Nghiên cứu quy trình sản xuất astaxanthin và β glucan để bổ sung vào thức ăn cho cá dĩa đỏ

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP SỞ KH&CN TP HCM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ASTAXANTHIN VÀ b-GLUCAN ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO CÁ DĨA ĐỎ Mã số đề tài: 123/2014/HĐ-SKHCN Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP Tp Hồ Chí Minh, năm 2017 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Trong tự nhiên, loài cá nhiệt đới thường có nhiều màu sắc khác đặc điểm làm cho chúng trở nên rực rỡ, thu hút làm cho chúng có giá trị kinh tế không phục vụ cho công nghiệp cá cảnh nước mà cịn có khả tiến tới xuất Astaxanthin b-glucan hai hợp chất có nhiều tiềm việc tăng màu sắc sức đề kháng cho cá cảnh sử dụng thành phần bổ sung thực phẩm cho số đối tượng thủy hải sản Trong nghiên cứu astaxanthin thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis nấm men hồng Rhodosporidium sp., b-glucan thu từ nấm men hồng, nấm men bia nấm men bánh mì Các kết thu cho thấy Haematococcus pluvialis có hai pha sinh trưởng tạo astaxanthin Trên mơi trường BG11 điều kiện sục khí với cường độ ánh sáng 2Klux, thời gian chiếu 12 25oC thời gian 14 ngày phát triển sinh khối tốt Trong giai đoạn tạo astaxanthin cho thấy sử dụng mơi trường BG11 ni tĩnh từ 18 ngày trở có tích lũy astaxanthin Khi tăng nhiệt độ lên 37oC thời gian bắt đầu tích lũy ngày thứ 10 đạt 2,68% ngày thứ 22 Khi ni mơi trường RM khơng có nitơ phospho với thời gian chiếu sáng 24 giờ/ngày hàm lượng astaxanthin tích lũy chiếm tới 2,67% trọng lượng tế bào sau 10 ngày gây stress Trong nấm men Rhodosporidium sp cho sinh khối có nhiều astaxanthin tối ưu nuôi cấy với tỷ lệ giống bổ sung 10% vào thời điểm 74 giờ, cụ thể hàm lượng astaxanthin 2309,17µg/l trọng lượng sinh khối khơ thu 6,1696 g/l hay 374,29 µg/g sinh khối khơ Ngồi xác định điều kiện thích hợp cho thu nhận hàm lượng β-glucan 64,87 % nồng độ NaOH 0,5M thời gian giờ, nhiệt độ 100oC, tỷ lệ mẫu:NaOH 1:5 Ngoài nấm men bia men bánh mì quy trình thích hợp để tách β-glucan từ vách tế bào nấm men cho men bia men bánh mì NaOH 1M, đun 1000C với tỉ lệ NaOH (ml) : vách tế bào (g) = : SUMMARY In the nature, tropical fish species have a variety of colors and it is this characteristic that makes them brighter, more attractive, and helps them to have economic value not only for the fish industry in domestic but also the ability to export Astaxanthin and b glucan are two compounds that have a great potential for increasing color and resistance to ornamental fish and have been used as a complement ingredient in food for some marine fish species In this study, astaxanthin was obtained from Haematococcus pluvialis and Rhodosporidium sp., b-glucan collected from pink yeast, yeast beer and bread yeast The results show that Haematococcus pluvialis has two phases of growth and produces astaxanthin The algae develops the best biomass in BG11 under aeration conditions with 2Klux light intensity, the duration of 12 hours at 25 ° C for the first 14 days During the astaxanthin synthesis period, its accumulation was observed during static culture of BG11 for 18 days The cumulative start time is the 10th day and reaches 2.68% at 22 days when temperature is 37oC When it cultured in RM medium which is no nitrogen and phosphorus