Nghiên cứu ứng dụng nấm men xử lý phế liệu tôm

Tôm và ph ph m ch bi n tôm

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, năm 2021, diện tích nuôi tôm đạt 747 nghìn ha, bao gồm 626 nghìn ha nuôi tôm sú và 121 nghìn ha nuôi tôm thẻ chân trắng Sản lượng tôm nuôi đạt 970 nghìn tấn, tăng 4,3% so với năm 2020, trong đó tôm sú chiếm 265 nghìn tấn và tôm thẻ chân trắng 655 nghìn tấn Kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2021 đạt 3,9 tỷ USD, tăng 5,4% so với năm trước Dự kiến năm 2022, ngành thủy sản sẽ xuất khẩu khoảng 260-270 nghìn con tôm bột, trong đó tôm thẻ chân trắng 200-210 nghìn con và tôm sú 60 nghìn con; tôm giống khoảng 140-150 triệu con, với tôm thẻ chân trắng 100-110 triệu con và tôm sú 30-40 triệu con.

Diện tích nuôi tôm đạt 750 nghìn ha với tổng sản lượng tôm các loại đạt 980 nghìn tấn Trong đó, tôm sú chiếm 275 nghìn tấn, tôm thẻ chân trắng đạt 675 nghìn tấn, còn lại là các loại tôm khác Kim ngạch xuất khẩu tôm đạt 4 tỷ USD.

Theo Bộ Công Thương Việt Nam, sản lượng tôm xuất khẩu đạt khoảng 325 nghìn tấn/năm vào năm 2019, với tỷ lệ tôm chế biến đông lạnh chiếm từ 34-45% và tôm nguyên liệu chiếm 10-15% Ngành tôm đang tăng trưởng nhanh chóng, dự báo sản lượng tôm có thể tăng lên 450 nghìn tấn vào năm 2025, với tổng sản lượng hàng ngày đạt hơn 1.000 tấn trong bối cảnh chuyển đổi sản xuất.

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2018, sản lượng nuôi trồng tôm đạt 766 nghìn tấn, với giá trị xuất khẩu đạt 3,55 tỷ USD Trong đó, tổng lượng sản phẩm tôm đạt từ 250-350 nghìn tấn Dự kiến, trong giai đoạn 2021-2025, sản lượng nuôi trồng tôm sẽ đạt 1,1 triệu tấn, và Chính phủ kỳ vọng giá trị xuất khẩu đạt 10 tỷ USD, với lượng sản phẩm tôm dự kiến từ 400-500 nghìn tấn.

Trên th gi i, kho ng 4 tri u t n tôm đ c khai thác và ch bi n (s li u n m

Trong quá trình sản xuất tôm, đặc biệt là tôm đông lạnh, phần chế biến tôm như đầu, vỏ, đuôi và chân chiếm từ 48-56% khối lượng tôm thải bỏ Việc xử lý phần chế biến này không đúng cách có nguy cơ cao gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng do các hợp chất phân giải bởi vi sinh vật Do đó, việc tập trung vào nghiên cứu các phương pháp chế biến tôm hiệu quả là rất cần thiết.

4 ngành ch bi n th y h i s n t o ra nh ng s n ph m có giá tr gia t ng đã và đang thu hút các nhà khoa h c Vi t Nam và trên th gi i.

Ngu n: V c, “Th y s n Vi t Nam,” 20 03 2022 [Tr c tuy n] Available: https://thuysanvietnam.com.vn/bot - dau - tom - nguyen - lieu - thuc - an - tu - phu - phe - pham - tom -su/

Phẩm phẩm tôm chứa từ 20-40% protein, 20-50% canxi carbonate, 15-40% chitin, các hợp chất màu và lipid Đây là nguồn tài nguyên phong phú cho các hợp chất sinh học như protein, chitin và các hợp chất màu Canxi carbonate từ phẩm phẩm tôm có thể được thu nhận và chuyển đổi thành canxi oxit, được sử dụng trong quá trình xử lý nhiệt và làm chất kháng khuẩn, kháng nấm, cũng như làm chất xúc tác cho sản xuất dầu diesel sinh học Protein trong phẩm phẩm tôm được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất dịch thủy phân protein với các hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính liên kết sắt và hoạt tính liên kết đạm Nhiều nghiên cứu cũng đã công bố về chitin từ phẩm phẩm tôm.

Chitin t ph ph m tôm

Thu nh n chitin t v tôm b ng ph ng pháp hóa h c

Loại khoáng là quá trình loại bỏ khoáng chất trong tôm, chủ yếu là canxi carbonate, bằng các axit như sulfuric, hydrochloric, acetic, nitric và formic Trong số các axit này, hydrochloric acid (HCl) được sử dụng phổ biến nhất Điều kiện loại khoáng thường áp dụng là nồng độ HCl từ 0,25-2M, nhiệt độ gần 100°C, và thời gian xử lý từ 0,5-48 giờ Phản ứng của hydrochloric acid với canxi carbonate (dạng rắn) tạo thành canxi clorua tan trong dung dịch và giải phóng khí CO2.

Loại protein là quá trình phá vỡ liên kết hóa học giữa protein và chitin bằng cách sử dụng base Quá trình này rất quan trọng vì protein có thể gây dị ứng cho con người Thông thường, dung dịch NaOH với nồng độ từ 0,125-5,0 M được sử dụng để loại protein trong tôm dưới điều kiện nhiệt độ 60-100°C, thời gian xử lý từ 1-72 giờ Tuy nhiên, NaOH không chỉ loại bỏ protein mà còn deacetyl hóa chitin, dẫn đến việc kiểm soát mức độ acetyl hóa của chitin trở nên khó khăn.

