CH NG 2 : NGUYÊN LIU VÀ PH NG PHÁP
2.5. Ph ng pháp phân tích
2.5.1. Ph ng pháp xác đ nh thành ph n hóa h c
Thành ph n hóa h c c a nguyên li u và ch t r n thu đ c sau quá trình x lýv i vi sinh v t ho c ch ph m enzyme đ c xác đ nh theo TCVN (B ng 2.3).
26
B ng 2.3. Ph ng pháp xác đ nh thành ph n hóa h c
Thành ph n Ph ng pháp Tiêu chu n
Protein Kjeldahl (AOAC, 2000)
Lipid Soxhlet (AOAC, 2000)
Tro t cháy tro trong lò nhi t đ 550°C÷600°C. TCVN 4327-86 m S y khô 105°C đ n kh i l ng không đ i (AOAC, 2000) Chitin Minh và c ng s (2017) [79]
* Hàm l ng protein = Hàm l ng Nit t ng x 6,25 Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.
2.5.2. Xác đ nh hi u qu kh khoáng
Hi u qu kh khoáng là t l ph n tr m c a l ng khoáng tách đ c so v i l ng khống có trong m u t ng ng tr c khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme, đ c xác đ nh theo công th c sau:
Trong đó:
DA (%): Hi u qu kh khoáng.
A0, AR: Hàm l ng tro (g/g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.
O, R: Kh i l ng (g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.
2.5.3. Xác đ nh hi u qu kh protein
Hi u qu kh protein là t l ph n tr m c a l ng protein tách đ c so v i protein có trong m u t ng ng tr c khi x lý b ng vi sinh v tho c ch ph m enzyme, đ c xác đ nh theo công th c sau:
27 Trong đó:
DP (%): Hi u qu kh protein.
P0, PR: Hàm l ng protein (g/g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme, xác đ nh b ng ph ng pháp Kjeldahl.
O, R: Kh i l ng (g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.
2.5.4. Xác đ nh hi u qu kh lipid
Hi u qu kh lipidlà t l ph n tr m c a l ng lipid tách đ c so v i l ng lipid có trong m u t ng ng tr c x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme, đ c xác đ nh theo công th c sau:
経詣 (%) =詣墜捲頚 伐 詣眺捲迎
詣墜捲頚 茅100
Trong đó:
DL (%): Hi u qu kh lipid.
L0, LR: Hàm l ng lipid (g/g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme, xác đ nh b ng ph ng pháp Soxhlet.
O, R: Kh i l ng (g) t ng ng c a m u tr c và sau khi x lý b ng vi sinh v t ho c ch ph m enzyme.
2.5.5. Ph ng pháp xác đ nh ho t tính enzyme
Nguyên lý: Casein b phân gi i trong môi tr ng ki m d i tác d ng c a protease
t o s n ph m là các đo n peptide ng n hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác đ nh l ng tyrosine và tryptophan hòa tan b i thu c th Folin [76].
Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.
2.5.6. Ph ng pháp x lý s li u
T t c các thí nghi m đ c b trí l p l i t 3 đ n 4 l n và ti n hành x lý s li u d a trên ph n m m Statgraphic centurion và Microsoft Excel 2016.
28
CH NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N 3.1. Thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm
K t qu phân tích thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm đ c th hi n b ng 3.1.
K t qu cho th y protein chi m hàm l ng cao nh t trong thành ph n ch t khô c a ph ph m, đ t 48,3±0,3%, phù h p v i k t qu công b trong tài li u [1, 9]. Hàm l ng protein c a ph ph m tôm trong nghiên c u này cao h n so v i v tôm h ng
Parapenaeus longirostris (27,6%) [21] và v tôm đuôi xanh Metapenaeus monoceros (30,0%) [19]. Trong v tôm, protein t n t i ch y u màng trong và màng trung gian, t o nên đ c ng cho v [25, 26]. màng trong, protein t o thành m ng l i bao b c chitin, do đó đ thu nh n chitin c n ph i lo i b protein.
Hàm l ng khoáng chi m 31,0% kh i l ng ch t khô trong v tôm, t ng đ ng v i k t qu công các nghiên c u c a Vo và c ng s (2020) [18], Younes và c ng s (2016) [19], Hamdi và c ng s (2018) [80]. Chúng t n t i màng trung gian và màng ngoài c a v [25, 26]. Vì v y, đ thu nh n chitin c n ph i lo i b khoáng.