with 24 hours per day Astaxanthin accumulates up to 2.67% of cell weight after algae was stress only 10 days Rhodosporidium sp the optimum biomass for astaxanthin was cultured with a 10% supplementation rate of 74 hours; specifically astaxanthin content was 2309.17 µg / l and dry biomass weight was 6.11696 g / L or 374.29 µg / g In addition, the appropriate conditions for the intake of β-glucan content were 64.87% at 0.5M NaOH for hours, at 100 oC, rate of sample and sodium hydroxyl was 1: In brewer's yeast and bread yeast, the appropriate procedure for separating β-glucan from yeast cell walls for both yeast was 1M NaOH, boiled at 100 oC for hours with sodium hydroxyl and cell wall were 1: MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH vii PHẦN MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nội dung Nghiên cứu điều kiện để nuôi cấy nấm men Rhodosporidium sp phát triển sinh khối mạnh đồng thời sinh tổng hợp nhiều astaxanthin 15 2.1.1 Nhân giống bậc môi trường lỏng 15 2.1.2 Khảo sát đường cong tăng trưởng hàm lượng astaxanthin chủng nấm men .16 2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố ảnh hưởng đến tích lũy sắc tố nấm men 17 2.1.4 Khảo sát quy trình ni cấy Rhodosporidium sp quy mô pilot môi trường rỉ đường 20 2.2 Nội dung Nghiên cứu điều kiện để nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis sinh tổng hợp nhiều astaxanthin điều kiện phịng thí nghiệm 21 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 23 2.2.2 Xác định đường cong sinh khối khô 24 2.2.3 Xác định đường cong tăng trưởng 25 2.2.4 Xác định thời điểm dừng trình gây stress 26 2.3 Nội dung Nghiên cứu quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp vi tảo Haematococcus pluvialis 26 2.3.1 Quy trình tách chiết astaxanthin từ nấm men sử dụng dung môi hữu .26 i 2.3.2 Phương pháp tách chiết astaxanthin từ Haematococcus pluvialis 27 2.3.3 So sánh phương pháp tách chiết bột thủy tinh DMSO 27 2.3.4 Phương pháp đánh giá hàm lượng astaxanthin Rhodosporidium sp vi tảo Haematococcus pluvialis 28 2.4 Nội dung Nghiên cứu quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men Rhodospridium sp từ bã men bia (Saccharomyces cerevisiae) 29 2.5 Nội dung Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn với việc tăng cường màu sắc cá dĩa đỏ Symphysodon sp (so sánh với sản phẩm astaxanthin thương mại) .30 2.5.1 Mục tiêu 30 2.5.2 Vật liệu thí nghiệm 30 2.5.3 Phương pháp thực 30 2.5.4 Chỉ tiêu theo dõi .31 2.6 Nội dung Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung b-glucan vào thức ăn với việc tăng cường sức đề kháng cá dĩa đỏ 31 2.6.1 Mục tiêu 31 2.6.2 Vật liệu thí nghiệm 32 2.6.3 Phương pháp thực 32 2.6.4 Chỉ tiêu theo dõi .33 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng nấm men Rhodosporidium sp 34 3.1.1 Khảo sát môi trường phù hợp cho sinh trưởng tạo sắc tố Rhodosporidium sp .34 3.1.2 Khảo sát điều kiện thích hợp cho ni cấy Rhodosporidium sp mơi trường Hansen .38 3.1.3 Khảo sát quy trình ni cấy Rhodosporidium sp quy mơ pilot môi trường rỉ đường .50 ii 3.2 Nghiên cứu điều kiện để nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis sinh tổng hợp nhiều astaxanthin điều kiện phịng thí nghiệm .67 3.2.1 Đường cong tăng trưởng .67 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện mơi trường đến tích lũy astaxanthin H pluvialis 