Trong v tôm có ch a h p ch t màu, đi n hình là carotenoid v i hàm l ng 24-50 àg/g ph ph m tụm [29, 30] Do đú, trong quỏ trỡnh thu nh n chitin t ph

Quá trình chiết xuất chitin không màu từ phế phẩm tôm thường sử dụng các dung môi như hexane, acetone, natri hypochlorite và hydrogen peroxide Những dung môi này giúp thu được chitin có chất lượng cao và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.

Chitin có thể được chiết xuất bằng phương pháp lý hóa học nhiệt độ cao, với hàm lượng khoáng và protein đạt từ 70-80% Hiệu quả khử khoáng và khử protein có thể đạt đến 98-100% khi xử lý ở nhiệt độ cao (50-90°C) trong thời gian dài (lên tới 24 giờ) hoặc trong môi trường có nồng độ acid/kiềm cao (1-2M).

B ng 1.1 Hi u qu kh khoáng và kh protein trên ph ph m tôm s d ng ph ng pháp hóa h c i u ki n x lý Hi u qu kh khoáng

HCl 0,25 M, t l 1:25 (g/ml), 2 gi , nhi t đ phòng

NaOH 0,5 M, t l 1:25 (g/ml), 2 gi , nhi t đ phòng

HCl 0,55M, t l 1:10 (g/ml), 15 phút, nhi t đ phòng

NaOH 0,75M, t l 1:2,25 (g/ml), 24 gi , nhi t đ phòng

HCl 1,1 M, t l 1:10 (g/ml), 6 gi , nhi t đ phòng

HCl 0,5 M, t l 1:10 (g/ml), 90 phút, nhi t đ phòng

Phương pháp hóa học hiệu quả trong việc xử lý khoáng và protein từ chitin thu được từ vỏ tôm có thể thay đổi tính chất hóa lý, bao gồm acetyl hóa, depolymer hóa và hoạt tính sinh học của chitin Tuy nhiên, việc xử lý ở nhiệt độ và áp suất cao trong thời gian dài có thể làm tăng nguy cơ ô nhiễm môi trường do hóa chất sử dụng Do đó, cần chú ý đến các yếu tố này khi áp dụng phương pháp này.

Quá trình xử lý hóa học chitin trong công nghiệp yêu cầu tạo ra môi trường an toàn và có thể làm tăng chi phí sản xuất Bên cạnh đó, protein thu được từ phương pháp này có giá trị thấp và thậm chí không thể sử dụng trong thực phẩm chăn nuôi.

Thu nh n chitin t v tôm b ng ph ng pháp hóa sinh

Trong phương pháp hóa sinh, protease là enzyme phân giải protein, được sử dụng để thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm Nhiều loại protease như papain, trypsin, pepsin, devolvase, alcalase và pancreatin đã được áp dụng trong quá trình này Quá trình loại bỏ protein bằng protease có thể thực hiện trước hoặc sau khi loại khoáng, tùy thuộc vào các chất có mặt trong mẫu Tuy nhiên, việc sử dụng các chất xúc tác enzyme này gặp khó khăn do chi phí sản xuất enzyme cao Do đó, enzyme thô thu nhận từ nội tạng cá hoặc vi khuẩn được sử dụng như một giải pháp thay thế, giúp tiết kiệm chi phí và giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường trong ngành công nghiệp chế biến cá.

Nhi u ch ph m protease th ng m i đ c s d ng đ lo i protein trong quá trình thu nh n chitin t đ ng v t giáp xác nh Alcalase 2.4L, Pancreatin, Delvolase, Cytolase PCL5, Econase CEPi, MP 100, Maxazime NNP và Cellupulin MG Alcalase 2.4L, một endo serine protease, có nguồn gốc từ Novo Nordisk A/S, đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải protein để thu nhận chitin hiệu quả từ động vật giáp xác.

Bacillus licheniformis là một vi khuẩn được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm Chế phẩm Alcalase được chọn do tính hiệu quả của nó trong việc phân hủy các acid amin khan hiếm, tạo ra dịch thủy phân protein mà không có vấn đề cặn bã trong quá trình phân hủy được kiểm soát Hơn nữa, dịch thủy phân protein này trở thành một nguồn cung cấp acid amin thiết yếu Hiệu quả kháng protein của chế phẩm Alcalase trên tôm được công bố trong khoảng 54-97%.

Phương pháp hóa sinh hiện đại cho phép thu được chitin thông qua quá trình depolymer hóa và deacetyl hóa, giúp điều chỉnh mức độ polymer hóa và acetyl hóa theo mong muốn Bên cạnh đó, dịch thủy phân protein từ phương pháp hóa sinh có chứa thành phần axit amin cân bằng, phù hợp để sử dụng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Đặc biệt, dịch thủy phân protein từ tôm sử dụng enzyme mang lại nhiều lợi ích dinh dưỡng.

Alcalase là một enzyme không có vỏ, có thể được sử dụng như một nguồn protein thay thế trong một số sản phẩm thực phẩm Việc sử dụng Alcalase giúp giảm thiểu hóa chất sử dụng và giảm chi phí xử lý hóa chất trước khi thải ra môi trường, đây là ưu điểm của phương pháp này Tuy nhiên, hiệu quả loại bỏ protein của protease thấp hơn so với phương pháp hóa học Sau quá trình loại bỏ protein bằng protease, khoảng 5-10% protein vẫn tồn tại trong chitin thu nhận được, gây khó khăn cho việc sử dụng chitin trong sản phẩm cuối Do đó, cần thiết phải thực hiện quá trình xử lý bằng NaOH trong điều kiện ôn hòa trong thời gian ngắn để loại bỏ hoàn toàn lượng protein còn sót lại.

