CH NG 2 : NGUYÊN LIU VÀ PH NG PHÁP
3.3. Phân lp nm ment ngun nguyên li u/th c p hm Vit Nam
3.3.4 .c đ im sinh hóa
i) Kh n ng sinh protease ngo i bào
Các ch ng vi sinh v t đ c nuôi trên môi tr ng s a g y nh m kh o sát kh n ng sinh protease ngo i bào thông qua kh n ng s d ng s a g y và t o vùng th y phân xung quanh khu n l c.
Hình 3.11 cho th y n m men Y. lipolytica có kh n ng sinh protease ngo i bào m nh. Khi nuôi c y trên môi tr ng giàu protein, gene XPR2 c a n m men
Y. lipolytica đ c kích ho t, thúc đ y q trình sinh t ng h p và ti t protease ra môi
tr ng ni c y v i n ng đ có th đ t 1-2 g protease/L môi tr ng nuôi c y [83]. n m men, Y. lipolytica, protease đ c t ng h p b t đ u t pre-pro-protein v i chu i ng n ch a 13 acid amin, sau đó, chu i này đ c kéo dãn v i 10 dipeptides (X-Ala ho c X-Pro) và m t pro-region (122 acid amin) v i đ u carboxyl là Arg. Pro-region này ch a m t v trí glycosyl hóa đóng vai trị nh m t chaperone n i bào tham gia vào q trình ti t protease ra mơi tr ng ni c y [99]. Nghiên c u tr c đây c ng ch ra r ng n m men Y. lipolytica đ c cơng b có kh n ng sinh protease ngo i bào v i kh n ng th y phân casein trong s a g y sinh ra 300-350 mg leucine/100 ml s a g y [100].
N m men N3 phân l p t nem chua và n m men S2 phân l p ph ph m tôm th hi n kh n ng sinh tr ng t t trên môi tr ng s a g y, tuy nhiên vùng th y phân không rõ ràng cho th y kh n ng sinh protease ngo i bào c a 02 ch ng này y u h n nhi u so v i ch ng Y. lipolytica (Hình 3.11 và Hình 3.12). i u này có th do đi u ki n môi tr ng s a g y trong thí nghi m khơng ph i mơi tr ng t i u cho chúng sinh protease.
43
Trái: m t d i đ a Petri; ph i: m t trên đ a Petri
Hình 3.11. K t qu kh o sát kh n ng sinh protease sau 3 ngày c a n m men Y. lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c).
Các ký t khác nhau cho th y s khác bi t có ý ngh a th ng kê (p<0,05)
Hình 3.12. Ho t tính protease c a mơi tr ng sau 3 ngày nuôi c y n m men ii) Kh n ng sinh lipase ngo i bào ii) Kh n ng sinh lipase ngo i bào
Các ch ng vi sinh v t đ c nuôi trên môi tr ng Tween 80 nh m kh o sát kh n ng sinh lipase thông qua vi c th y phân lipid t o ra các acid béo. Các acid béo này
44
k t h p v i ion Ca2+ trong môi tr ng t o ra các tinh th mu i và hình thành vùng tinh th m đ c xung quanh sinh kh i.
Hình 3.13. K t qu kh o sát kh n ng sinh lipase quan sát trên đ a th ch và d i kính hi n vi sau 3 ngày c a n m men Y. lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c).
K t qu kh o sát kh n ng sinh lipase (Hình 3.13) cho th y n m men Y. lipolytica sinh lipase ngo i bào m nh nh t, ti p theo là n m men S2 và y u nh t là n m men N3.
Trong môi tr ng giàu lipid, gene LIP2 c a n m men Y. lipolytica đ c kích ho t, t ng q trình sinh enzyme lipase và ti t ra enzyme lipase ra mơi tr ng ngồi [83]. n m men này, lipase đ c ti t ra mơi tr ng ngồi theo con đ ng đ ng phiên mã (co-translational), phân t nh n d ng tín hi u (signal recognition particle) bám vào liposome, làm ch m quá trình d ch mã. Sau đó, ph c phân t nh n tín hi u d ng và liposome đ c g n vào th th protein màng t bào, t i đây, quá trình d ch mã b t đ u di n ra và lipase sinh ra đ c ti t ra ngồi mơi tr ng thông qua th th protein
45
[83]. M t khác, n m men Y. lipolytica khi đ c nuôi trên môi tr ng giàu amino acid và peptide t do nh peptone (thành ph n môi tr ng Tween s d ng trong thí nghi m này) s ti t ra l ng enzyme lipase cao nh t so v i khi nuôi c y trên môi tr ng ch a các ngu n nit khác nh casein [83]. ng th i, n m men Y. lipolytica
khi trong pha cân b ng s sinh ra l ng enzyme lipase cao nh t [93]. Lipase sinh ra t n m men Y. lipolytica đ c cơng b có kh n ng ch t béo t nhi u ngu n khác nhau nh ch t béo s a, d u cá, m cá,…[90, 100].
iii) Kh n ng sinh acid
B ng 3.2 th hi n s thay đ i pH c a môi tr ng YPD và YP sau khi ni c y các lồi n m men trong 2 ngày.
B ng 3.2. pH môi tr ng YPD và YP sau 2 ngày ni c y các lồi n m men
pH môi tr ng YPD YP
Ban đ u 5,61 7,24
Sau 2 ngày nuôi c y
N m men Y. lipolytica 5,44 6,96 N3 5,45 7,05
S2 5,56 7,14
Hình 3.14. K t qu kh o sát kh n ng sinh acid quan sát trên đ a th ch YPDA có b sung CaCO3 sau 2 ngày c a n m men Y. lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c).
Nhìn chung, pH c a các mơi tr ng gi m sau khi nuôi c y n m men, cho th y có s sinh acid trong canh tr ng. Tuy nhiên, m c đ gi m pH c a c 3 n m men s d ng th p, gi m 0,05-0,17 đ i v i môi tr ng YPD và gi m 0,10-0,28 trên môi tr ng YP. K t qu th nghi m trên môi tr ng th ch YPDA có b sung CaCO3 c ng cho th y c 3 n m men này th hi n kh n ng sinh acid ngo i bào th p (Hình 3.14). Trên
46
mơi tr ng YPD và YP có m t ngu n nit t yeast extract và peptone, do đó n m men
Y. lipolytica khơng r i vào tình tr ng đói nit , gi m kh n ng sinh acid c a nó [93]. Tuy nhiên, có th do đi u ki n nuôi c y, thành ph n mơi tr ng ch a thích h p đ các n m men này sinh acid ngo i bào.