71 3.2.3 Ảnh hưởng thiếu hụt dinh dưỡng đến tích lũy astaxanthin H pluvialis 78 3.2.4 Hiệu phương pháp tách chiết astaxanthin từ vi tảo 82 3.3 Nghiên cứu quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men Rhodospridium sp từ bã men bia (Saccharomyces cerevisiae) .85 3.3.1 Điều kiện thích hợp cho ly trích polysaccharide giàu β-glucan từ tế bào Rhodosporidium sp .85 3.3.2 Điều kiện thích hợp cho ly trích polysaccharide giàu β-glucan từ tế bào Saccharomyces cereviase 105 3.4 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn với việc tăng cường màu sắc cá dĩa đỏ Symphysodon sp (so sánh với sản phẩm astaxanthin thương mại)136 3.5 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung b-glucan vào thức ăn với việc tăng cường sức đề kháng cá dĩa đỏ 139 3.5.1 Kết ảnh hưởng β-glucan đến số lượng bạch cầu cá dĩa 139 3.5.2 Kết ảnh hưởng β-glucan lên tỉ lệ sống cá bị nhiễm khuẩn .140 Chương −KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 142 4.1 Kết luận 142 4.2 Đề nghị 143 Tài liệu tham khảo 145 iii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần môi trường BG11, RM, F2 21 Bảng 2.2: Một số thông số ảnh hưởng đến sinh trưởng H.pluvialis 24 Bảng 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm .30 Bảng 3.1: Lượng sinh khối khơ thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) thời điểm nuôi cấy khác 39 Bảng 3.2: Lượng sinh khối khơ thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) pH môi trường khác 40 Bảng 3.3: Lượng sinh khối khô thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường ni cấy (mg/l) nồng độ D-glucose khác 42 Bảng 3.4: Lượng sinh khối khô thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) nồng độ pepton khác 44 Bảng 3.5: Lượng sinh khối khô thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường ni cấy (mg/l) nghiệm thức môi trường khác 46 Bảng 3.6: Lượng sinh khối khô thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường ni cấy (mg/l) nồng độ MgSO4 khác 48 Bảng 3.7: Lượng sinh khối khô thu (g), hàm lượng astaxanthin tính sinh khối khơ (mg/g) thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) nồng độ KH2PO4 khác 49 iv Bảng 3.8: Ảnh hưởng hàm lượng đường tổng rỉ đường đến hàm lượng astaxanthin .51 Bảng 3.9: Ảnh hưởng hàm lượng urea đến hàm lượng astaxanthin 53 Bảng 3.10: Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4 đến hàm lượng astaxanthin 56 Bảng 3.11: Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến hàm lượng astaxanthin 58 Bảng 3.12: So sánh đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nấm men Rhodosporidium sp môi trường Hansen biến đổi rỉ đường bổ sung dinh dưỡng .61 Bảng 3.13: Hàm lượng astaxanthin thu chủng nấm men Rhodosporidium sp môi trường Hansen biến đổi rỉ đường bổ sung dinh dưỡng vào pha suy tàn 62 Bảng 3.14: Hàm lượng sinh khối khô astaxanthin thu nhận chủng nấm men Rhodosporidium sp môi trường rỉ đường với tỷ lệ giống vào đầu pha suy tàn 67 Bảng 3.15: Hàm lượng astaxanthin chiết sau 22 ngày ủ 37 oC 77 Bảng 3.16: Hàm lượng astaxanthin thu sau 10 ngày gây stress môi trường RM thiếu nitơ phospho với thời gian chiếu sáng 24 81 Bảng 3.17: Hàm lượng astaxanthin chiết bột thủy tinh DMSO 82 Bảng 3.18: Giá trị OD bước sóng khác 84 Bảng 3.19: Hàm lượng protein ly giải tế bào nấm men NaOH theo thời gian 85 Bảng 3.20: Khối lượng mẫu bước ly giải tế