Thu nh n chitin t v tôm b ng ph ng pháp sinh h c

Phương pháp sinh học là kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn lactic và các vi khuẩn khác, trực tiếp trên thức ăn tôm Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sản sinh ra acid hữu cơ và protease ngoại bào, giúp phân giải khoáng và protein Phương pháp sinh học được chia thành hai loại: lên men lactic và lên men không lactic.

Trong quá trình lên men lactic, protein, khoáng chất và sợi thô được thu nhận, trong đó chitin thô được phân hủy thành canxi lactate nhờ acid lactic phản ứng với canxi carbonate Acid lactic cũng làm giảm pH của canh trồng, thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật và hoạt động của protease, giúp hạn chế các biến đổi không mong muốn của chitin thu nhận được.

Khi sử dụng các vi sinh vật khác, acid hữu cơ sinh ra trong quá trình lên men phân nguyện với ion khoáng trong phẩm tôm, chuyển chúng thành dung muối hữu cơ không tan, sau đó có thể loại bỏ chúng khi ra lẫn chitin và vỏ tôm Tổng thể, protease do sinh vật sinh ra và protease nội bào góp phần vào việc loại bỏ protein.

Phương pháp sinh học có thể được lập lại trong thời gian ngắn và quan trọng là giảm thiểu sự phụ thuộc vào dung môi hóa học Hơn nữa, cấu trúc chitin thu được từ phương pháp sinh học ít bị biến đổi hơn so với cấu trúc chitin thu nhận sử dụng phương pháp hóa sinh hay hóa học Quy trình thực hiện đơn giản, thân thiện với môi trường, giúp giảm chi phí sử dụng enzyme, là những ưu điểm đáng kể của phương pháp này.

12 phương pháp sinh học có thể được sử dụng để thu nhận protein từ các nguồn thực phẩm Những phương pháp này giúp tạo ra các thành phần acid amin cân bằng, từ đó đảm bảo hoạt tính sinh học của protein Việc áp dụng các phương pháp sinh học này không chỉ nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn góp phần vào việc bổ sung protein trong chế độ ăn uống hàng ngày.

Tuy nhiên, khó kh n khi nâng lên quy mô công nghi p là nh c đi m c n l u ý khi s d ng ph ng pháp sinh h c [26, 38]

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus spp có hiệu quả khử protein trong khoảng 78,0-98,6%, trong khi hiệu quả khử khoáng cao đạt tới 99,6% Bên cạnh đó, vi khuẩn Bacillus spp cũng cho thấy hiệu quả khử protein trên 70% và hiệu quả khử khoáng dao động từ 60-90%.

B ng 1.2 Nghiên c u thu nh n chitin t v tôm s d ng ph ng pháp sinh h c

Vi sinh v t s d ng M c đích s d ng

Bacillus licheniformis RP1 Sinh acid và sinh protease

Bacillus cereus SV1 Sinh acid và sinh protease

Sinh acid và sinh protease

Bacillus pumilus A1 Sinh acid và sinh protease

Lactobacillus helveticus Sinh acid và sinh 98% 78% [45]

Sinh acid và sinh protease

Serratia marcescens B742 Sinh protease NA 91,4% [47]

Bacillus subtilis A26, Vibrio metschnikovii J1, Bacillus licheniformis MP1

Sinh acid và sinh protease

Penaeus aeruginosa, Serratia marcescens, và Bacillus pumilus

Sinh acid và sinh protease

Bacillus subtilis Sinh protease NA 82,94% [51]

Bacillus subtilis và Acetobacter pasteurianus

Sinh acid và sinh protease

N m men và ng d ng trong x lý ph ph m th c ph m

Ngu n phân l p n m men

Nem chua là món ăn truyền thống của Việt Nam, được làm từ thịt heo xay trộn với da heo thái nhỏ, sau đó định hình thành khối và gói trong lá Để quá trình lên men diễn ra, nem được gói trong lá chuối trong môi trường yếm khí, giúp ngăn chặn sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Quá trình lên men tự nhiên này thường kéo dài từ 2 đến 4 ngày ở nhiệt độ thích hợp.

Trong quá trình lên men, Thanh và Anh (2016) nhận thấy sự phát triển của nấm men, tuy nhiên, khi gần đến kết thúc quá trình, số lượng nấm men giảm mạnh do ảnh hưởng của acid lactic và hợp chất kháng khuẩn được sinh ra Có hơn 80 giống nấm men đã được phân lập từ nem chua với mật độ khoảng 5x10^4 - 4x10^5 cfu/g.

B ng 1.3 Loài và s l ng gi ng n m men phân l p đ c t nem chua

Tên loài S l ng gi ng

Ch ng không xác đ nh đ c 5 ii) N m men phân l p t ph ph m tôm

Quần thể nấm men trong ao nuôi tôm có mật độ cao do chất hữu cơ từ thức ăn và phân của tôm, không chỉ cung cấp năng lượng mà còn là nguồn carbon và nitơ, cùng với các thành phần thiết yếu như vitamin cho sự phát triển của nấm men Nấm men có khả năng tích tụ carotenoid, bao gồm b-carotene, torulene và torularhodin, giúp tăng cường sức đề kháng cho tôm Đặc biệt, nấm men Rhodosporidium paludigenum đã được chứng minh làm tăng hoạt tính protease và lipase trong dịch gan và tụy tôm, cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong tiêu hóa của tôm.

