CH NG 2 : NGUYÊN LIU VÀ PH NG PHÁP
2.4. Ph ng pháp nghiên cu
2.4.1. Ph ng pháp x lý ph ph m tôm
Ph ph m tơm đ c nghi n t i kích th c kho ng 3mm b ng máy xay tr c vít và đ c b o qu n trong t đông nhi t đ -20°C. Tr c khi ti n hành thí nghi m x lý v i vi sinh v t ho c ch ph m Alcalase, m u đ c rã đơng, cân chính xác kh i l ng vào các bình tam giác đ y kín và đ c h p ti t trùng đi u ki n 121°C trong 15 phút.
2.4.2. Ph ng pháp phân l p và đ nh danh n m men
i) Ph ng pháp phân l p n m men
C y d ch ch a vi sinh v t đã pha lỗng trên mơi tr ng dinh d ng đ c tr ng
(YPDA và PDA có b sung kháng sinh chloramphenicol v i n ng đ 0,0001%). Nuôi vi sinh v t đã c y trong đi u ki n thích h p cho m c các khu n l c tách bi t nhau. C y tách t khu n l c m c tách bi t sang ng môi tr ng dinh d ng th ch nghiêng đ thu nh n ch ng vi sinh v t thu n khi t.
ii) Ph ng pháp đ nh danh n m men
Gi i trình t Sanger: Ph ng pháp này th c hi n d a trên k thu t ph bi n là “chain termination- k t thúc chu i” b ng vi c s d ng các deoxy nucleotide đã b ch nh s a làm m t nhóm hydroxyl đ u 3’ c a phân t đ ng. Nhóm 3’-OH đóng vai trị cho phép g n thêm m t nucleotide m i vào chu i. Khi m t dideoxynucleotide (ddNTP) đ c thêm vào chu i, vì khơng có nhóm 3’-OH nên m t nucleotide không đ c thêm vào, ph n ng t ng h p s d ng l i. Enzyme polymerase xúc tác ph n ng g n các deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) vào m ch đ n c a DNA đ kéo dài m ch v trí 3’- OH và d ng l i n u g n các ddNTP vào chu i. Trong m t ph n ng ch a c dNTP và ddNTP nên sau ph n ng t ng h p, hình thành các đo n DNA có đ dài khác nhau do ddNTP g n ng u nhiên làm d ng ph n ng. D a vào s sai khác v đ dài các đo n DNA hi n th trên b n gel sau đi n di đ xác đ nh trình t trong gene.
Trình t DNAđ c so sánh v i d li u th vi n ph chu n vi sinh v t GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
2.4.3. Ph ng pháp nuôi c y, xác đ nh đ c đi m hình thái c a t bào sinh d ng các ch ng n m men
23
i) Ph ng pháp ho t hóa gi ng
N m men Y. lipolytica VTCC 0544 và các n m men phân l p đ c ho t hóa trên mơi tr ng th ch YPDA.
Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.
ii) Ph ng pháp ti n t ng sinh
N m men Y. lipolytica VTCC 0544 và các n m men phân l p đ c ti n t ng sinh trên môi tr ng YPD(môi tr ng c p 1).
Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.
iii) Ph ng pháp t ng sinh
Sau khi ti n t ng sinh trong môi tr ng YPD 24 gi , các n m men ti p t c đ c t ng sinh trên môi tr ng YPD (môi tr ng c p 2).
iv) Ph ng pháp xác đnh m t đ t bào
M t đ t bào n m men trong môi tr ng l ng đ c xác đ nh b ng ph ng pháp đ m s t bào trong bu ng đ m Malassez [74].
Quy trình th c hi n đ c trình bày Ph l c A.
v) Ph ng pháp xác đ nh đ c đi m hình thái
Các ch ng n m men đ c c y trên môi tr ng th ch YPDA và PDA trên đ a petri, ng th ch nghiêng và lam 30ΔC. Sau 2 ngày, quan sát hình thái khu n l c và ghi nh n màu s c, hình d ng và tình ch t b m t. ng th i, đ c đi m t bào đ c quan sát d i kính hi n vi.
vi) Ph ng pháp xác đnh nhi t đ sinh tr ng t i đa
Các ch ng n m men đ c c y zigzag trên môi tr ng th ch nghiêng YPDA và YPA, nuôi c y các nhi t đ 30ΔC, 37ΔC và 42ΔC. Ki m tra kh n ng sinh tr ng sau 3 ngày.