bào nấm men 87 Bảng 3.21: Hàm lượng glucose tủa (mg/ml) khảo sát nồng độ NaOH ly trích polysaccharide 87 Bảng 3.22: Hàm lượng glucose dịch (mg/ml) hàm lượng protein dịch (mg/ml) khảo sát nồng độ NaOH ly trích polysaccharide 88 Bảng 3.23: Hàm lượng glucose tủa (mg/ml) khảo sát thời gian ly trích polysaccharide 90 Bảng 3.24: Hàm lượng glucose dịch (mg/ml) hàm lượng protein dịch (mg/ml) khảo sát thời gian ly trích polysaccharide 91 v Bảng 3.25: Hàm lượng glucose tủa (mg/ml) khảo sát nhiệt độ ly trích polysaccharide 94 Bảng 3.26: Hàm lượng glucose dịch (mg/ml) hàm lượng protein dịch (mg/ml) khảo sát nhiệt độ ly trích polysaccharide 95 Bảng 3.27: Hàm lượng glucose tủa (mg/ml) khảo sát tỷ lệ mẫu:NaOH (ml:ml) ly trích polysaccharide 97 Bảng 3.28: Hàm lượng glucose dịch (mg/ml) hàm lượng protein dịch (mg/ml) khảo sát tỷ lệ mẫu:NaOH (ml:ml) ly trích polysaccharide .101 Bảng 3.29: Trọng lượng khô quy trình tách chiết 101 Bảng 3.30: Hàm lượng β-glucan định lượng có mẫu POLY1 POLY2 101 Bảng 3.31: Hiệu suất thu vách tế bào polysaccharide 113 Bảng 3.32: Hàm lượng đường khử PL 3, protein đường khử dịch sau li trích nhiệt độ khác 127 Bảng 3.33: Hàm lượng đường khử PL 3, protein đường khử dịch sau li trích thời gian khác vách tế bào nấm men bánh mì 129 Bảng 3.34: Hàm lượng đường khử PL 3, protein đường khử dịch sau li trích tỉ lệ vách tế bào (g) / thể tích (ml) NaOH 130 Bảng 3.35: Hiệu suất trình tách chiết .132 Bảng 3.36: Hiệu suất thu β-glucan .135 Bảng 3.37 Điểm số màu sắc cá dĩa đỏ nghiệm thức .136 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1: Hệ thống nuôi tảo dạng ống dạng túi Israel Hawaii Giai đoạn chuyển màu từ xanh sang đỏ giai đoạn tích lũy astaxanthin điều kiện stress kết hợp cường độ chiếu sáng mạnh điều kiện tự nhiên Hình 2.1: Mơ hình ni cấy nấm men lít 20 Hình 2.2 Mơ hình ni cấy nấm men 10 lít 21 Hình 2.3 Mơ hình tăng sinh sinh khối H pluvialis 23 Hình 2.4 Quạt màu dùng so sánh màu sắc cho thịt cá hồi 31 Hình 3.1: Đồ thị đường cong tăng trưởng Rhodosporidium sp môi trường YM Hansen 35 Hình 3.2: Hình thái tế bào (1) khuẩn lạc (2) Rhodosporidium sp môi trường YM (A) môi trường Hansen (B) Tế bào quan sát với độ phóng đại x400 .36 Hình 3.3: Sắc ký đồ dịch chiết sắc tố Rhodosporidium sp hai môi trường khác 37 Hình 3.4: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu nuôi cấy nấm men môi trường YM Hansen 38 Hình 3.5: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu nuôi cấy nấm men môi trường Hansen khoảng thời gian nuôi cấy khác 39 Hình 3.6: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu nuôi cấy nấm men môi trường Hansen pH nuôi cấy khác 41 Hình 3.7.1: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu nuôi cấy nấm men môi trường Hansen nồng độ glucose nuôi cấy khác 43 Hình 3.7.2: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu nuôi cấy nấm men môi trường Hansen nồng độ pepton nuôi cấy khác .45 vii 1.2 Nuôi Rhodosporidium sp hệ thống pilot 2L Chủng Rhodosporidium sp Tăng sinh môi trường Hansen Tỷ lệ giống 10 % Nuôi cấy pilot 2L môi trường rỉ đường Thông số nuôi cấy: - Urea: 0.5g/l - MgSO4.7H2O: 3g/l - Hàm lượng đường tổng 25 g/l Thu sinh khối Sinh khối khô nấm men Rhodosporidium sp sấy khô Sơ đồ P1: Quy trình ni cấy Rhodosporidium sp hệ thống pilot lít 1.3 Thuyết minh quy trình ni cấy nấm men Rhodosporidium sp Chủng