu chứng 95 (54,9%) Nhóm BPTNMT- nguy cao 117 (67,6%) 3.1.8 Đặc điểm biểu gen MMP-12 nhóm nghiên cứu Bảng 3.9: Đặc điểm biểu gen MMP-12 nhóm nghiên cứu Sớ chu kì ngưỡng (CT) gen MMP12 Sớ chu kì ngưỡng (CT) gen β-actin Nhóm BPTNMT hút th́c (n=112) 29,99 ±1,16 22,38 ±0,91 7,61 ±1,10 2-7,61 Nhóm BPTNMTkhơng hút (n=61) 30,31 ±1,12 22,49 ±0,77 7,81 ±1,11 -7,81 30,28 ±0,96 22,27 ±1,14 7,86 ±1,02 2-7,86 31,51 ±0,62 22,04 ±1,03 9,47 ±1,08 2-9,47 CÁC NHĨM NGHIÊN CỨU Nhóm khơng BPTNMT hút th́c (n=115) Nhóm khơng BPTNMT - khơng hút th́c (n=63) Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 chuẩn hóa (ΔCT) 2-∆CT p∂ p p*= 0,371 0,001 p**= 0,001 SỐ CHU KÌ NGƯỠNG GEN MMP-12 CHUẨN HĨA (ΔCT) Bảng 3.9 cho thấy biểu gen MMP-12 đàm từ cao xuống thấp là: nhóm BPTNMT- hút thuốc > nhóm BPTNMT- khơng hút thuốc > nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc > nhóm khơng BPTNMT khơng hút thuốc Tương ứng với số chu kì ngưỡng là: 7,61±1,10; 7,81±1,11; 7,86±1,02; 9,47±1,08, p = 0,001 Mức độ biểu gen MMP-12 đàm nhóm nghiên cứu khơng đồng nhất, trình bày Biểu đồ 3.1 p= 0,001 Nhóm khơng Nhóm BPTNMT- Nhóm BPTNMTkhơng hút thuốc hút thuốc ΔCT=7,81±1,11 BPTNMT hút thuốc Nhóm khơng BPTNMT Khơng hút thuốc ΔCT=9,47±1,08 ΔCT=7,86±1,02 ΔCT=7,61±1,10 NHĨM BPTNMT- HÚT THUỐC NHĨM KHƠNG BPTNMT - HÚT THUỐC NHĨM BPTNMT- KHƠNG HÚT THUỐC NHĨM KHÔNG BPTNMT - KHÔNG HÚT THUỐC MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN MMP-12 Ở NHÓM NGHIÊN CỨU Biểu đồ 3.1: Đặc điểm biểu gen MMP-12 Trong tế bào đàm nhóm nghiên cứu 11 Bảng 3.13 cho thấy biểu gen nhóm BPTNMT- hút thuốc so với nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc, khơng có ý nghĩa thống kê, p = 0,077 3.2.6 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - hút thuốc so với nhóm BPTNMT- không hút thuốc Bảng 3.15: So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT hút thuốc so với nhóm BPTNMT - khơng hút thuốc NHĨM NGHIÊN CỨU Sớ chu kì ngưỡng gen MMP12 Sớ chu kì ngưỡng gen β-actin Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 chuẩn hóa Nhóm BPTNMThút th́c (n=112) 29,99 ±1,16 22,38 ±0,91 7,61 ±1,10 2-7,61 Nhóm BPTNMTkhơng hút (n=61) 30,31 ±1,12 22,49 ±0,77 7,81 ±1,11 2-7,81 -∆CT Tỉ lệ biểu gen 2-∆∆CT p 1,15 0,371 Bảng 3.15 cho thấy biểu gen nhóm BPTNMT - hút thuốc khơng khác biệt so với nhóm BPTNMT - khơng hút thuốc, p=0,371 3.2.7 So sánh biểu gen MMP-12 nhóm khơng BPTNMT- hút th́c so với nhóm khơng BPTNMT- không hút thuốc Bảng 3.16: So sánh biểu gen MMP-12 nhóm khơng BPTNMT- hút thuốc so với nhóm khơng BPTNMT - khơng hút thuốc NHĨM NGHIÊN CỨU Nhóm khơng BPTNMT hút th́c (n=115) Nhóm khơng BPTNMT- khơng hút th́c (n=63) Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 Sớ chu kì ngưỡng gen β-actin Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 chuẩn hóa 2-∆CT 30,28 ±0.96 22,27 ±1,14 7,86 ±1,02 2-7,86 31,51 ±0,62 