B ng 1.4 N m men đ nh danh đ c t h tiêu hóa c a tôm

Tên loài S gi ng xác đ nh đ c

N m men Y lipolytica và ng d ng x lý ph ph m th c ph m

Y lipolytica là m t n m men nang (ascomycetous yeast) an toàn trong th c ph m

Nấm đực chú ý và nghiên cứu nhiều vào đầu những năm 70 về khả năng chuyển hóa nguyên liệu kị nước (alkanes, triglyceride và acid béo) để tạo ra protein Loài nấm men này không chỉ có khả năng sản xuất và tiết ra nhiều loại enzyme tự nhiên như lipase lip2p và protease có hoạt tính cao, mà còn tổng hợp được các acid hữu cơ và đạng ol.

Y lipolytica thu c h Saccharomycetaceae, và thu c gi i n m Ascomyces (d i h Sacchromycetoideae) [57] N m men này khác bi t v c u trúc gen và tính ch t sinh lý so v i các n m men khác và có nh ng đ c tính ph bi n c a n m m c và t bào nhân th c b c cao [58] Nó th ng đ c tìm th y trên các c ch t có ngu n g c đ ng v t ho c th c v t mà các ngu n cacbon chính d i d ng các ankan; lipid ho c protein M t khác nó đ c phân l p đ u tiên trên magarine N m men này có th phân l p t các th c ph m giàu lipid và protein [59] nh phomai [60] ho c xúc xích [61]

Y lipolytica không gây b nh [62] Nó r t nh y c m v i nhi t đ cao t 32-34°C

Nhi u ngu n Y lipolytica không phát triển ở nhiệt độ 32°C và là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Loại vi sinh vật này đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là GRAS (Generally Recognized As Safe), cho thấy sản phẩm này hoàn toàn an toàn Điều này cho phép Y lipolytica được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

Y lipolytica có kh n ng đ ng hóa nhi u lo i đ ng nh glucose, galactose ho c manitol nh ng nó không có kh n ng đ ng hóa saccharose do thi u ho t đ ng c a enzyme invertase [63] Ng c l i, n m men này có kh n ng s d ng các ch t k n c nh alkan (nh hexadecan, decan), các acid béo (nh acid palmitic, acid rininoleic, acid lauric), và các triglycerid (trioleine, tripalmitine) Y lipolytica c ng có th s d ng acetate nh m t ngu n cacbon duy nh t [63] Y.lipolytica c ng có th t ng tr ng trong môi tr ng có b sung lipid nh ricinoleic (d u th u d u), s d ng lipid đ t ng h p thành lactone do ho t đ ng c a enzyme lipase và esterase [64] i) Kh n ng t ng h p acid h u c

N m men Y lipolytica là tác nhân chính trong sản xuất acid citric với hiệu suất cao, nhờ khả năng sử dụng nhiều loại chất nền và kiểm soát quá trình dễ dàng Nghiên cứu cho thấy sự tích tụ acid acetic trong tế bào nấm men liên quan đến hoạt tính của enzyme trong điều kiện nguồn nit khan hiếm Trong điều kiện bình thường, enzyme ATP-citrate lyase chuyển hóa acid citric thành oxaloacetate và acetyl-CoA Tuy nhiên, khi nguồn nit bị hạn chế, enzyme adenosine monophosphate deaminase được kích hoạt, làm giảm cofactor cần thiết cho enzyme ATP-citrate lyase, dẫn đến sự gián đoạn trong chu trình Krebs và tích tụ acid citric Acid citric sau đó được xuất ra khỏi tế bào thông qua quá trình trao đổi với oxaloacetate nhờ vào protein vận chuyển Yhm2p Quá trình tổng hợp và xuất acid citric diễn ra nhanh hơn ở pH trung tính, nơi gen điều hòa Yhm2p hoạt động tích cực Thêm vào đó, việc tính toán động học và đề xuất quy trình tổng hợp acid citric cho thấy nhiều lợi ích về năng suất.

Men Y lipolytica không chỉ sản sinh acid citric và acid isocitric mà còn có khả năng tổng hợp và tạo ra nhiều loại acid hữu cơ khác như acid succinic, α-ketoglutaric và itaconic acid.

17 ii) Kh n ng t ng h p protease

Nấm men Y lipolytica được chứng minh có khả năng tổng hợp alkaline extracellular protease, chiếm 1-2% tổng lượng protein của tế bào Hơn 99% enzyme tổng hợp được tạo ra trong môi trường nuôi cấy, trong khi chỉ 1% enzyme được ghi nhận bên trong tế bào Ngoài alkaline extracellular protease, nấm men Y lipolytica còn tiết ra ít nhất 3 loại acid protease và một ribonuclease trong môi trường ngoài.

Sinh tổng hợp protease trong môi trường Y lipolytica bị ảnh hưởng bởi pH Ở pH acid (pH < 6,8), protease acid được tổng hợp, trong khi đó ở pH kiềm (pH 9-10), protease ngoại bào kiềm được tạo ra Ngoài ra, khả năng tổng hợp lipase cũng được ghi nhận.

Enzyme lipase của nấm men Y lipolytica được sản xuất với hiệu suất cao trong môi trường nuôi cấy chứa acid béo, triglyceride và methyl ester Y lipolytica không chỉ sản sinh enzyme lipase ngoài bào mà còn sinh tổng hợp enzyme lipase liên kết với tế bào Trong điều kiện nguồn carbon khan hiếm và nấm men trong pha cân bằng của quá trình sinh trưởng, cả hai loại enzyme lipase đều được tiết ra ra môi trường bên ngoài Điều kiện môi trường khan hiếm nguồn carbon hoặc nguồn nitơ dường như thúc đẩy nấm men Y lipolytica tạo ra lipase Một số ứng dụng của Y lipolytica trong xử lý thực phẩm cũng đang được nghiên cứu.