Rhodosporidium sp hoạt hóa mơi trường Hansen, ni lắc 200 vịng/ phút 48 Lúc tế bào đạt mật độ khoảng 10-14x106 tế bào/ml Hút 10% giống từ môi trường Hansen cho vào môi trường rỉ đường (hệ thống pilot 2L) với thơng số mơi trường ni cấy thích hợp: MgSO4.7H2O: 3g/l, Urea: 0,5 g/l, Hàm lượng đường tổng 25 g/l Nuôi hệ thống pilot 2L 86 giờ, sau thu sinh khối Sấy mẫu bảo quản Kết nuôi hệ thống pilot 2l ta thu nhận được: Trọng lượng sinh khối khô 6,1696 g/l hàm lượng astaxanthin 2309,17 (µg/l) QUY TRÌNH NI CẤY TẢO Haematococcus pluvialis Giai đoạn 1: Tăng trưởng sinh khối tế bào tảo Chủng Haematococcus pluvialis Thông số nuôi cấy: Tăng sinh môi trường RM - Tỷ lệ giống 10 % Nuôi cấy 14 ngày môi trường BG11 đường Giai đoạn 2: Stress tăng tích lũy Astaxanthin - Nhiệt độ: 25°± 3°C Cường độ chiếu sáng 2000 lux Chu kỳ chiếu sáng sáng: tối 12: 12 Sục khí Thơng số ni cấy: Ni cấy 10 ngày môi trường RM - Ly tâm thu sinh khối - Nhiệt độ: 25°± 3°C Cường độ chiếu sáng 2000 lux Chu kỳ chiếu sáng: 24 giờ/ngày Thiếu hụt Nitơ, phospho Sinh khối tảo sấy khô Sơ đồ P2: Quy trình ni cấy tảo Haematococcus pluvialis Thuyết minh quy trình ni cấy tảo Haematococcus pluvia Giai đoạn 1: lựa chọn môi trường tăng trưởng để đạt mật độ tế bào sinh khối cực đại Chủng Haematococcus pluvialis cung cấp Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II Chủng tảo nuôi cấy môi trường RM điều kiện: nhiệt độ 25±3°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, chu kì chiếu sáng (sáng:tối) 12:12, có sục khí để đảo tảo 200 ml tế bào H pluvialisđược bổ sung vào 2000 ml môi trường BG-11 với mật độ ban đầu khoảng x 106 tế bào/ml (tỷ lệ cấy giống 10%) Quá trình ni cấy thực chai duran có ống dẫn khí vào Khí sau bơm vào qua hệ thống lọc bụi syring lọc khuẩn, cuối vào môi trường nuôi tảo ống thủy tinh hấp khử trùng Các nghiệm thức sục khí để đảo tảo, nuôi cấy 25±3°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux cách sử dụng hệ thống đèn led chu kỳ chiếu sáng sáng: tối 12: 12 Sau 14 ngày nuôi cấy đánh giá tăng trưởng vi tảo thông qua mật độ tế bào lượng sinh khối tích lũy cho thấy mật độ tế bào đạt cao khoảng 108 tế bào/ml tảo H pluvialis Sau đem ly tâm thu sinh khối chuyển sang môi trường Rm thiếu hụt nitơ, phốt nhằm gây stress tích trữ astaxanthin Giai đoạn 2: stress nhằm tích lũy astaxanthin nhiều Vi tảo nuôi môi trường BG-11 (giai đoạn 1), sau 14 ngày tiến hành ly tâm thu sinh khối tảo, mật độ tế bào khoảng 108 tế bào/ml, bổ sung vào 100ml môi trường RM thiếu hụt nitơ, phốt chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày nhằm gây stress liên tục 10 ngày, tế bào phát triển thành nang bào trưởng thành hàm lượng astaxanthin tích đạt chiếm 2,67 % trọng lượng khơ Bảng P1: Thành phần môi trường BG11, RM Thành phần môi trường NaNO3 NaH2PO4 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O Acid citric Ammonium ferric cirate EDTA-Na2 EDTA Na2CO3 NaCl H3BO3 MnCl2 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2 O (NH4)Mo7O24.4 H2O CuSO4.5H2O Co(NO3)2.6H2O CoCl2.6H2O FeCl3.6H2O Vitamine B12 Vitamine B1 Biotin Môi trường RM thiếu (mg/l) 10 58,5 - BG11(mg/l) RM(mg/l) 1500 400 750 36 300 80 20 10 58,5 - - - 100 200 2,86 1,81 0,22 7,5 20 0,3 1,5 0,1 7,5 20 0,3 1,5 0,1 0,39 - - - 0,3 0,3 0,08 0,05 - 0,08 0,2 17 0,0005 (g/l) 0,1 (g/l) 0,0005 (g/l) 0,08 0,2 17 