22,04 ±1,03 9,47 ±1,08 -9,47 Tỉ lệ biểu gen 2-∆∆CT p 3,05 0,0001 Bảng 3.16: Biểu gen nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc cao so với nhóm khơng BPTNMT - khơng hút thuốc 3,05 lần, p= 0,0001 3.3 ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BIỂU HIỆN GEN MMP-12 VỚI BIỂU HIỆN LÂM SÀNG, VÀ VỚI ĐỘ NẶNG CỦA BỆNH Ở NHÓM BN BPTNMT 3.3.1 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - cịn hút th́c so với BPTNMT- ngưng hút thuốc Bảng 3.18: So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMTcịn hút thuốc so với BPTNMT- ngưng hút thuốc 12 NHÓM BPTNMT - HÚT THUỐC (n=112) Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 Sớ chu kì ngưỡng gen β-actin Nhóm BPTNMT- cịn hút th́c (n=61) Nhóm BPTNMT- ngưng hút thuốc (n=51) 29,05 ±0,88 30,69 ±1,02 22,19 ±0,79 22,50 ±0,86 Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 chuẩn hóa 6,86 ±0,92 8,19 ±0,98 2-∆CT Tỉ lệ biểu gen 2-∆∆CT p 2,51 0,001 2-6,86 2-8,19 Bảng 3.18 cho thấy mức độ biểu gen nhóm BPTNM - hút thuốc cao so với BPTNMT- ngưng hút thuốc 2,51 lần, p= 0,001 3.3.2 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 GOLD I, II, III, IV Bảng 3.19: So sánh biểu gen MMP-12 nhóm GOLD I, II, III, IV NHĨM BPTNMT (n=173) Nhóm GOLD I (n=42) Nhóm GOLD II (n=47) Nhóm GOLD III (n=48) Nhóm GOLD IV (n=36) Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 31,11 ± 0,78 30,76 ± 0,78 29,92 ± 0,81 28,57 ± 0,28 Sớ chu kì ngưỡng gen β - actin 22,60 ± 0,92 22,59 ± 0,91 22,39 ± 0,94 22,07 ± 0,55 Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 chuẩn hóa 8,51 ± 0,93 8,17 ±0,86 7,53 ±0,89 6,50 ± 0,50 2-∆CT p 2-8,51 2-8,17 2-7,53 -6,50 p = 0,005 r = 0,631, p*=0,001 Bảng 3.19 cho thấy biểu gen MMP-12 từ cao xuống thấp là: nhóm GOLD IV > III > II > I, p = 0,005; tương quan r=0,631, p=0,001 3.3.3 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT- nguy cao so với nhóm BPTNMT- nguy thấp Bảng 3.22: So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - nguy cao so với nhóm BPTNMT - nguy thấp NHĨM BPTNMT (n=173) Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 Sớ chu kì ngưỡng gen β-actin Sớ chu kì ngưỡng gen MMP-12 chuẩn hóa 2-∆CT Nhóm BPTNMTnguy cao (n=117) 29,66 ±1,07 22,33 ±0,83 7,32 ±1,01 2-7,32 Nhóm BPTNM nguy thấp (n=56) 30,05 ± 0,75 22,60 ±0,91 8,44 ±0,88 -8,44 Tỉ lệ biểu gen 2-∆∆CT p 2,17 0,001 Bảng 3.22 cho thấy biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - nguy 13 cao cao so với BPTNMT - nguy thấp, 2,17 lần, p=0,001 3.4 ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BIỂU HIỆN GEN MMP-12 VỚI DẤU HIỆU SỚM CỦA TẮC NGHẼN ĐƯỜNG DẪN KHÍ NHỎ 3.4.1 So sánh biểu gen MMP-12 nhóm khơng BPTNMT- có dấu hiệu sớm của tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ (FEF25-75%- dự đoán (2) nhóm BPTNMT- khơng hút thuốc > (3) nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc > (4) nhóm khơng BPTNMT không hút thuốc, p=0,001 cho thấy mức độ biểu gen MMP-12 đàm không đồng nhóm, liên quan với bệnh lí BPTNMT / khói thuốc Kết nghiên cứu chúng tơi tương tự: (1) Nghiên cứu Peng Qu (2009) [107] cho thấy biểu gen MMP-12 từ cao xuống thấp là: nhóm BPTNMT- hút thuốc > nhóm BPTNMT- khơng hút thuốc > nhóm khỏe- khơng hút thuốc (nhóm chứng), (2) nghiên cứu Gilowska (2019) cho thấy nồng độ MMP-12 nhóm BPTNMT cao so với nhóm không BPTNMT- chung 2,06 lần, p < 0,0001 4.2 KHẢO SÁT MỐI LIÊN QUAN GIỮA KHÓI THUỐC LÁ VỚI BIỂU HIỆN GEN MMP-12 DẪN ĐẾN BPTNMT 4.2.1 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMTchung so với nhóm khơng BPTNMT - chung 16 Nhóm BPTNMT - chung có biểu gen MMP-12 cao so với nhóm khơng BPTNMT - chung 1,95 lần, p = 0,001 (Bảng 3.10); cho thấy biểu gen MMP-12 tăng cao người mắc bệnh BPTNMT so với người khỏe mạnh / không BPTNMT Biểu gen MMP-12 tăng cao phổi BN BPTNMT sở để góp phần giải thích tình trạng viêm, tắc nghẽn mạn tính tiến triển Ở nước, chưa thấy nghiên cứu biểu gen MMP-12 BPTNMT để so sánh Ở nước ngoài, nay, nghiên cứu kết luận có tăng cao biểu gen MMP-12 / proteinase MMP-12 người bệnh BPTNMT người khỏe- có hút thuốc dai dẳng Đáng ý là, đến nay, hầu hết nghiên cứu nước MMP-12 nghiên cứu lúc nhiều loại gen có liên quan đến chế bệnh sinh cân proteinase - antiproteinase Các tác giả nước thường nghiên cứu gen sản xuất proteinase gen MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-12 lúc với gen sản xuất antiproteinase gen TMP1, 2, 3, 4, α1- Antitrypsin…và thường thiết kế Realtime RT-PCR với định lượng tuyệt đối Bước đầu, điều kiện Phòng Y Sinh Học Phân Tử ĐHYD, nên thực nghiên cứu loại gen MMP-12 (nghiên cứu loại gen MMP-12 định lượng tương đối hạn chế đề tài này) Kết nghiên cứu tương tự với nghiên cứu: (1) nghiên cứu tác giả Annelie (2016) [14] cho thấy nồng độ MMP -12 nhóm BPTNMT cao so với nhóm chứng, p= 0,005, (2) nghiên cứu Aggarwal (2017) [127] cho thấy nồng độ MMP-12 nhóm BPTNMT cao so với nhóm chứng, p< 0,001, (3) nghiên cứu Wengdong (2019) [137] cho thấy biểu mRNA MMP-12 BPTNMT cao so với nhóm chứng, p= 0,0067, (4) nghiên cứu Gilowska (2019) [51] cho thấy nồng độ MMP-12 nhóm BPTNMT cao so với nhóm chứng, p< 0,0001, (9) nghiên cứu Kraen (2019) [85] cho thấy nồng độ MMP-12 nhóm BPTNMT cao so với nhóm chứng, p< 0,0001 Tuy nhiên, lâm sàng, gia tăng biểu gen MMP-12 đàm gặp các trạng thái bệnh lí đường hơ hấp như: 17 hen [104], ung thư tuyến phổi, ung thư tế bào vẫy phổi [107],… người hút thuốc dai dẳng [115], [143] Vì vậy, tăng cao biểu gen MMP-12 đàm sở để hướng tới chẩn đoán BPTNMT cần chẩn đoán phân biệt với bệnh lí khác có gia tăng biểu gen MMP-12 Nói cách khác, tăng cao biểu gen MMP12 đàm điều kiện cần chẩn đoán BPTNMT, chưa điều kiện đủ để kết luận đối tượng mắc bệnh BPTNMT 4.2.2 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - hút