Trong công nghiệp chế biến cá, nguyên liệu được chế biến thành sản phẩm cho người tiêu dùng Sản phẩm cá thường có hàm lượng lipid cao, điều này làm giảm giá trị thương phẩm của bột cá Yano và cộng sự (2008) đã chỉ ra rằng việc sử dụng Y lipolytica giúp nâng cao giá trị cho sản phẩm cá Tiến hành lên men trạng thái rắn cho cá xay với Y lipolytica giúp giảm bớt hàm lượng chất béo trong sản phẩm cá Sau 96 giờ kết hợp với điều kiện nhất định, hàm lượng chất béo thô đã giảm tới 46% trong khi hàm lượng protein hao hụt không đáng kể Với cùng thời gian lên men, sử dụng hỗn hợp vi khuẩn cũng giúp giảm 28,3% hàm lượng chất béo thô trong sản phẩm cá.

Y lipolytica c ng đ c s d ng đ x lý n c th i t nhà máy s n xu t oliu, d u c , bã d a đ t o ra các s n ph m có giá tr gia t ng cao nh protein đ n bào, lipase, acid citric (B ng 1.5).

B ng 1.5 Ví d s d ng Y lipolytica đ x lý hay nâng cao giá tr cho ph ph m

Ch ng Ph ph m, ph th i S n ph m

ATCC 20255 N c th i t nhà máy ch bi n oliu Lipase, protein đ n W29 N c th i t nhà máy ch bi n oliu bàoLipase

CECT 1240 Các lo i h t nghi n nh Lipase

ACA-DC 50109 N c th i t nhà máy ch bi n oliu Acid citric

NICM 3589 Ph ph m t d a Acid citric

UCP 0988 Ph ph m t nhà máy tinh ch d u th c v t Ch t nh hóa

CH NG 2: NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP

Nguyên v t li u, ch ng vi sinh v t và môi tr ng nuôi c y

Phân lập vi khuẩn từ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) được thực hiện tại nhà máy Nha Trang Seafood F17, Khánh Hòa Sau đó, mẫu tôm được cấp đông và vận chuyển đến phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Trường Đại học Bách Khoa.

Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong ngày, phỏng phấn tôm được rửa sạch, xay bằng máy xay trục vít tại kích thước 3mm, sau đó được chia nhỏ vào các túi sạch có khối lượng 100g và bảo quản lạnh đông nhiệt độ -20°C.

N m men Y lipolytica VTCC 0544 t b s u t p gi ng c a Trung tâm gi ng

Qu c gia, đ c cung c p b i Vi n Công nghi p Th c ph m, Hà N i N m men này đ c gi gi ng trong glycerol 20% -20°C tr c khi thí nghi m

Các môi tr ng nuôi c y vi sinh v t đ c s d ng bao g m:

• YPD: cao n m men 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L

• YPDA: cao n m men 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L, agar 2 g/L

• Môi tr ng Skim Milk (th ch s a g y): hòa tan 15g agar trong 400ml n c c t và tr n v i 600ml s a tách béo

• Môi tr ng lên men M10: Peptone: 10,0 g/L, đ ng (glucose, fructose, saccharose, lactose): 5,0 g/L, cao n m men: 5,0 g/L, Dung d ch bromothymol blue trong ethanol: 2,0 ml/L, pH cu i 7,0 ± 0,2

• Môi tr ng Tweens 80: Peptone: 10,0 g/L; NaCl: 5,0 g/L; CaCl 2 H2O: 0,1 g/L; Tweens 80: 10,0 ml/L; pH cu i 7,0-7,4.

Hóa ch t và thi t b s d ng

Hóa ch t

Ch ph m protease th ng m i Alcalase 2.5L PF, chi t xu t t Bacillus licheniformis (pH t i u 7-10, nhi t đ t i u 30-65°C), cung c p b i Novozymes, an M ch

Các hóa ch t khác s d ng trong nghiên c u này đ c li t kê b ng 2.1

B ng 2.1 Hóa ch t s d ng trong nghiên c u

Hóa ch t Xu t x Hóa ch t Xu t x

D-Glucose Xilong, TQ Methylene blue Xilong, TQ

Cao n m men AngleYeast, TQ Axit trichloroacetic Xilong, TQ

Pepton Xilong, TQ Tyrosine MERCK, c

Agar Vi t Nam Casein MERCK, c

NaCl Xilong, TQ Thu c th Folin MERCK, c

Bromothymol blue Xilong, TQ KH2PO4 Xilong, TQ

KH2PO4 Xilong, TQ Diethyl Ether Xilong, TQ

CaCl2.H2O Xilong, TQ H2SO4đ m đ c Xilong, TQ

Tweens 80 Xilong, TQ H2O2 30% Xilong, TQ

Skim milk Glanbia, Ireland NaOH Xilong, TQ

C n 96° Vi t Nam HCl đ m đ c Xilong, TQ

Phenolphthalein MERCK, c Na2HPO4.12H2O, Xilong, TQ

Thi t b s d ng

S d ng các thi t b ch y u có trong phòng thí nghi m Vi sinh B2-307 và Hóa sinh B2-305 c a tr ng, c th b ng 2.2:

Cân 4 s l Sartorius c N i h p ti t trùng t đ ng

Autoclave Sturdy SA- 300VF ài Loan

T s y đ i l u Memmert c Bu ng c y Vi t Nam

Kính hi n vi Olympus CX23 Trung

Lò nung LENTON EF11/8B Anh Máy l c IKA KS250 c

Máy ly tâm Tomy LC-122 Nh t B n Cân s y m Denver IR35 c

Máy đo quang ph UV-Vis

Qu c Máy votex Hwa-sin

T hút khí đ c Vi t Nam B c t đ m th công Trung

Máy đo pH Hanna HI2211 Ý B đi u nhi t Memmert Qu cc

D ng c : b soxhlet, ng nghi m, đ a petri, que c y, đ a khu y, bình tam giác, đèn c n, giá đ ng nghi m, bu ng đ m h ng c u, nhi t k , micropipet, pipet 10ml, pipet 1 ml, bóp cao su …

B trí thí nghi m t ng quát

Bài viết tập trung vào việc phân tích thành phần hóa học của sản phẩm tôm, bao gồm hàm lượng đạm, protein, béo và tro Nghiên cứu cũng xác định và phân lập nấm men trên sản phẩm tôm và nem chua Nha Trang Hiệu quả của nấm men Y lipolytica được so sánh với vi khuẩn B subtilis và enzyme Alcalase để đánh giá khả năng xử lý sản phẩm tôm Bên cạnh đó, nghiên cứu đánh giá hình thái, nhiệt độ sinh trưởng và các tính chất sinh hóa như khả năng sinh urease, protease, hoạt tính protease và sinh acid của nấm men Y lipolytica Cuối cùng, hiệu quả khoáng và protein của chúng trên sản phẩm tôm cũng được khảo sát.

Hình 2.1 B trí thí nghi m t ng quát

Ph ng pháp nghiên c u

Ph ng pháp x lý ph ph m tôm

Phẩm chất mực tôm được nghiền tới kích thước không quá 3mm bằng máy xay trục vít và được bảo quản trong tủ đông nhiệt độ -20°C Trước khi tiến hành thí nghiệm xử lý với vi sinh vật học phẩm Alcalase, mẫu được rã đông và cân chính xác khối lượng vào các bình tam giác đậy kín, sau đó hấp tiệt trùng điều kiện 121°C trong 15 phút.

Ph ng pháp phân l p và đ nh danh n m men

i) Ph ng pháp phân l p n m men

C y d ch ch a vi sinh v t đã pha loãng trên môi tr ng dinh d ng đ c tr ng

YPDA và PDA đã được bổ sung kháng sinh chloramphenicol với nồng độ 0,0001% Việc nuôi vi sinh vật được thực hiện trong điều kiện thích hợp để tách biệt các khuẩn lạc Cách tách khuẩn lạc được thực hiện bằng phương pháp nghiêng đĩa, nhằm thu nhận các vi sinh vật thuần khiết Phương pháp định danh nấm men cũng được áp dụng trong nghiên cứu này.

Gi i trình t Sanger: Ph ng pháp này th c hi n d a trên k thu t ph bi n là

Chu trình kết thúc chuỗi (chain termination) diễn ra khi sử dụng các deoxy nucleotide đã được chỉnh sửa, tạo ra một nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử DNA Nhóm 3’-OH cho phép thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một dideoxynucleotide (ddNTP) được thêm vào, do không có nhóm 3’-OH, nucleotide không thể được thêm vào, dẫn đến phản ứng tổng hợp dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) vào mạch DNA, kéo dài mạch tại vị trí 3’-OH và đồng thời gắn các ddNTP vào chuỗi Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP, sau khi phản ứng tổng hợp, sẽ hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Sự khác biệt về độ dài các đoạn DNA sẽ được thể hiện trên băng gel sau khi điện di, từ đó xác định trình tự trong gen.

Trình t DNAđ c so sánh v i d li u th vi n ph chu n vi sinh v t GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

2.4.3 Ph ng pháp nuôi c y, xác đ nh đ c đi m hình thái c a t bào sinh d ng các ch ng n m men

23 i) Ph ng pháp ho t hóa gi ng

N m men Y lipolytica VTCC 0544 và các n m men phân l p đ c ho t hóa trên môi tr ng th ch YPDA.

Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A ii) Ph ng pháp ti n t ng sinh

N m men Y lipolytica VTCC 0544 và các n m men phân l p đ c ti n t ng sinh trên môi tr ng YPD(môi tr ng c p 1)

Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A iii) Ph ng pháp t ng sinh

Sau khi tiến hành sinh trong môi trường YPD 24 giờ, các nấm men tiếp tục được cấy vào môi trường YPD (môi trường cấp 2) Phương pháp xác định mật độ tế bào được thực hiện để đánh giá sự phát triển của nấm men trong quá trình này.

M t đ t bào n m men trong môi tr ng l ng đ c xác đ nh b ng ph ng pháp đ m s t bào trong bu ng đ m Malassez [74]

Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A v) Ph ng pháp xác đ nh đ c đi m hình thái

Các chùng nấm men được cấy trên môi trường thạch YPDA và PDA trong đĩa petri, nghiêng và ở nhiệt độ 30°C Sau 2 ngày, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và ghi nhận màu sắc, hình dạng và tình trạng bề mặt Đồng thời, đếm số tế bào được quan sát dưới kính hiển vi Phương pháp xác định nhiễm trùng từ nấm men này được thực hiện để đánh giá sự phát triển của chúng.