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ASTAXANTHIN từ Rhodosporidium sp Quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp kết hợp bột thủy tinh với acid chlohydric: Sinh khối khô nấm men: 20 g Bột thủy tinh Nghiền nấm men với bột thủy tinh (tỷ lệ 1W:3W) Thêm HCl 4.5N (25V:1W) Ủ nhiệt độ 800C 20 phút Acetone Thu nhận astaxanthin astaxanthin Sơ đồ P3: Quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp Thuyết minh quy trình thu nhận tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp Cân (m=20g) sinh khối khô nấm men Rhodosporidium sp nghiền với bột thủy tinh phút với tỷ lệ tương ứng (1w: 3w) tương ứng 60g bột thủy tinh, sau ngâm với HCl 4.5N với tỷ lệ mẫu acid 1w:25v tương ứng 500ml HCl, ủ nhiệt độ 80 C 20 phút, sau đem ngâm với dung mơi acetone đuổi dung môi thu astaxanthin dạng sệt với hiệu suất tách chiết 5.8821% độ ẩm nguyên liệu 11.7429% QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO Haematococcus pluvialis Sơ đồ P4: Quy trình thu nhận astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis Thuyết minh quy trình thu nhận astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis: Ø Tách chiết bột thủy tinh – HCl – acetone Nghiền 10g sinh khối tảo khô với 100g bột thủy tinh, xử lý với lít HCl 4N 70°C 10 phút Mẫu làm lạnh ly tâm 5000 vịng/phút 5 phút Sau đó, mẫu rửa hai lần nước cất huyền phù với 500ml acetone giờ, phần mẫu chiết ly tâm 5000 vòng/phút phút, thu dịch (chiết 2-3 lần đến phần cặn hết sắc tố) Đuổi hết dung môi thu astaxanthin dạng sệt Lưu ý q trình tách chiết thực nơi ánh sáng Ø Tách chiết bột thủy tinh - DMSO – acetone Nghiền 10g sinh khối tảo khô với 100g bột thủy tinh, ủ với 200ml DMSO 70°C 10 phút Ly tâm 5000 vòng/ phút phút thu dịch chứa DMSO Thêm vào 50 ml acetone, nghiền kỹ ly tâm 5000 vòng /phút phút, thu dịch (chiết nhiều lần đến dịch khơng cịn sắc tố) Đuổi hết dung mơi thu astaxanthin dạng sệt Lưu ý trình tách chiết thực nơi ánh sáng Xác định hàm lượng astaxanthin: Để xác định hàm lượng astaxanthin mẫu thu lấy phần dịch thu từ phương pháp pha với ete dầu hỏa đem đo độ hấp thụ dịch chiết bước sóng 468 nm Hàm lượng astaxanthin (mg/g sinh khối khơ) tính theo cơng thức Kelly-Harmon: X=A468*V*104/E1%1cm * G (CT1) A468nm: độ hấp thu dịch chiết sắc tố dung mơi petrolium ether bước sóng 468nm V (ml): tổng thể tích dịch chiết E1%1cm: độhấpthucủadịchastaxanthin 1% dung môi PE (cuvette=1cm) (E=2100) 10 Kết hàm lượng astaxanthin (mg/g sinh khối khô) thu nhận phương pháp bột thủy tinh- HCl 1,01 ± 0,02 % trọng lượng khô tương đương 20,16% so với hàm lượng astaxanthin tảo 5% sinh khối khô bột thủy tinh - DMSO 1,027 ± 0,01 % trọng lượng khô tương đương 20,54% so với hàm lượng astaxanthin tảo 5% sinh khối khô 11 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT β-GLUCAN TỪ THÀNH TẾ BÀO NẤM MEN Rhodosporidium sp Sơ đồ P5: Quy trình khảo sát ly trích β-glucan từ Rhodosporidium sp Thuyết minh quy trình thu nhận β-glucan từ Rhodosporidium sp Nguyên tắc: Bản chất β-glucan polysaccharide, phương pháp tách chiết β-glucan dựa nguyên lý chung tách chiết polysaccharide Chúng sử dụng sodium hydroxide (NaOH) để tách chiết β-glucan Sau tiến hành ly tâm thu hồi tinh chế Phương pháp hóa học thích hợp với mẫu phân tích chứa lượng glucan tổng số lớn 20 % Theo nghiên cứu Mỹ, phương pháp đạt hiệu suất thu hồi 50 – 12 80 %, quy trình đơn giản, khơng