Lipid chi m l ng nh trong ch t khô c a ph ph m tôm, 5,0% kh i l ng ch t khô, th p h n so v i k t qu công b trong nghiên c u tr c đây [1, 15]. Tuy nhiên, đ thu nh n chitin có kh n ng ng d ng trong nhi u l nh v c c n ph i lo i b béo.
Ph ph m tơm trong nghiên c u này có hàm l ng chitin đ t 17,6 ± 1,1% (kh i l ng ch t khô), phù h p v i công b c a Tan và c ng s (2021) [8] và Liu và c ng s (2020) [22] cho r ng hàm l ng chitin trong ph ph m tôm t 14 đ n 27% kh i l ng ch t khô. Hàm l ng chitin c a ph ph m tôm s d ng trong nghiên c u này cao h n so v i hàm l ng chitin c a v cua s Allopetrolisthes punctatus (7,9% kh i l ng ch t khô) [81] và tôm he Nam C c (2,0% kh i l ng ch t khô) [82]. T đó cho th y ph ph m tôm là ngu n thu nh n chitin ti m n ng.
B ng 3.1. Thành ph n hóa h c c a ph ph m tôm Thành ph n Hàm l ng (% kh i l ng ch t khô) Thành ph n Hàm l ng (% kh i l ng ch t khô) m 70,0 ± 0,4 Tro 31,0 ± 0,3 Lipid 5,0 ± 0,2 Protein 48,3 ± 0,3 Chitin 17,6 ± 1,1
29
3.2. Kh o sát kh n ng s d ng n m men đ x lý ph ph m tôm 3.2.1. Hi u qu kh protein
Hình 3.1 cho th y hi u qu kh protein ph ph m tôm c a n m men Y. lipolytica
cao nh t đ t 85,8 ± 0,6% sau 5 ngày lên men, l n l t cao h n 1,2 và 1,1 l n so v i hi u qu kh protein c a vi khu n B. subtilis và ch ph m enzyme Alcalase. Xu h ng này có liên quan đ n ho t tính protease c a mơi tr ng ni c y (Hình 3.2). Ho t tính protease càng cao thì hi u qu kh protein càng cao.
Các ký t khác nhau cho th y s khác bi t có ý ngh a th ng kê (p<0,05)
Hình 3.1. Hi u qu kh protein c a n m men Y. lipolytica, vi khu n B. subtilis và ch ph m enzyme Alcalase
Hi u qu kh protein c a n m men Y. lipolytica cao h n so v i hi u qu kh protein c a vi khu n B. subtilis không ch liên quan đ n hàm l ng, ho t tính protease sinh ra b i vi sinh v t mà còn ph thu c vào kh n ng di chuy n c a protease đ n c ch t, đ b n ho t tính protease [42]. N m men Y. lipolytica có kh n ng sinh acid h u c , phá v ph c Ca-protein-chitin trong màng trong và màng trung gian c a ph ph m tôm, lo i b m t s khoáng, d n đ n vi s i trong ph ph m hình thành các l tr ng, giúp protease d dàng đi sâu vào bên trong ph ph m ti p xúc v i protein, t ng hi u qu kh protein [22]. Trong khi đó, B. subtilis đ c công b không sinh acid h u c đ c sinh ra khi nuôi c y vi khu n này trên môi tr ng ph ph m tơm [42]. M t khác,
30
q trình th y phân protein phá v m ng l i protein ho c protein-chitin, gi i phóng ch t béo liên k t protein ho c ch t béo b b y b i m ng l i trong ph ph m tôm ra mơi tr ng ngồi, c n tr s ti p xúc gi a protease và c ch t protein [27]. Trong môi tr ng giàu lipid, gene LIP2 c a n m men Y. lipolytica đ c kích ho t, t ng q trình sinh enzyme lipase và ti t ra enzyme lipase ra mơi tr ng ngồi [83]. n m men này, lipase đ c ti t ra mơi tr ng ngồi theo con đ ng đ ng phiên mã (co-translational), phân t nh n d ng tín hi u (signal recognition particle) bám vào liposome, làm ch m q trình d ch mã. Sau đó, ph c phân t nh n tín hi u d ng và liposome đ c g n vào th th protein màng t bào, t i đây, quá trình d ch mã b t đ u di n ra và lipase sinh ra đ c ti t ra ngồi mơi tr ng thơng qua th th protein [83]. Lipase ngo i bào th y phân lipid, gi m s c n tr c a lipid đ i v i protease và protein. M t khác, quá trình th y phân protein b i protease ngo i bào t n m men Y. lipolytica gi i phóng amino acid và peptide vào môi tr ng nuôi c y, t ng s ti t enzyme lipase b i n m men Y. lipolytica [83]. Lipase ti t ra th y phân lipid, góp ph n t ng kh n ng th y phân
protein b i protease, nâng cao hi u qu kh protein c a n m men Y. lipolytica.
