Nghiên cứu ứng dụng nấm men xử lý phế liệu tôm

I H C QU C GIA TP HCM TR NG I H C BÁCH KHOA BÙI H U H NG NGHIÊN C U X NG D NG N M MEN LÝ PH LI U TÔM Chuyên ngành: Công ngh th c ph m Mã s : 8540101 LU N V N TH C S TP H CHÍ MINH, tháng 07 n m 2022 CƠNG TRÌNH TR NG Cán b h C HOÀN THÀNH T I I H C BÁCH KHOA – I H C QU C GIA TPHCM ng d n khoa h c: TS T Th Minh Ng c Cán b ch m nh n xét 1: TS Nguy n Hoài H ng Cán b ch m nh n xét 2: PGS.TS Hoàng Kim Anh Lu n v n t t nghi p đ c b o v t i Tr ng i h c Bách Khoa – i h c Qu c gia TPHCM Th i gian b o v : 13/07/2022 Thành ph n h i đ ng đánh giá lu n v n bao g m: Ch t ch h i đ ng: PGS.TS Tôn N Minh Nguy t Ph n bi n 1: TS Nguy n Hoài H ng Ph n bi n 2: PGS.TS Hoàng Kim Anh y viên: TS T Th Minh Ng c y viên, th ký: PGS.TS Tr n Th Thu Trà Xác nh n c a Ch t ch H i đ ng đánh giá LV Tr ngành sau lu n v n đ CH T CH H I ng Khoa qu n lý chuyên c s a ch a (n u có) NG TR PGS.TS Tơn N Minh Nguy t NG KHOA K THU T HÓA H C I H C QU C GIA TP HCM TR NG C NG HÒA XÃ H I CH NGH A VI T NAM I H C BÁCH KHOA c l p - T - H nh phúc NHI M V LU N V N TH C S H tên h c viên: Bùi H u H ng MSHV: 1870266 Ngày, tháng, n m sinh: 21/02/1993 N i sinh: Khánh Hịa Chun ngành: Cơng ngh th c ph m Mã s : 8540101 I TÊN TÀI: Nghiên c u ng d ng n m men x lý ph li u tôm - Research on valorisation of shrimp by-product using yeast II NHI M V VÀ N I DUNG: - Xác đ nh thành ph n nguyên li u Kh o sát kh n ng s d ng n m men đ x lý ph ph m tôm: hi u qu kh khoáng, kh protein Phân l p n m men t ngu n nguyên li u/th c ph m Vi t Nam xác đ nh m t sơ tính ch t sinh lý, sinh hóa c a ch ng n m men phân l p đ c Kh o sát kh n ng x lý ph ph m tôm c a ch ng n m men III NGÀY GIAO NHI M V : 14/02/2022 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 13/07/2022 V CÁN B H NG D N: TS T Th Minh Ng c Tp HCM, ngày 20 tháng 07 n m 2022 CÁN B B H NG D N TS T Th Minh Ng c TR CH NHI M B 1B MÔN ÀO T O GS TS Lê V n Vi t M n NG KHOA K THU T HÓA H C L ic m n L i đ u tiên, em xin bày t lòng bi t n sâu s c t i TS T Th Minh Ng c t n tình h ng d n, t o m i u ki n giúp em hoàn thành lu n v n Em xin g i l i c m n chân thành đ n th y cô B môn Công ngh th c ph m, Khoa K thu t hóa h c, tr ng i h c Bách Khoa thành ph H Chí Minh t n tình truy n đ t ki n th c cho em su t th i gian h c t p t i tr ng Sau cùng, em xin dành l i c m n chân thành đ n gia đình b n bè ln đ ng viên, khích l em đ ng h c t p nghiên c u i Tóm t t M c đích c a nghiên c u kh o sát kh n ng lo i b protein, khoáng lipid ph ph m tôm c a m t s lồi n m men ph m tơm đ u tiên, thành ph n hóa h c c a ph c xác đ nh Sau đó, hi u qu kh protein, hi u qu kh khoáng hi u qu kh lipid c a n m men Yarrowia lipolytica đ c xác đ nh so sánh v i vi khu n Bacillus subtilis ch ph m enzyme Alcalase Ti p theo, v i m c tiêu tìm loài n m men phù h p v i u ki n th c t đ a ph s d ng nh ngu n phân l p n m men s d ng lo i đ ng, ph ph m tôm nem chua đ c c m hình thái, đ c tính sinh lý (kh n ng ng, kh n ng sinh urease, nhi t đ sinh tr ng t i đa) đ c tính sinh hóa (kh n ng sinh protease, kh n ng sinh lipase, kh n ng sinh acid) c a n m men Y lipolytica n m men phân l p đ phân l p đ c đ nh danh b ng ph c xác đ nh Song song đó, n m men ng pháp gi i trình t Sanger Cu i cùng, hi u qu kh khoáng, hi u qu