VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn bị cao chiết bài thuốc
Bài thuốc NDL bao gồm các thành phần như thân khô Địa long (100 g), hạt Đậu đen (200 g), hạt Đậu xanh (200 g) và thân lá Bồ ngót khô (400 g) Địa long được cung cấp bởi công ty Domesco, trong khi các dược liệu khác đến từ bệnh viện Y học cổ truyền TP.HCM Bài thuốc được chiết xuất theo phương pháp truyền thống bằng hệ thống sắc thuốc tự động của bệnh viện, với quy trình cân, trộn nguyên liệu và ngâm trong nước khoảng 20 phút trước khi đun.
Sau 3 giờ trong hệ thống sắc thuốc tự động, dịch chiết đạt nồng độ 1 g dược liệu thô/ml và được đông khô thành bột, bảo quản ở -70 o C Liều sử dụng được tính toán dựa trên liều uống của người, qui đổi cho chuột gấp 12 lần Liều uống cho người là 180 ml nước sắc bài thuốc/người/57,7 kg, tương ứng với 0,1 g bột đông khô/kg Do đó, liều thử nghiệm trên chuột được xác định là 1,2 g/kg, và trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai liều là 1,2 g/kg (NDL1) và 2,4 g/kg (NDL2).
Hình 2.1 Các vị thành phần của bài thuốc NDL
Mô hình động vật
Chuột nhắt trắng Swiss albino, trọng lượng 22 ± 2 g, 5 - 6 tuần tuổi, giống đực và khỏe mạnh, được cung cấp bởi Viện Pasteur TP.HCM Sau khi vận chuyển, chuột được nuôi ổn định trong khoảng 7 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm Chúng được nuôi trong lồng nhựa với chu kỳ ánh sáng 12 giờ sáng/12 giờ tối Thức ăn cho chuột là cám viên do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp, bao gồm bột gạo, bột bắp và các vitamin bổ sung.
Thí nghiệm in vivo được thiết kế dựa trên hướng dẫn thử nghiệm dược lý trên mô hình động vật Để đánh giá hoạt tính miễn dịch và kháng oxy hóa, Levamisole và Silymarin được sử dụng làm đối chứng dương tương ứng Tổng cộng 90 chuột được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô gồm 15 chuột, bao gồm lô bình thường (C) không tiêm CY và chỉ uống nước cất.
Trong nghiên cứu này, chuột được chia thành các lô khác nhau để kiểm tra hiệu quả của các chất thử nghiệm Lô bệnh lý (CY) bao gồm chuột tiêm CY với liều 150 mg/kg thể trọng vào ngày 1 và cho uống nước cất từ ngày 1 đến ngày 5 Các lô thử nghiệm (NDL1, NDL2) bao gồm chuột tiêm CY vào ngày 1 và uống NDL với liều 1,2 g/kg và 2,4 g/kg thể trọng Lô đối chứng dương (Leva) được tiêm CY vào ngày 1 và uống Levamisol (Bio-leva) với liều 30 mg/kg thể trọng Lô đối chứng dương (Sily) cũng tiêm CY vào ngày 1 và uống Silymarin (Sigma) với liều 100 mg/kg thể trọng Thể tích cho chuột uống không vượt quá 0,2 mL/10 g thể trọng, trong khi thể tích tiêm CY là 0,1 mL/10 g thể trọng chuột Thời gian cho uống hoặc tiêm được thực hiện trong khoảng từ 8-10 giờ sáng.
Trước khi bắt đầu quá trình tạo mô hình (ngày 0), chuột được lấy máu tĩnh mạch đuôi để xác định số lượng bạch cầu tổng (WBC) và công thức bạch cầu, bao gồm bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và bạch cầu ưa axit Mỗi ngày, chuột được cân trước khi cho ăn và uống thuốc Sau khoảng 2 giờ từ khi uống thuốc vào ngày thứ 5, các mẫu được thu thập để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
- Máu tĩnh mạch đuôi: xác định trị số WBC, công thức bạch cầu,
- Máu tim để xác định phần trăm bạch cầu lympho TCD4, TCD8 và lượng cytokine IL-2 và IL-6
- Gan, lách và tuyến ức được thu nhận, rửa qua với nước muối sinh lý NaCl 0,9
Phần trăm gan, lách hoặc tuyến ức được xác định bằng cách chia trọng lượng của lách hoặc tuyến ức cho trọng lượng cơ thể chuột nhân với 100 Phương pháp này sử dụng giấy thấm để đo lường chính xác trọng lượng.