Các ch ng n m men đ c c y zigzag trên môi tr ng th ch nghiêng YPDA và YPA, nuôi c y các nhi t đ 30ΔC, 37ΔC và 42ΔC Ki m tra kh n ng sinh tr ng sau

Ph ng pháp kh o sát các tính ch t sinh hóa c a vi sinh v t

i) Kh o sát kh n ng s d ng các lo i đ ng

Sự chuyển hóa là quá trình biến đổi các loại chất, bao gồm acid hữu cơ, rượu và một số hợp chất khác không có tính acid Quá trình này có thể tạo ra khí hoặc không tạo ra khí carbonic Môi trường M10 được sử dụng để xác định khả năng chuyển hóa của các loại chất khác nhau bởi vi sinh vật và để đánh giá hiệu quả của chúng.

Quá trình sản xuất acid và khí cacbonic tạo ra sản phẩm với sự thay đổi màu sắc của dung dịch bromothymol blue; trong môi trường acid, dung dịch chuyển sang màu vàng, trong khi đó, nếu không có acid, dung dịch sẽ có màu xanh Khí cacbonic được tạo ra và thu giữ trong ống Durham Ngoài ra, có sự hiện diện của enzyme urease trong quá trình này.

C y n m men (1-2 vòng que c y) vào dung d ch 10 mM đ m kali phosphate (pH 6,0, ch a Phenol Red (20–50 mg/L) và urea (20 g/L)) và nuôi c y 37ΔC trong 5 gi

N m men có kh n ng sinh urease s chuy n màu môi tr ng thành màu đ đ m [75] iii) Kh o sát kh n ng sinh protease ngo i bào

Nấm men được kiểm tra khả năng sản xuất protease ngoại bào trên đĩa thạch sữa gầy Chúng được cấy trong đĩa thạch sữa gầy và ủ ở 30°C trong 3 ngày Các vùng trong suất (vùng thể hiện) được phát hiện xung quanh các khu vực nấm men có khả năng sinh protease ngoại bào Cuối cùng, xác định hoạt động enzyme trong dịch nuôi tảo sinh.

C y 1 vòng que c y vào các bình tam giác ch a 50mL môi tr ng nuôi c y l ng

YPD là môi trường nuôi cấy với các bình tam giác được lắc ở tốc độ 200 vòng/phút và nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau thời gian này, quá trình ly tâm sẽ tách sinh khối, giúp thu được phần dịch nuôi cấy để xác định hoạt động enzyme bằng phương pháp Anson Đồng thời, nghiên cứu cũng tập trung vào khả năng sinh lipase.

Các nghiên cứu đã kiểm tra khả năng sản xuất lipase trên đĩa thạch môi trường Tweens 80 Các nấm men được cấy riêng biệt trên đĩa thạch Tweens 80 và ủ ở 30°C trong 3 ngày Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành quan sát đĩa thạch và đồng thời soi dưới kính hiển vi Nếu nấm men có hoạt tính phân giải lipid, sẽ có hiện tượng quan sát thấy vùng mờ xung quanh các khuẩn lạc Khi quan sát bằng kính hiển vi, những vùng mờ này bao gồm các tinh thể của muối canxi không hòa tan của axit béo và đặc hình thành.

Nuôi c y n m men trong đ a petri ch a môi tr ng YPDA có b sung CaCO3 5 g/L Vi sinh v t có kh n ng sinh acid s hòa tan CaCO3 hình thành vùng trong su t g n khu n l c

Nuôi c y n m men trên môi tr ng l ng YPD ho c YP trong 2 ngày, ly tâm lo i sinh kh i và xác đ nh pH c a d ch canh tr ng.

Quy trình c y gi ng trên ph ph m tôm

Sau khi rã đông, cân chính xác 10g ph ph m tôm xay và cho vào bình Erlen chứa 20ml nước cất Các bình Erlen tôm được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút Sinh khối vi sinh vật được nuôi cấy, sau đó tách sinh khối bằng phương pháp ly tâm.

3000 vòng/phút trong 5 phút, r a l i b ng đ m Na2HPO4 – KH2PO4 (pH 5,6)3 l n

C y chính xác l ng d ch treo t bào c n vào erlen tôm đã ti t trùng sao cho đ t m t đ 10 6 , 10 7 ho c 10 8 cfu/g tôm L c v i t c đ 200 vòng/phút, nhi t đ phòng trong vòng 2-5 ngày

Kết thúc quá trình nuôi tôm, mực tôm được rây qua rây 140 mesh để tách phần vỏ tôm còn lại Phần răng mực và tôm sót lại được rửa sạch và sấy đến khối lượng không đổi, sau đó xác định hàm lượng protein, lipid và tro Đối với vi khuẩn B subtilis, thực hiện tẩm tách với mật độ 10^8 cfu/g tôm.

Quy trình s d ng enzyme alcalase x lý ph li u tôm

Quy trình xử lý tôm bằng enzyme Alcalase được tham khảo từ công trình của Dan và cộng sự (2017) Đầu tiên, 10g tôm xay đã rã đông được cân chính xác và cho vào erlen chứa 20ml nước cất Các erlen này được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Sau đó, thêm 0,3% (v/w) enzyme Alcalase vào mẫu tôm đã tiệt trùng trong điều kiện vô trùng Mẫu được giữ ở nhiệt độ 50°C trong 6 giờ Kết thúc quá trình thủy phân, mẫu tôm được rây qua rây 140 mesh để tách phần tôm còn lại Phần rắn và tôm còn sót lại được sấy khô ở 90°C cho đến khi lượng nước không đổi trước khi xác định hàm lượng protein, lipid và tro.