kh protein hi u qu kh lipid c a n m men ph ph m tôm d is nh h ng c a th i gian nuôi c y m t đ gi ng c y đ c kh o sát K t qu cho th y thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm g m hàm l 48,3 ± 0,3%, hàm l ng lipid 5,0 ± 0,2%, hàm l chitin 17,6 ± 1,1% (kh i l ng protein ng tro 31,0 ± 0,3%, hàm l ng ng ch t khô) So v i vi khu n B subtilis ch ph m Alcalase, n m men Y lipolytica th hi n hi u qu x lý ph ph m tôm cao nh t v i hi u qu kh protein 85,8 ± 0,6%, hi u qu kh khoáng 49,4 ± 0,4%, hi u qu kh lipid 90,1 ± 0,1%, cho th y ti m n ng s d ng n m men đ x lý ph ph m tôm T ph ph m tôm nem chua đ nh danh đ c loài n m men l n l tropicalis Pichia kudriavzevii loài n m men phân l p đ tr ng t i đa cao (42 C), s d ng đ lipase acid vào môi tr c nhi u lo i đ t Candida c có nhi t đ sinh ng, có kh n ng sinh protease, ng ni c y Tuy nhiên, hi u qu kh protein (26-33%), hi u qu kh khoáng (35-48%) hi u qu kh lipid (40-78%) c a chúng th p h n so v i n m men Y lipolytica Các n m men phân l p t ph ph m tôm nem chua m c dù th hi n hi u qu x lý ph ph m ch a t t nh ng đáng đ c ý nghiên c u sâu h n K t qu đ tài cho th y ti m n ng x lý ph ph m tơm c a n m men nói chung hay n m men Y ii lipolytica nói riêng, m h ng nghiên c u m i thu nh n chitin t ph ph m tôm s d ng n m men nh tác nhân sinh h c iii Abstract This study aims to investigate deproteinization, demineralization and delipidation efficiency of several yeasts on shrimp processing by-product Firstly, chemical composition of the shrimp by-product was analyzed Next, deproteinization efficiency, demineralization efficiency and delipidation efficiency on shrimp by-product of Yarrowia lipolytica were determined and compared to those of Bacillus subtilis and Alcalase preparation After that, as setting purpose of finding out yeast fitting to local conditions, the shrimp by-product and Nem chua were used as sources to isolate yeast species Morphology, physiological (sugar conversion ability, urease production, maximum growth temperature) as well as chemical and biological properties (protease production, lipase production, acid production) of these yeasts were examined Simultaneously, these isolated yeasts were identified using Sanger sequencing method Finally, their deproteinization efficiency, demineralization efficiency and delipidation efficiency on shrimp by-product under the effect of incubation time and inoculum size were evaluated The results showed that chemical composition of the shrimp processing byproduct including protein content of 48.3 ± 0.3%, lipid content of 5.0 ± 0.2%, ash content of 31.0 ± 0.3%, chitin content of 17.6 ± 1.1% (on dry weight basis) Y lipolytica expressed demineralization greater efficiency deproteinization (49.4 ± 0.4%) efficiency and (85.8 delipidation ± 0.6%), efficiency (90.1 ± 0.1%) on shrimp by-product than B subtilis and Alcalase did On the other hand, Candida tropicalis was identified from the shrimp by-product while from Nem chua, Pichia kudriavzevii was determined They exhibited high maximum growth temperature (42 C) and were able to converse various types of sugar as well as secret protease, lipase and acids However, their deproteinization efficiency (26-33%), demineralization efficiency (35-48%) and