- Gan sau khi cân sẽ được cắt 1 mảnh nhỏ khoảng 0,1 g để xác định sự biểu hiện gene CAT, SOD1 và SOD2.
Phần gan còn lại được hòa trong dung dịch đệm KCl 1,15 % (w/v) theo tỉ lệ 1 g gan/10 mL KCl Sau đó, mẫu gan được đồng nhất để tiến hành các thí nghiệm xác định hàm lượng protein tổng, hàm lượng MDA và hàm lượng glutathione.
Chuột được nuôi và thử nghiệm mô hình tại Khoa Y học cổ truyền, trường Đại học
Tại Bộ môn Di truyền, trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, các thử nghiệm được tiến hành nhằm xác định các chỉ số quan trọng như số lượng bạch cầu, số lượng bạch cầu TCD4 và TCD8, nồng độ IL-2, IL-6, nồng độ MDA, GSH, cùng với sự biểu hiện gene SOD1, SOD2, và CAT.
Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng trong máu chuột
WBC được xác định thông qua phương pháp đếm tươi bằng buồng đếm hồng cầu, sau khi hồng cầu được phá bằng acid acetic 3% (v/v) Kết quả số lượng bạch cầu được tính theo công thức cụ thể.
Trong đó: N: số bạch cầu đếm được trong 4 ô; 20: độ pha loãng và 1/10 mm: chiều cao từ buồng đếm đến lamelle
Phương pháp xác định một số loại bạch cầu trong máu chuột
Công thức bạch cầu, bao gồm bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và bạch cầu ưa axit, được xác định thông qua phương pháp nhuộm Giemsa Thuốc nhuộm Giemsa có khả năng bắt màu các hạt nguyên sinh chất, giúp phân biệt các loại tế bào bạch cầu dựa trên sự bắt màu, hình dạng nhân và kích thước tế bào.
- Bạch cầu lympho: có hai loại là lympho T và lympho B Tế bào tròn, nhân
13 hình cầu, nguyên sinh chất hẹp (hình 2.1 – B)
- Bạch cầu Mono: tế bào lớn, trũn, kớch thước 20-25 àm, nhõn hỡnh bầu dục hoặc hạt đậu (hình 2.1 – C)
- Bạch cầu trung tớnh: kớch thước 10-15 àm, nhõn thắt eo, chia thựy, nguyờn sinh chất cú hạt trũn 0,2-0,4 àm (hỡnh 2.1 – A)
- Bạch cầu ưa axit: kớch thước 10-15 àm, nhõn thắt eo, chia thựy Nguyờn sinh chất cú hạt to, trũn đều khoảng 1 àm (hỡnh 2.1 – D)
Hình 2.2 Đặc điểm hình thái của các tế bào bạch cầu chuột (đực) quan sát bằng phương pháp nhuộm Giemsa (100X) A - Bạch cầu trung tính, B - Bạch cầu lympho,
C - Bạch cầu đơn nhân, D – Bạch cầu ưa axit, E – Hồng cầu và F – Tiểu cầu [48]
Một giọt máu chuột được đặt lên lam kính và kéo dài thành vệt mỏng Sau khi máu khô, lam kính được ngâm trong ethanol tuyệt đối trong 3 phút và để khô tự nhiên Tiếp theo, lam kính được ngâm trong thuốc nhuộm Giemsa với nồng độ 3,8 g/L.