Hi u qu kh protein c a n m men Y. lipolytica sau 2 và 5 ngày nuôi c y cao h n 1,05-1,12 l n so v i hi u qu kh protein khi s d ng ch ph m enzyme Alcalase (Hình 3.1), m c dù ho t tính protease c a Alcalase cao h n 8,7 l n so v i ho t tính protease c a mơi tr ng ni c y n m men Y. lipolytica (Hình 3.2). i u này có th do s có m t c a s i chitin và chitin-protein l p màng trung gian c a v tôm b o v protein kh i s t n công c a protease [25]. Trong quá trình kh protein s d ng ph ng pháp sinh h c, vi sinh v t b tác đ ng b i chitin và protein có trong ph ph m tơm, d n đ n chúng sinh ra đ ng th i ho t tính protease và chitinase, do đó, hi u qu kh protein c a vi sinh v t t t h n so v i s d ng ch ph m Alcalase ch có ho t tính protease [84]. N m men Y. lipolytica đ c cơng b có kh n ng ti t endochitinase
(ScCts1p) [85], có th h tr protease d dàng ti p xúc v i protein màng trung gian và màng trong v tôm. Ng c l i, enzyme Alcalase b ch n b i Ca-protein-chitin trong màng trong và màng trung gian c a ph ph m tơm, khó ti p xúc v i protein, gi m hi u qu kh protein [26].
M c dù vi khu n B. subtilis c ng đ c cơng b có kh n ng sinh chitinase [86], tuy nhiên hi u qu kh protein c a nó th p h n 1,07-1,17 l n so v i hi u qu kh
31
protein c a ch ph m Alcalase (Hình 3.1). i u này có th do ho t tính enzyme, s t ng thích c a protein ph ph m v i trung tâm ho t đ ngc a enzyme, đi u ki n nuôi c y vi khu n ch a thích h p v i protease ngo i bào c a nó. M t khác, ho t tính protease c a enzyme Alcalase cao h n r t nhi u (13 l n) so v i ho t tính protease trong mơi tr ng ni c y vi khu n B. subtilis (Hình 3.2).
Các ký t khác nhau cho th y s khác bi t có ý ngh a th ng kê (p<0,05)
Hình 3.2. Ho t tính protease c a mơi tr ng nuôi c y n m men Y. lipolytica, vi khu n B. subtilis và c a ch ph m enzyme Alcalase
Hi u qu kh protein c a n m men Y. lipolytica trên v tôm t ng đ ng v i hi u qu kh protein b i các protease thô thu đ c t Bacillus safensis [80], Portunus segnis [80] và Bacillus mojavensis A21 [19]. Tuy nhiên khi so sánh v i hi u qu kh
protein c a các vi sinh v t trong các nghiên c u tr c đây, các vi sinh v t trong nghiên c u này th hi n hi u qu khơng cao. Ví d , hi u qu kh protein trên ph ph m cua s (Allopetrolisthes punctatus) b i Lactobacillus plantarum đ t 95,3% [81]. X lý v tôm hùm s d ng k t h p Serratia marcescens db11 và Lactobacillus plantarum cho hi u qu kh protein đ t 87,2% [27]. Nuôi c y đ ng th i Lactobacillus rhamnoides và Bacillus amyloliquefaciens (BA01) trên v tôm cho hi u qu kh protein đ t 96,8% [22]. Khi x lý v tôm v i Lactobacillus acidophilus FTDC3871
32
đi u ki n t i u, hi u qu kh protein đ t 76% [8]. K t qu nghiên c u c a Abirami và Nagarajan (2018) [20]cho th y hi u qu kh protein cao nh t c a B. licheniformis
và Lactobacillus plantarum (MTCC 1407) trên v tôm đ t l n l t 96% và 90%.
Exiguobacterium profundum đ t bi n th hi n hi u qu kh protein trên v tôm đ t 91,48% [25]. i u này có th do đi u ki n nuôi c y trong nghiên c u này ch a t i u cho s ti t protease ngo i bào c a các vi sinh v t. M c dù v y, chitin thu đ c có ch a m t ph n protein có kh n ng ng d ng cao trong lo i b và thu h i kim lo i n ng nh Cr3+ do s có m t c a protein t ng ho t tính liên k t kim lo i [84].