2.5 Ph ng pháp phân tích

2.5.1 Ph ng pháp xác đ nh thành ph n hóa h c

Thành ph n hóa h c c a nguyên li u và ch t r n thu đ c sau quá trình x lýv i vi sinh v t ho c ch ph m enzyme đ c xác đ nh theo TCVN (B ng 2.3)

B ng 2.3 Ph ng pháp xác đ nh thành ph n hóa h c

Thành ph n Ph ng pháp Tiêu chu n

Tro t cháy tro trong lò nhi t đ 550°C÷600°C TCVN 4327-86 m S y khô 105°C đ n kh i l ng không đ i (AOAC, 2000) Chitin Minh và c ng s (2017) [79]

* Hàm l ng protein = Hàm l ng Nit t ng x 6,25

Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.

Xác đ nh hi u qu kh khoáng

Hàm lượng khoáng trong đất là tỷ lệ phần trăm của các khoáng tách biệt so với lượng khoáng có trong mẫu đất tự nhiên khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc hóa chất phẩm enzyme.

DA (%): Hi u qu kh khoáng.

A 0 , A R : Hàm l ng tro (g/g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.

O, R: Kh i l ng (g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.

Xác đ nh hi u qu kh protein

Huyết khối protein là thành phần quan trọng của các loại protein tách biệt so với protein có trong mụn tơ ng ng sau khi xử lý bằng vi sinh và thuốc chứa enzyme, được xác định theo công thức cụ thể.

DP (%): Hi u qu kh protein.

P0, PR: Hàm l ng protein (g/g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme, xác đ nh b ng ph ng pháp Kjeldahl.

O, R: Kh i l ng (g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.

Xác đ nh hi u qu kh lipid

Lipid là thành phần chính trong màng tế bào, được phân tách thành các loại lipid khác nhau so với lipid có trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, và quá trình này được xác định theo công thức cụ thể.

経詣 (%) =詣 墜 捲頚 伐 詣 眺 捲迎

詣 墜 捲頚 茅100 Trong đó:

DL (%): Hi u qu kh lipid.

L0, LR: Hàm l ng lipid (g/g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme, xác đ nh b ng ph ng pháp Soxhlet.

O, R: Kh i l ng (g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.

Ph ng pháp xác đ nh ho t tính enzyme

Nguyên lý của nghiên cứu là casein b phân gi i trong môi trường kiềm, nơi tác động của protease tạo ra các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA) Phương pháp xác định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc thử Folin.

Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.

Ph ng pháp x lý s li u

T t c các thí nghi m đ c b trí l p l i t 3 đ n 4 l n và ti n hành x lý s li u d a trên ph n m m Statgraphic centurion và Microsoft Excel 2016

CH NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N

Thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm

K t qu phân tích thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm đ c th hi n b ng

Hàm lượng protein trong thành phần chất khô của phế phẩm tôm đạt 48,3±0,3%, cho thấy đây là nguồn protein có giá trị cao, phù hợp với kết quả công bố trong tài liệu Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng hàm lượng protein của phế phẩm tôm cao hơn so với các loại tôm hàng hóa khác.

Parapenaeus longirostris chiếm 27,6% và Metapenaeus monoceros chiếm 30,0% trong các loài tôm Trong tôm, protein tập trung chủ yếu ở màng trong và màng trung gian, tạo nên đặc trưng cho tôm Màng trong chứa protein tạo thành mạng lưới bao bọc chitin, do đó để thu nhận chitin cần phải loại bỏ protein.

Hàm l ng khoáng chi m 31,0% kh i l ng ch t khô trong v tôm, t ng đ ng v i k t qu công các nghiên c u c a Vo và c ng s (2020) [18], Younes và c ng s

(2016) [19], Hamdi và c ng s (2018) [80] Chúng t n t i màng trung gian và màng ngoài c a v [25, 26] Vì v y, đ thu nh n chitin c n ph i lo i b khoáng

Lipid chiếm một lượng lớn trong chất khô của phẩm tôm, đạt 5,0% khối lượng chất khô So với kết quả công bố trong các nghiên cứu trước đây, điều này cho thấy tầm quan trọng của lipid trong thành phần dinh dưỡng của tôm Tuy nhiên, việc thu nhận chitin có khả năng gia tăng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là khi kết hợp với các loại béo.

Nghiên cứu này cho thấy hàm lượng chitin trong phẩm tôm đạt 17,6 ± 1,1% khối lượng chất khô, phù hợp với các nghiên cứu trước đó của Tan và cộng sự (2021) cũng như Liu và cộng sự (2020), cho rằng hàm lượng chitin trong phẩm tôm dao động từ 14 đến 27% khối lượng chất khô Hàm lượng chitin của phẩm tôm trong nghiên cứu này cao hơn so với Allopetrolisthes punctatus (7,9% khối lượng chất khô) và tôm he Nam C (2,0% khối lượng chất khô) Điều này cho thấy phẩm tôm là nguồn thu nhận chitin tiềm năng.

B ng 3.1 Thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm

Thành ph n Hàm l ng (% kh i l ng ch t khô) m 70,0 ± 0,4

Kh o sát kh n ng s d ng n m men đ x lý ph ph m tôm

Hi u qu kh protein

Hình 3.1 cho thấy hiệu quả kh protein phụ phẩm tôm của nấm men Y lipolytica đạt 85,8 ± 0,6% sau 5 ngày lên men, cao hơn 1,2 và 1,1 lần so với hiệu quả kh protein của vi khuẩn B subtilis và phụ phẩm enzyme Alcalase Xu hướng này liên quan đến hoạt tính protease trong môi trường nuôi cấy.

Ho t tính protease càng cao thì hi u qu kh protein càng cao

Các ký t khác nhau cho th y s khác bi t có ý ngh a th ng kê (p