delipidation efficiency (40-78%) on shrimp by-product were lower than those of Y lipolytica Though yeasts isolated from the shrimp by-product and Nem chua expressed low efficiency in removing non-chitin components in shrimp by-product, they deserved to be deeply investigated This study showed the great potential of employing yeast in iv general or Y lipolytica in particular to treat shrimp by-product, which could be considered as a new approach in chitin recovery from the by-product using yeast v L i cam đoan Tác gi xin cam đoan cơng trình nghiên c u c a b n thân tác gi Các k t qu nghiên c u k t lu n lu n án trung th c, không chép t b t k m t ngu n d (n u có) đ i b t k hình th c Vi c tham kh o ngu n tài li u c th c hi n trích d n ghi ngu n tài li u tham kh o quy đ nh H c viên cao h c Bùi H u H ng vi M cl c L i c m n i Tóm t t .ii Abstract iv L i cam đoan vi M c l c vii Danh m c hình x Danh m c b ng xii t v n đ CH NG 1: T NG QUAN 1.1 Tôm ph ph m ch bi n tôm 1.2 Chitin t ph ph m tôm 1.2.1 Thu nh n chitin t v tôm b ng ph ng pháp hóa h c 1.2.2 Thu nh n chitin t v tôm b ng ph ng pháp hóa sinh 10 1.2.3 Thu nh n chitin t v tôm b ng ph ng pháp sinh h c 11 1.3 N m men ng d ng x lý ph ph m th c ph m 13 1.3.1 Ngu n phân l p n m men 13 1.3.2 N m men Y lipolytica ng d ng x lý ph ph m th c ph m 15 CH NG 2: NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP 19 2.1 Nguyên v t li u, ch ng vi sinh v t môi tr ng nuôi c y 19 2.2 Hóa ch t thi t b s d ng 19 2.2.1 Hóa ch t 19 2.2.2 Thi t b s d ng 20 2.3 B trí thí nghi m t ng quát 21 2.4 Ph ng pháp nghiên c u 22 vii Quan sát vùng su t (vùng th y phân) đ c phát hi n xung quanh khu n l c vi khu n n m vào cu i th i gian Kh o sát kh n ng sinh lipase Dùng que c y, ria ch ng vi sinh v t ho t hóa vào đ a th ch Tween 80 a vi khu n đ c 37°C ngày đ a n m men đ c 30°C ngày Quan sát qu ng m đ c đ c phát hi n xung quanh khu n l c vi khu n n m vào cu i th i gian Dùng kính hi n vi v t kính 40 đ t qu ng m đ c đ quan sát tinh th canxi có th có A.9 Ph ng pháp xác đ nh hàm l ng chitin Cân g v tôm (đã s y, xay nh ) cho vào bình ch a 50ml HCl 1M gi 80 C L c chân không thu nh n ph n ch t r n r a b ng n (khơng cịn axit) Ph n r n đ c x lý ti p t c v i 100 ml NaOH 1M gi 90 C L c thu nh n ph n r n r a l i l n v i 15ml acetone tr đ n tr ng l Hàm l ng không đ i ng chitin đ c tính theo cơng th c: Trong đó, m1 kh i l ng m u ban đ u m2 kh i l ng ch t r n thu đ MC đ c sôi đ n trung tính c m c a nguyên li u ban đ u 77 c s y 110 C Ph l c B: K t qu thí nghi m B.1 Xác đ nh thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm B ng B.1 Thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm L n m (%) Protein(*) (%) Tro(*) (%) Lipid(*) (%) 70,85 48,49 30,85 4,84 70,58 48,54 30,89 5,04 69,94 47,96 31,35 5,15 70,22 Trung bình 70,40 48,33 31,03 5,01 l ch chu n 0,40 0,32 0,28 0,16 (*) Tính theo kh i l ng ch t khô B.2 Xác đ nh ho t đ enzyme d ch nuôi c y vi sinh v t B ng B.2 K t qu đo đ h p th OD đ d ng đ N ng đ tyrosin chu n ( M) OD ∆OD Hình B.1 0,2 0,4 ng chu n Anson 0,6 0,8 0,001 0,03 0,069 0,105 0,141 0,176 0,029 0,068 0,104 0,14 0,175 ng chu n Anson đ xác đ nh ho t tính protease 78 B ng B.3 K t qu đo OD d ch nuôi c y ch ng n m men Y.lipolytica VTCC 0544 ch ng S2 Y.lipolytica VTCC 