Sau 45 phút, lame được rửa dưới vòi nước chảy, để khô và quan sát dưới kính hiển vi tại vật kính x100 Tại đây, phần trăm mỗi loại bạch cầu trong tổng số 100 tế bào bạch cầu được xác định Để tính toán số lượng mỗi loại tế bào bạch cầu, người ta nhân phần trăm loại tế bào đó với tổng số lượng bạch cầu (WBC).
Phương pháp xác định phần trăm tế bào bạch cầu lympho T CD4 và T CD8 trong máu chuột
Phần trăm bạch cầu lympho TCD4 và TCD8 trong máu toàn phần được xác định bằng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry) theo hướng dẫn của BD Biosciences.
[60] Qui trình thự hiện như sau:
1 Kháng thể kháng CD4 đánh dấu PE (BD Biosciences) và kháng thể kháng CD8 đánh dấu FITC (BD Biosciences) được cho vào trong 20 μL máu toàn phần (nồng độ kháng thể cuối cùng là 10 μg/mL) và ủ 30 phút trong tối
2 Sau đó hỗn hợp được ủ 10 phút trong tối với dung dịch ly giải hồng cầu
3 Ly tâm 500 g trong 5 phút và loại bỏ dịch nổi
4 Tế bào được rửa lại 1 lần với dung dịch PBS
5 Thêm 1 mL dung dịch paraformaldehyde 1 % (w/v) và phân tích bằng máy flow cytometer C6 (BD Accuri TM C6 Flow Cytometer) Mẫu không nhuộm kháng thể được sử dụng để loại trừ tín hiệu nền.
Phương pháp xác định lượng cytokine IL-2 và IL-6 trong máu chuột
Mẫu máu tim chuột được lắng và ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút để thu huyết thanh, sau đó bảo quản huyết thanh ở -80 °C cho đến khi thử nghiệm Nồng độ IL-2 và IL-6 được xác định bằng phương pháp ELISA sử dụng bộ kit Mouse IL-2 ELISA Set và Mouse IL-6 ELISA Set từ BD Biosciences.
1 Kháng thể bắt giữ (kháng thể kháng IL-2 hoặc IL-6) được cố định trên đĩa ELISA (ThermoFisher Scientific) qua đêm, 4oC Sau đó đĩa được rửa 3 lần với dung dịch rửa với 300 μL/giếng
2 Khóa giếng bằng dung dịch PBS 10 % FBS (100 μL) trong 1 giờ, sau đó rửa lại bằng dung dịch rửa
3 Ủ giếng với 100 μL các mẫu huyết thanh hoặc chất chuẩn (IL-2 hoặc IL-6) trong 2 h ở nhiệt độ phòng Sau đó rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa
4 Ủ giếng với 100 μL dung dịch kháng thể thứ cấp đánh dấu HRP trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó rửa đĩa 7 lần với dung dịch rửa
5 Ủ giếng với 100 μL dung dịch cơ chất ở nhiệt độ phòng, trong tối
6 Thêm vào mỗi giếng 50 μL dung dịch dừng phản ứng và tiến hành đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek)
7 Nồng độ IL-2 hoặc IL-6 được tính dựa trên đường chuẩn.
Phương pháp xác định nồng độ protein
Hàm lượng protein trong dịch đồng thể gan được xác định bằng phương pháp Bradford, dựa trên nguyên tắc tạo phức của protein với thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue Albumin huyết thanh bò (BSA) được sử dụng làm chất chuẩn trong quy trình này.
1 Dựng đường chuẩn BSA cho định lượng protein: từ dung dịch mẹ BSA 2 mg/mL pha loãng trong PBS (-) thành các nồng độ theo bảng sau:
2 Pha loãng mẫu cần xác định lượng protein tổng (pha loãng 200 lần)
3 Cho 160 μl dung dịch Bradford 1X vào giếng, cho 40 μl mẫu/giếng
4 Lắc 3 phút, đo mật độ quang ở 595 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek)
5 Nồng độ protein được tính toán dựa trên đường chuẩn BSA.
Phương pháp xác định mức độ peroxy lipid (TBARS)
Malonyl dialdehyd (MDA) được hình thành trong quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào Trong trạng thái bình thường, màng tế bào chứa một lượng MDA nhất định; tuy nhiên, khi quá trình peroxy hóa lipid diễn ra, cấu trúc và chức năng sinh lý của màng sẽ bị thay đổi Do đó, mức độ oxy hóa màng tế bào được xác định qua lượng MDA có mặt Khi MDA phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA sẽ tương tác với hai phân tử acid thiobarbituric, tạo thành phức màu hồng với bước sóng hấp thu cực đại ở 532 nm.