thuốc so với nhóm không BPTNMT - không hút thuốc (nhóm chứng) Kết nghiên cứu cho thấy biểu gen nhóm BPTNMT - hút thuốc cao so với nhóm khơng BPTNMT - không hút thuốc 3,63 lần, p=0,0001 (Bảng 3.11), cho thấy BPTNMT ln có tăng cao biểu gen MMP-12 đàm, đặc biệt nhóm BPTNMT - hút thuốc có biểu gen MMP-12 cao (Bảng 3.9) Điều này, cho thấy gen MMP-12 có vai trò liên quan đến BPTNMT cho thấy yếu tố nguy khói thuốc có liên quan mức độ biểu gen MMP-12 Kết nghiên cứu tương tự với kết nghiên cứu tác giả nước ngồi, mà chúng tơi vừa trình bày Mục 4.2.1 4.2.3 So sánh biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT- khơng hút th́c so với nhóm khơng BPTNMT - không hút thuốc (nhóm chứng) Mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - khơng hút thuốc cao so với nhóm khơng BPTNMT - khơng hút thuốc (nhóm chứng) 3,16 lần, p = 0,001 (Bảng 3.12), cho thấy biểu gen MMP-12 tăng cao BPTNMT- không hút thuốc BPTNMT- hút thuốc (kết hợp Bảng 3.11 3.12) Kết góp phần giải thích tình trạng có người khơng hút thuốc mắc bệnh BPTNMT Lí là, người BPTNMT- không hút thuốc có gia tăng biểu gen MMP-12 phổi dẫn đến phá hủy chất phế nang (elastin, collagen), đường dẫn khí nhỏ dẫn đến BPTNMT Kết biểu gen MMP-12 tăng cao nhóm BPTNMT không hút thuốc cho thấy bên cạnh yếu tố nguy khói thuốc lá, cịn có yếu tố nguy khác như: khói bụi, phân tử độc hại, khí độc 18 hại…đã tương tác với yếu tố gen, biến thể gen thể dẫn đến kích hoạt gia tăng biểu gen MMP-12 đàm 4.2.4 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm không BPTNMT - hút thuốc lá so với nhóm không BPTNMT - không hút thuốc lá (nhóm chứng) Mức độ biểu gen nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc cao so với nhóm khơng BPTNMT - khơng hút thuốc (nhóm chứng) 3,05 lần, p= 0,001 (Bảng 3.16), cho thấy biểu gen MMP-12 tăng cao đối tượng hút thuốc dai dẳng Mặc dù, đối tượng người khỏe mạnh (chưa BPTNMT), đối tượng hút thuốc dai dẳng dẫn đến tăng cao biểu gen MMP-12 phổi dẫn đến viêm mạn tính, tái cấu trúc đường thở dẫn đến BPTNM Kết sở để khuyên cáo người hút thuốc ngưng hút thuốc Kết nghiên cứu cho thấy vai trò khói thuốc BPTNMT Bước đầu, khói thuốc kích hoạt đại thực bào, tế bào trơn, nguyên bào sợi dẫn đến gia tăng biểu gen MMP-12 đường dẫn khí nhỏ Từ đó, dẫn đến tình trạng tắc nghẽn sớm đường dẫn khí nhỏ (FEF 2575% -dự đoán< 0,6) dẫn đến BPTNMT Kết nghiên cứu tương tự :(1) Nghiên cứu Woodruff (2005) [143], (2) Nghiên cứu Demedts (2006), (3) Nghiên cứu Ilumets (2007) [68] cho thấy nồng độ proteinase MMP-12 nhóm khỏe - hút thuốc tăng cao so với nhóm khỏe - khơng hút thuốc, p < 0,04 Có khả đối tượng nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc bị phơi nhiễm khói thuốc thời gian dài, Vì vậy, họ có FEF 25-75% = 0,49±0,12 FEV1/FVC= 0,72±0,10 (Bảng 3.5) cho thấy nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Tóm