2.4.4. Ph ng pháp kh o sát các tính ch t sinh hóa c a vi sinh v t
i) Kh o sát kh n ng s d ng các lo i đ ng
S n ph m c a q trình chuy n hóa các lo i đ ng có th là các lo i acid h u c , các lo i r u hay m t s các h p ch t khác khơng có tính acid. Q trình chuy n hóa có th t o ra khí, c ng có th khơng t o ra khí cacbonic. Mơi tr ng M10 dùng đ xác đ nh kh n ng chuy n hóa các lo i đ ng khác nhau c a vi sinh v t và đánh giá kh
24
n ng t o thành m t s s n ph m c a q trình nh acid và khí cacbonic. Acid t o ra trong môi tr ng s làm bromothymol blue có màu vàng. N u mơi tr ng khơng có acid, dung d ch s có màu xanh. Khí cacbonic đ c t o ra s b gi l i trong ng Durham [74].
ii) Kh o sát kh n ng sinh urease
C y n m men (1-2 vòng que c y) vào dung d ch 10 mM đ m kali phosphate (pH 6,0, ch a Phenol Red (20–50 mg/L) và urea (20 g/L)) và nuôi c y 37ΔC trong 5 gi . N m men có kh n ng sinh urease s chuy n màu môi tr ng thành màu đ đ m [75].
iii) Kh o sát kh n ng sinh protease ngo i bào
Các ch ng n m men đ c ki m tra kh n ng s n xu t protease ngo i bào trên đ a th ch s a g y [75]. N m men đ c c y trong đ a th ch s a g y và 30°C trong 3 ngày. Các vùng trong su t (vùng th y phân) đ c phát hi n xung quanh các khu n l c n m men n u nó có kh n ng sinh protease ngo i bào.
iv) Xác đ nh ho t đ enzyme trong dch nuôi t ng sinh
C y 1 vịng que c y vào các bình tam giác ch a 50mL môi tr ng nuôi c y l ng YPD. Các bình tam giác đ c l c t c đ 200 vòng/phút, nhi t đ phòng trong 48 gi . Sau th i gian , ly tâm tách sinh kh i, l y ph n d ch nuôi c y đ xác đ nh ho t đ enzyme b ng ph ng pháp Anson c i ti n [76].
v) Kh o sát kh n ng sinh lipase
Các ch ng n m men đ c ki m tra kh n ng s n xu t lipase trên đ a th ch môi tr ng Tweens 80. Các n m men đ c c y riêng bi t trong đ a th ch Tweens 80 và 30°C trong 3 ngày. Sau th i gian nuôi c y, ti n hành quan sát đ a th ch và đ ng th i soi d i kính hi n vi. N u n m men có ho t tính phân gi i lipid thì có th d dàng quan sát th y qu ng m đ c xung quanh các khu n l c. Khi quan sát b ng kính hi n vi, nh ng qu ng m đ c này bao g m các tinh th c a mu i canxi khơng hịa tan c a axit béo v a đ c hình thành [77].
vi) Kh o sát kh n ng sinh acid
Nuôi c y n m men trong đ a petri ch a mơi tr ng YPDA có b sung CaCO3 5 g/L. Vi sinh v t có kh n ng sinh acid s hịa tan CaCO3 hình thành vùng trong su t g n khu n l c.
25
Nuôi c y n m men trên môi tr ng l ng YPD ho c YP trong 2 ngày, ly tâm lo i sinh kh i và xác đ nh pH c a d ch canh tr ng.
2.4.5. Quy trình c y gi ng trên ph ph m tôm
Ph ph m tơm xay sau khi rã đơng đ c cân chính xác kho ng 10g cho vào erlen có ch a 20ml n c c t. Các erlen tôm đ c h p ti t trùng 121°C trong 15 phút.
Sinh kh i vi sinh v t sau khi nuôi t ng sinh đ c ly tâm tách sinh kh i v i t c đ 3000 vòng/phút trong 5 phút, r a l i b ng đ m Na2HPO4 – KH2PO4 (pH 5,6)3 l n.
C y chính xác l ng d ch treo t bào c n vào erlen tôm đã ti t trùng sao cho đ t m t đ 106, 107 ho c 108 cfu/g tôm. L c v i t c đ 200 vòng/phút, nhi t đ phòng trong vòng 2-5 ngày.
K t thúc quá trình ni c y, m u tơm đ c rây qua rây 140 mesh đ tách ra ph n v tơm cịn d . Ph n r n g m v tơm cịn sót l i đ c r a s ch v i n c và s y đ n kh i l ng không đ i vàxác đ nh hàm l ng protein, lipidvàtro.
i v i vi khu n B. subtilis, th c hi n t ng t nh trên v i m t đ 108 cfu/g tôm.
2.4.6. Quy trình s d ng enzyme alcalase x lý ph li u tơm
Quy trình x lý v tôm b ng enzyme Alcalase đ c tham kh o t công b c a Dan và c ng s (2017) [78]. C th , ph ph m tôm xay sau khi rã đơng đ c cân chính xác kho ng 10g cho vào erlen có ch a20ml n c c t. Các erlen tôm đ c h p ti t trùng 121°C trong 15 phút. Thêm 0,3% (v/w) ch ph m enzyme alcalase vào m u tôm đã ti t trùng trong đi u ki n vô trùng. M u đ c trong b đi u nhi t có l c đ o nhi t đ 50°C trong 6 gi .K t thúc q trình th y phân, m u tơm đ c rây qua rây 140 mesh đ tách ra ph n v tơm cịn d . Ph n r n g m v tơm cịn sót l i đ c r a s ch v i n c và s y 90ΔC đ n kh i l ng không đ i đ tr c khi xác đ nh hàm l ng protein, lipidvà tro.