16 thực hiện môi trường có pH 2-3, ở nhiệt độ 90 - 100℃ trong vòng 10 - 15 phút Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu
Gan chuột sau khi cân được cho vào dung dịch KCl 1,15 % (Merck) với tỉ lệ 1 g gan/10 mL KCl và được đồng hóa bằng máy đồng hóa mẫu trong điều kiện lạnh Quy trình xác định lượng MDA được thực hiện theo phương pháp đã tham khảo từ các công trình trước, với một số biến đổi nhất định Các bước tiến hành quy trình được thực hiện một cách chặt chẽ để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.
1 Chuẩn bị các falcon 15, pha hỗn hợp phản ứng: Ống Dịch đồng thể gan
(mL) Đệm Tris - HCl 0,2 M pH = 7,4 (mL)
2 Ủ ở 37 o C trong 60 phút, sau đó thêm vào mỗi ống 1 mL TCA 10 %
3 Chuẩn bị đường chuẩn: chuẩn bị dung dịch MDA (Sigma) cú nồng độ 20 àM trong dung dịch PBS 50 mM Sau đó pha thành dãy nồng độ sau:
Pha hỗn hợp gồm 750 mL dd MDA + 250 mL TCA 10%
5 Hút lấy 1 mL dịch nổi cho vào ông nghiệm, sau đó thêm 0,5 mL TBA 0,8 % (Sigma)
6 Đặt các ống nghiệm trong bồn ổn nhiệt 100 o C trong 15 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng
7 Hỳt 200 àL/giếng cho vào đĩa 96 giếng và đo mật độ quang ở bước súng 532 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek)
8 Hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan được tính toán dựa vào đường chuẩn Dựa trên nồng độ protein của dịch đồng thể gan, hàm lượng MDA/mg protein được tính toán.
Phương pháp xác định lượng glutathione (GSH)
Glutathione (GSH) là một chất chống peroxy hóa quan trọng, hoạt động thông qua enzyme glutathione peroxidase Trong cơ thể, GSH liên kết với các gốc tự do sinh ra từ quá trình peroxy hóa, tạo thành các hợp chất hoạt động kém hơn, từ đó giúp ngăn chặn tác động xấu của gốc tự do Phản ứng này được xúc tác bởi GSH peroxidase, với công thức: 2GSH + L-OOH.
GSH trong dịch chiết sinh học phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) để tạo ra phức hợp màu vàng có độ hấp thu ánh sáng cực đại tại bước sóng 412 nm, với cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng GSH Phương trình phản ứng được mô tả như sau: DTNB + GSH → GSSG + TNB, trong đó GSSG là glutathione disulfide và TNB là 2-nitro-5-thiobenzoic acid.
Gan chuột sau khi cân nặng được cho vào dung dịch KCl 1,15 % (Merck) với tỷ lệ 1 g gan/10 mL KCl và được đồng hóa bằng máy đồng hóa mẫu trong điều kiện lạnh Quy trình xác định lượng GSH được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó với một số điều chỉnh Các bước thực hiện quy trình này được tiến hành theo các hướng dẫn đã được thiết lập.