0544 S2 Ch ng vi sinh L ng Ho t L ng Ho t Th Th Th Th v t ∆OD tyrosine đ ∆OD tyrosine đ th t không th t không L n ( M) (UI/ml) ( M) (UI/ml) 0,058 0,053 0,005 0,045 0,36 0,315 0,305 0,010 0,073 0,06 0,056 0,052 0,004 0,039 0,31 0,312 0,302 0,010 0,073 0,06 0,057 0,053 0,004 0,039 0,31 0,314 0,302 0,012 0,084 0.07 Trung 0,33 0,06 bình l ch chu n K t qu 0,03 0,01 0,33 ± 0,03b 0,06 ± 0,01d B ng B.4 K t qu đo OD d ch nuôi c y ch ng n m men N3 ch ng vi khu n B.subtilis N3 B.Subtilis Ch ng vi L ng Ho t L ng Ho t Th Th sinh tyrosine tyrosine đ đ ∆OD ∆OD th t không v t Th Th ( M) (UI/ml) ( M) (UI/ml) L n th t không 0,262 0,25 0,012 0,08 0,07 0,176 0,129 0,047 0,281 0,22 0,258 0,25 0,008 0,06 0,05 0,178 0,131 0,047 0,281 0,22 0,266 0,252 0,014 0,10 0,08 0,18 0,136 0,044 0,264 0,21 Trung 0,06 0,22 bình l ch chu n K t qu 0,01 0,01 0,06 ± 0,01d 0,22 ± 0,01c B ng B.5 K t qu đo OD c a enzyme Alcalase L n Th th t Th không ∆OD L ng tyrosin ( M) Ho t đ (UI/ml) 0,095 0,035 0,060 0,354 2,83 0,098 0,036 0,062 0,365 2,92 0,096 0,036 0,060 0.354 2,83 Trung bình 2,86 l ch chu n 0,05 K t qu 2,86 ± 0,05a 79 B.3 Xác đ nh thành ph n hóa h c c a ph li u sau x lý B ng B.6 Hàm l ng protein c a ph ph m tôm sau x lý v i vi sinh v t enzyme M u Enzyme L n (%) L n (%) L n (%) Trung bình l ch chu n 19,86 19,42 19,86 19,71 0,26 ngày Y.lipolytica VTCC 0544 B.subtilis S2 N3 27,17 27,61 82,95 60,72 27,80 27,29 82,31 60,24 26,72 26,45 82,08 60,58 27,23 27,11 82,45 60,52 0,55 0,60 0,45 0,25 ngày M u Y.lipolytica VTCC 0544 B.subtilis S2 N3 L n (%) 21,93 22,53 78,48 61,63 L n (%) 20,23 21,85 77,24 61,63 L n (%) 21,47 21,82 77,67 61,45 Trung bình 21,21 22,07 77,80 61,57 l ch chu n 0,88 0,40 0,63 0,11 B ng B.7 Hàm l ng tro c a ph ph m tôm sau x lý v i vi sinh v t enzyme ngày Enzyme M u Y.lipolytica VTCC 0544 B.subtilis S2 N3 L n (%) 45,91 49,46 43,10 38,08 36,79 L n (%) 45,68 48,90 43,86 37,12 37,23 L n (%) 46,41 48,52 43,82 37,09 38,17 Trung bình (%) 46,00 48,96 43,59 37,43 37,40 l ch chu n 0,38 0,47 0,43 0,56 0,71 ngày Y.lipolytica VTCC 0544 B.subtilis 48,62 43,16 L n (%) 49,53 41,73 L n (%) 47,96 42,90 L n (%) 48,70 42,60 Trung bình (%) 0,79 0,79 l ch chu n M u 80 S2 37,56 37,12 37,92 37,53 0,40 N3 36,10 36,13 37,64 36,62 0,88 B ng B.8 Hàm l ng lipid c a ph ph m tôm sau x lý v i vi sinh v t enzyme ngày M u Enzyme Y.lipolytica VTCC 0544 B.subtilis S2 N3 L n (%) 4,63 0,70 0,42 2,32 4,97 L n (%) 4,44 0,73 0,43 2,20 4,94 Trung bình (%) 4,53 0,71 0,43 2,26 4,95 l ch chu n 0,13 0,02 0,01 0,09 0,02 B.4 Kh n ng kh protein, khoáng lipid t v tôm c a vi sinh v t B ng B.9 Hi u qu kh protein c a vi sinh v t enzyme ngày M u Enzyme Y.lipolytica B.subtilis S2 N3 L n1 76,67 80,93 65,02 24,67 33,63 L n2 77,20 80,48 65,42 25,25 34,15 L n3 76,68 81,24 66,49 25,46 33,78 Trung bình 76,85 80,88 65,64 25,13 33,85 l ch chu n 0,30 0,38 0,76 0,41 0,27 a b d K t qu 76,85±0,30 80,88 ± 0,38 65,64 ± 0,76 25,13 ± 0,41 33,85 ± 0,27c M u ngày Y.lipolytica B.subtilis S2 N3 L n1 85,31 71,95 30,64 31,68 L n2 86,45 72,79 31,74 31,67 L n3 85,62 72,84 31,36 31,87 Trung bình 85,79 72,53 31,25 31,74 l ch chu n 0,59 0,50 0,55 0,12 a b c K t qu 85,79 ± 0,59 72,53 ± 0,59 31,25 ± 0,55 31,74 ± 0,12c *a, b, c, d c t ngày cho th y s khác bi t có ý ngh a th ng kê (p