tốn nhiều thời gian chi phí phương pháp sử dụng enzyme β-1,3-glucanase Bước 1: Ly giải thành tế bào nấm men Trong dung dịch NaOH 4%, tỷ lệ mẫu:NaOH 1w:10V nhiệt độ 50oC, Sau ly tâm rửa với ethanol đến hết màu Khi kết thúc bước ly giải, lượng β-glucan phóng thích dịch nổi, nên ký hiệu POLY2, thu nhận cách tủa ethanol (cồn) để tận thu Bước 2: Tách polysaccharide từ thành tế bào: NaOH 0.5M, thời gian giờ, tỷ lệ mẫu:NaOH 1:5, nhiệt độ 100 oC thu POLY1 Bước 3: Sau ly trích polysaccharide ta tiến hành bước tinh loại tạp chất, khử màu trung hòa mẫu Hiệu suất quy trình thí nghiệm hàm lượng β-glucan tính khối lượng sinh khối khô nấm men mẫu POLY1, POLY2 9,31 %, 0,69 % (g/g) hàm lượng β-glucan 64,87% 18,18% (w/w) 13 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT β-GLUCAN TỪ THÀNH TẾ BÀO NẤM MEN BIA VÀ NẤM MEN BÁNH MÌ Sơ đồ P6: Quy trình khảo sát ly trích β-glucan từ nấm men bia nấm men bánh mì Ghi chú: PL 1: polysaccharide sau ly trich tử vách tế bào men bia PL 2: polysaccharide dịch sau li giải tế bào nấm men bia PL 3: Polysaccharide sau ly trích từ vách tế bào men bánh mì PL 4: Polysaccharide dịch sau li giải tế bào men bánh mì 14 Thuyết minh quy trình thu nhận β-glucan từ nấm men bia nấm men bánh mì - Tế bào nấm men Bia men Bánh Mì rửa lần với dung dịch muối ăn 5% để loại hết tạp chất, đường, protein Sau sấy khô đến độ ẩm 10% nhiệt độ 80OC Chế phẩm sấy khô lưu trữ đến sử dụng cho tách chiết, thu nhận β-glucan - Tách chiết thu nhận β-glucan cách cho tế bào nấm men ly giải nấm men cách cho dung dịch NaOH 4% vào tế bào nấm men với tỉ lệ 10 : (w (g) : v (ml)) khuấy 500C ( tế bào nấm men bắt đầu li giải) với nấm men Bia men bánh mì 22 21 để thu nhận polysaccharide vách tế bào nấm men Ly tâm thu tủa Dịch tủa với ethanol 96% với tỷ lệ 1V:4V để tận thu PL2 PL4 Tủa thu tiến hành ly trích β-glucan (PL1 PL3) cách đun vách tế bào nấm men bia nấm men bánh mì với NaOH 1M 1000C với tỉ lệ vách tế bào (g) NaOH 1M (ml) 1w : 5V Sau li tâm 4000vòng /phút 10 phút thu tủa sản phẩm βglucan Chế phẩm đem sấy khô đến độ ẩm nhỏ 10% Bảng P2: Hiệu suất thu β-glucan Men Glucan tổng số α-glucan β-glucan (%w/w) (%w/w) (%w/w) Mẫu Polysaccharide 46,74 ± 0,13 2,04 ± 0,04 44,70 ± 0,17 Polysaccharide 20,39 ± 0,52 3,35 ± 0,07 17,04 ± 0,58 67,13 5,39 61,74 Polysaccharide 48,67 ± 0,31 2,39 ± 0,02 46,59 ± 0,31 Polysaccharide 12,08 ± 0,42 2,41 ± 0,12 9,80 ± 0,30 60,75 4,80 56,39 Bia Tổng PL1 PL2 Bánh mì Tổng PL3 PL4 15 MỘT SỐ HÌNH ẢNH SẢN PHẨM Hình P3 Chế phẩm Beta Glucan Hình P2 Chế phẩm Astaxanthin - Độ ẩm chế phẩm astaxanthin (%): 5,53 ± 0,40 - Độ ẩm chế phẩm beta glucan (%): 8,50 ± 0,69 16 ... Nội dung Thức ăn bổ sung astaxanthin chiết xuất (sản phẩm đề tài) với lượng 90 mg/kg thức ăn Thức ăn bổ sung astaxanthin bán thị trường với ĐC lượng 90 mg/kg thức ăn Thức ăn không bổ sung astaxanthin. .. astaxanthin vào thức ăn cho cá dĩa đỏ 2.6 Nội dung Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung b -glucan vào thức ăn với việc tăng cường sức đề kháng cá dĩa đỏ 2.6.1 Mục tiêu Thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu β- glucan. .. việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn với việc tăng cường màu sắc cá dĩa đỏ Symphysodon sp (so sánh với sản phẩm astaxanthin thương mại)136 3.5 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung b -glucan vào thức ăn