1 Chuẩn bị các falcon 15, pha hỗn hợp phản ứng: Ống Dịch đồng thể gan
(mL) Đệm Tris - HCl 0,2 M pH = 7,4 (mL)
2 Thêm vào mỗi ống 1 mL TCA 10% (w/v), sau đó ly tâm 10.000 rpm, 5 phút,
4 o C Thu 100 μL dịch nổi cho vào đĩa 96 giếng
3 Chuẩn bị đường chuẩn: chuẩn bị dung dịch GSH (Sigma, G4251) có nồng độ
400 àM pha trong dung dịch đệm PBS 100 mM (pH 7,4) Sau đú pha thành dãy nồng độ như sau:
Tương tự mẫu thí nghiệm, cho 100 μL GSH chuẩn vào đĩa 96 giếng
4 Thêm vào mỗi giếng 200 μL dung dịch phản ứng gồm 180 μL dung dịch EDTA phosphate (EDTA 5 mM, KH2PO4 0,1 M) + 20 μL thuốc thử Ellman (Sigma)
5 Để 3 phút ở nhiệt độ phòng, rồi đo OD ở bước sóng 412 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek)
6 Hàm lượng GSH trong dịch đồng thể gan được tính toán dựa vào đường chuẩn Dựa trên nồng độ protein của dịch đồng thể gan, hàm lượng GSH/mg protein được tính toán.
Phương pháp xác định mức độ biểu hiện gene
Phương pháp định lượng RNA mục tiêu được thực hiện thông qua kỹ thuật phiên mã ngược kết hợp với PCR sử dụng chất phát huỳnh quang Nghiên cứu này nhằm xác định sự thay đổi biểu hiện của các gene kháng oxi hóa trong mẫu gan chuột uống NDL, bằng cách so sánh định lượng tương đối mức độ RNA của gene mục tiêu giữa mẫu uống thuốc và mẫu đối chứng.
1 Mồi được thiết kế bằng công cụ oligoexplorer, và kiểm tra trình tự bằng công cụ NCBI Blast (Bảng 2.1)
2 RNA tổng của tế bào được tách chiết bằng bộ kit Illustra RNAspin mini (GE Healthcare)
3 Phiên mã ngược thành cDNA nhờ enzyme reverse transcriptase (Agilent) với mồi hexamer
4 Phản ứng realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1) cho từng gene (IDT) được thực hiện với chất nhuộm huỳnh quang là EvaGreen (Biotium) β-actin được sử dụng làm gene chứng nội Chương trình nhiệt được thiết lập trên máy Realtime PCR (CFX 96, Bio-rad) gồm 95C - 30 giây, 60 o C - 30 giây và 72 o C
- 30 giây, 44 chu kì và phân tích đường cong nóng chảy từ 55 o C đến 95 o C
5 Mức độ thay đổi biểu hiện gene được tính bằng công thức: x = 2 -ΔΔCt [38] Trong đó: ΔΔCt = ΔCt lô chuột tiêm CY – ΔCt chuột không tiêm CY, ΔCt Ct gene mục tiêu – Ct gene chứng nội, Ct: chu kì ngưỡng Từ đó chúng tôi sẽ so sánh mức độ thay đổi biểu hiện gene của lô chuột tiêm CY uống NDL so với lô chuột tiêm CY chỉ uống nước
Length Start Stop Tm GC
Exon junction 285/286 (reverse primer) on template NM_011434.1
1850 (between pos 24926341 and 24928192 on NT_039625.8)
Length Start Stop Tm GC
Exon junction 550/551 (reverse primer) on template NM_013671.3
2133 (between pos 5488752 and 5490886 on NT_039638.8)
Length Start Stop Tm GC
Exon junction 1441/1442 (forward primer) on template NM_009804.2
1688 (between pos 44336209 and 44334520 on NT_039207.8) β - actin
Length Start Stop Tm GC
Exon junction 1093/1094 (forward primer) on template NM_007393.5
Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu định lượng được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn với ít nhất 3 lần lặp lại thí nghiệm Trong thử nghiệm in vivo, các số liệu nằm ngoài khoảng giá trị trung bình ± 2 lần độ lệch chuẩn sẽ được loại bỏ khỏi nhóm Số liệu n trong các lô dao động từ 8 đến 15 và có thể khác nhau giữa các lô.
21 biệt giữa 2 lô được kiểm tra bằng two-tailed unpaired Student’s t-tests của phần mềm Graphpad Prism 5 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p