3.2.2. Hi u qu kh khoáng
Hinh 3.3 cho th y hi u qu kh khoáng c a n m men Y. lipolytica đ t 46,39 ± 0,52% sau 2 ngày lên men. Trong giai đo n đ u quá trình lên men, n m men sinh tr ng trên mơi tr ng khơng có ngu n nit d h p thu. K t qu là n m men r i vào tr ng thái đói nit , khi đó, enzyme adenosine monophosphate deaminase đ c kích ho t và chuy n hóa AMP, gi m cofactor c n thi t cho enzyme ATP-citrate lyase, d n đ n đ t đo n chu trình Krebs và s tích t c a các s n ph m trao đ i ch t trong giai đo n đ u chu trình, nh là acid citric [7]. Sau đó, acid citric trong ti th đi ra t bào ch t do trao đ i v i oxaloacetate trong t bào ch t tr c khi ti t ra canh tr ng thông qua ch t v n chuy n đ c hi u Yhm2p [7]. Ngoài ra,glycerol sinh ra t quá trình th y phân lipid b i enzyme ngo i bào có th dùng làm ngu n carbon cho n m men Y.
lipolytica phát tri n và sinh acid h u c [87, 88]. Nhóm tác gi l p lu n r ng b m t t
bào n m men hình thành v t lõm, các h p ch t a béo bám vào nh ng v trí này trên b m t t bào, t đó, đ c v n chuy n vào l i n i ch t thông qua h th ng v n chuy n trung gian màng [88]. Bên c nh đó, Papanikolaou và c ng s (2003) [89] k t lu n r ng s có m t c a stearin và glycerol t ng l ng acid citric sinh ra b i n m men
Y. lipolytica. Thêm vào đó, acid h u c sinh ra gi m pH c a môi tr ng nuôi c y (ban
đ u 7,96) và khi pH môi tr ng v trung tính s kích ho t gen đi u hòa t ng t ng h p Yhm2p, ch t v n chuy n acid citric ra kh i t bào [7]. Acid h u c nh acid citric ph n ng v i canxi carbonate (khống ch y u có trong ph ph m tơm [27]) chuy n thành d ng mu i h u c khơng tan, có th lo i b trong q trình r a [23]. Nghiên c u x lý n c th i trong quá trình r a cá ng cho th y hàm l ng mu i trong n c
33
th i gi m 66% sau khi x lý b ng n m men Y. lipolytica [90]. Tuy nhiên, khi kéo dài th i gian lên men đ n 5 ngày, hi u qu kh khoáng c a n m men Y. lipolytica t ng khơng đáng k (hình 3.6). i u này có th gi i thích là do trong q trình ni c y trên ph ph m tôm, n m men Y. lipolytica không ch ti t ra acid h u c mà còn sinh protease ngo i bào. Protease ngo i bào th y phân protein trong ph ph m t o thành acid amin t do, cung c p nit cho n m men, khi đó, n m men khơng cịn trong tr ng thái đói nit , gi m s tích t và ti t acid h u c .
Các ký t khác nhau cho th y s khác bi t có ý ngh a th ng kê (p<0,05)
Hình 3.3. Hi u qu kh khoáng c a n m men Y. lipolytica, vi khu n B. subtilis và ch ph m enzyme Alcalase
Vi khu n B. subtilis th hi n hi u qu kh khoáng th p, ch đ t 14,23 ± 0,34% sau 2 ngày nuôi c y và 15,96 ± 0,85% sau 5 ngày ni c y (Hình 3.3). K t qu này t ng đ ng v i nghiên c u c a Ghorbel-Bellaaj và c ng s , hi u qu kh khoáng c a B. subtilis A26 trên ph ph m tơm ch d i 40%, nhóm tác gi gi i thích ngun nhân là
do khơng có acid h u c đ c sinh ra khi nuôi c y vi khu n này trên môi tr ng ph ph m tơm [42].
Nhìn chung, hi u qu kh khoáng c a các vi sinh v t này th p h n so v i hi u qu kh khoáng c a các vi sinh v t khác trong các nghiên c u tr c đây. Ví d , hi u qu kh khoáng trên ph ph m cua s (Allopetrolisthes punctatus) b i Lactobacillus
34
plantarum đ t 99,6% [81]. X lý v tôm hùm s d ng k t h p Serratia marcescens