lại, kết mức biểu gen MMP-12 nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc tăng cao so với nhóm khơng BPTNMT - khơng hút thuốc (nhóm chứng) 3,05 lần, p= 0,001 cho thấy khói thuốc tác nhân kích hoạt tế bào dẫn đến gia tăng biểu gen MMP-12 phổi 4.2.5 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - hút thuốc so với nhóm khơng BPTNMT - hút th́c Cả nhóm thuộc nhóm có hút thuốc Kết nghiên 19 cứu cho thấy biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT- hút thuốc khơng khác biệt so với nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc, p = 0,077 (Bảng 3.13) Kết cho thấy khói thuốc yếu tố nguy dẫn đến gia tăng biểu gen MMP-12 phổi, chứng nhóm đối tượng có tăng cao biểu gen MMP-12 phổi Tuy nhiên, nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc nghiên cứu chưa mắc bệnh BPTNMT (có FEV1/FVC= 0,72±1,10) Kết cho thấy có khả là, gia tăng biểu gen MMP-12 phổi người hút thuốc chưa đủ điều kiện bệnh sinh dẫn đến BPTNMT Mặc dù, nhóm BPTNMT- hút thuốc nhóm khơng BPTNMT hút thuốc có gia tăng biểu MMP-12, p GOLD III > GOLD II > GOLD I, p = 0,005 Mức độ biểu gen MMP-12 đàm tương quan thuận với mức độ tắc nghẽn GOLD I, II, III, IV, r = 0,631, p = 0,001 Như vậy, kết cho thấy biểu gen MMP-12 tế bào đàm cao tương ứng với giai đoạn tắc nghẽn (GOLD) nặng Kết nghiên cứu tương tự với kết nghiên Chaudhuiri (2012) [115] cho thấy nồng độ MMP-12 hoạt tính gen MMP-12 tế bào đàm BN BPTNMT có liên quan trực tiếp với mức độ nặng bệnh khí thũng (được đo CT Scan) Như vậy, xét nghiệm đo mức độ biểu gen MMP-12 đàm tiên đốn giai đoạn nặng tắc nghẽn (GOLD), kiểu hình lâm sàng, nhằm góp phần giúp điều trị BPTNMT tốt 4.3.3 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT nhiều triệu chứng so với nhóm BPTNMT - triệu chứng Kết nghiên cứu cho thấy mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - nhiều triệu cao so với nhóm BPTNMT - triệu chứng 2,53 lần, p = 0,001 (Bảng 3.21), Như vậy, biểu gen MMP-12 tăng cao đàm nhóm BPTNMT- nhiều triệu chứng dấu hiệu có ích lâm sàng Có thể là, xét nghiệm đo mức độ biểu gen MMP-12 tế bào đàm để giúp tiên đoán mức độ triệu chứng BN BPTNMT để góp phần điều trị BPTNMT tốt 4.3.4 So sánh mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - nguy cao so với nhóm BPTNMT - nguy thấp Mức độ biểu gen MMP-12 nhóm BPTNMT - nguy cao tăng cao so với nhóm BPTNMT- nguy thấp 2,17 lần, p = 0,001 (Bảng 3.22) Như vậy, biểu gen MMP-12 tăng cao đàm nhóm BPTNMT- nguy cao dấu hiệu có ích lâm sàng Có thể là, xét nghiệm đo mức độ biểu gen MMP-12 đàm để giúp tiên đoán mức độ nguy bệnh nhân BPTNMT Từ góp phần cho điều trị BPTNMT tốt 22 4.4 ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BIỂU HIỆN GEN MMP-12 VỚI DẤU HIỆU SỚM CỦA TẮC NGHẼN ĐƯỜNG DẪN KHÍ NHỎ Kết nghiên cứu cho thấy mức độ biểu gen MMP-12 nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc - có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ (< 2mm) cao so với nhóm khơng BPTNMT - hút thuốc - khơng có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ 1,87 lần, p = 0,001 (Bảng 3.25) Điều cho thấy gen MMP-12 liên quan với dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Kết nghiên cứu cho thấy mức độ biểu gen MMP-12 tăng cao nhóm đối tượng – có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ, có tương quan thuận biểu gen MMP-12 với mức độ tắc nghẽn nhỏ sớm, r = 0,524, p= 0,001 (Bảng 3.24) Kết cho thấy xem MMP-12 dấu sinh học, hữu ích lâm sàng Có thể là, xét nghiệm Realtime RT- PCR đo mức độ biểu gen MMP-12 đàm người khỏe - hút thuốc để giúp phát đối tượng - có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Từ đó, góp phần với kết phế dung kí việc chẩn đốn đối tượng có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ người hút thuốc dai dẳng, góp phần chẩn đốn sớm bệnh nhân BPTNMT sở để khuyến cáo ngưng hút thuốc người khỏe - hút thuốc có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Từ đó, giúp giảm tần suất BPTNMT Tuy nhiên, nghiên cứu nghiên cứu bước đầu với quy mơ nhỏ, cần có nhiều nghiên cứu thêm với quy mô lớn, để làm sáng tỏ mối liên quan mức độ biểu gen MMP-12 với mức độ tắc nghẽn nhỏ sớm người khỏe - hút thuốc dai dẳng KẾT LUẬN Nghiên cứu vai trò biểu gen Matrix Metalloproteinase-12 (MMP-12) bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính thực 351 đối tượng, phương pháp Realtime RT- PCR với định lượng gen tương đối, kĩ thuật phát SYBR Green Chúng tơi có kết luận sau: 23 Biểu gen MMP-12 tìm thấy mẫu đàm kích thích tất đối tượng nhóm nghiên cứu Mức độ biểu gen MMP-12 khác biệt (khơng đồng nhất) nhóm nghiên cứu liên quan với bệnh lí BPTNMT / tình trạng hút thuốc Mức độ biểu gen MMP-12 đàm từ cao xuống thấp theo thứ tự là: nhóm BPTNMT- hút thuốc > nhóm BPTNMT- khơng hút thuốc > nhóm khơng BPTNMT- hút thuốc > nhóm khơng BPTNMT-khơng hút thuốc, p=0,001 Phơi nhiễm khói thuốc yếu tố nguy kích hoạt gia tăng biểu gen MMP-12 đàm Mối liên quan khói thuốc dẫn đến tăng cao biểu gen MMP-12 phổi rõ ràng Tuy nhiên, tăng cao biểu gen MMP-12 đàm chưa đủ điều kiện bệnh sinh để dẫn đến BPTNMT Nói cách khác, tăng cao biểu gen MMP-12 đàm không đủ tiêu chuẩn để kết luận đối tượng mắc bệnh BPTNMT Mức độ biểu gen MMP-12 đàm có mối liên quan thuận với mức độ nặng bệnh nhân BPTNMT lâm sàng Mức độ biểu gen MMP-12 đàm cao, tương ứng với mức độ tắc nghẽn đường dẫn khí nặng nguy nặng bệnh cao Sự tăng cao biểu gen MMP-12 đàm dấu sinh học hữu ích lâm sàng tiên đốn bệnh nặng tiên đoán suy giảm FEV1 chức phổi theo thời gian Biện pháp ngưng hút thuốc biện pháp hữu hiệu làm giảm biểu gen MMP-12 phổi, giúp giảm bớt tình trạng suy giảm chức phổi BPTNMT Xét nghiệm đo mức biểu gen MMP-12 đàm giúp phát người có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ người hút thuốc dai dẳng Từ đó, có sở để khuyến cáo ngưng hút thuốc người (người hút thuốc có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ), góp phần ngăn chặn tắc nghẽn nhỏ sớm tiến triển, góp phần giảm tần suất BPTNMT 24 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu vai trò Matrix Metalloproteinase 12 (MMP-12) BPTNMT xét nghiệm Trung Tâm Y Sinh Học Phân Tử ĐHYD TPHCM bước đầu, quy mô nhỏ, cần có nghiên cứu lớn Dựa theo kết nghiên cứu, kiến nghị Xem xét xét nghiệm đo mức biểu gen MMP-12 đàm người hút thuốc dai dẳng để phát người có dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ Từ đó, có sở để khuyến cáo người đến khám bệnh hơ hấp định kì, nhằm giúp phát sớm bệnh nhân BPTNMT, có sở để khuyến cáo ngưng hút thuốc người này, giúp giảm tần suất BPTNMT Xem xét xét nghiệm đo mức biểu gen MMP-12 đàm bệnh nhân BPTNMT để tiên đoán mức độ tắc nghẽn, mức độ nguy mức độ triệu chứng bệnh nhân BPTNMT, nhằm góp phần cho điều trị bệnh nhân BPTNMT tốt Khuyến cáo ngừng hút thuốc bệnh nhân BPTNMT nhằm hạn chế biểu gen MMP-12 phổi, hạn chế tắc nghẽn tiến triển mạn tính bệnh nhân BPTNMT, giúp giảm mức độ nặng bệnh lâm sàng Khuyến cáo ngừng hút thuốc người khoẻ mạnh - hút thuốc nhằm phòng ngừa dấu hiệu sớm tắc nghẽn đường dẫn khí nhỏ phổi Từ đó, giúp giảm tần suất BPTNMT Nghiên cứu biểu gen gen sản xuất antiproteinase (các gen TIMP1,2,3,4, gen alpha - antitrypsin) nhóm đối tượng có tăng cao biểu gen MMP-12 đàm (nhóm BPTNMT nhóm khỏe - hút thuốc lá), để góp phần hiểu rõ cân proteinase - antiproteinase nhóm hiểu rõ vai trò gen MMP-12 BPTNMT DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Cơng Trung, Hồng Anh Vũ, Nguyễn Thế Vinh (2018), “Xây dựng quy trình kỹ thuật Realtime PCR để khảo sát biểu gen MMP-12 tế bào thu từ mẫu đàm bệnh nhân bị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 22 (2), tr 47-53 Nguyễn Cơng Trung, Nguyễn Văn Trí, Lê Thị Tuyết Lan, Hồng Anh Vũ, Nguyễn Thế Vinh (2018), “Gia tăng biểu gen MMP12 tế bào từ mẫu đàm bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính người cao tuổi”, Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 22 (2), tr 86-92 ... gen MMP-12 với mức độ tắc nghẽn nhỏ sớm người khỏe - hút thuốc dai dẳng KẾT LUẬN Nghiên cứu vai trò biểu gen Matrix Metalloproteinase-12 (MMP-12) bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính thực 351 đối tượng,... giảm tắc nghẽn tiến triển bệnh Do đó, nhà nghiên cứu ý nhiều đến gen có vai trị chế bệnh sinh dẫn đến BPTNMT [34], nhằm mục đích can thiệp vào gen Gen Matrix Metalloproteinase-12 (MMP-12) nhà nghiên. .. 31% CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa BPTNMT: Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính bệnh thường gặp, bệnh ngăn ngừa điều trị được, đặc tính bệnh triệu chứng hơ hấp tình trạng giới hạn luồng khí