CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ BIỆN LUẬN
3.5. Nội dung 5 Khảo sát khả năng kháng oxi hóa của NDL
3.5.4. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của enzyme CAT và SOD
Superoxide dismutase (SOD) là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa các gốc superoxide (O2-) thành O2 và H2O2. Tiếp theo đó, H2O2 sẽ chuyển thành O2 và H2O2 dưới sự xúc tác của catalase (CAT). SOD ở người và động vật tồn tại 3 dạng: SOD1 hoạt động ở tế bào chất, SOD2 hoạt động ở ti thể và SOD3 ở không gian ngoại bào. Các nghiên cứu cho thấy chuột thiếu SOD1 mắc rất nhiều bệnh như ung thư gan, thúc đẩy nhanh sự mất sinh khối cơ do lão hóa, đục thủy tinh thể sớm và giảm tuổi thọ [21]. Chuột thiếu SOD2 bị stress oxi hóa rất cao và chết trong vài ngày sau sinh
43
[36],[37]. Trong khi chuột thiếu SOD3 lại chưa thấy biểu hiện bất thường với tuổi thọ bình thường mặc dù chuột có nhạy hơn với các tổn thương do mức độ các gốc oxide cao [17]. Do đó trong nghiên cứu này chúng tơi chọn khảo sát sự thay đổi biểu hiện của SOD1, SOD2 và CAT trong đánh giá tác động kháng oxi hóa của NDL. Sự thay đổi biểu hiện ở mức phiên mã của các gene SOD1, SOD2 và CAT của 3 mẫu/lơ thí nghiệm được xác định bằng phương pháp Realtime RT- PCR. Số lần thay đổi biểu hiện gene được tính theo cơng thức của Livak và cộng sự (2001) so với lơ chuột bình thường [38]. Giá trị âm biểu thị sự giảm biểu hiện gene.
Hình 3.16. Sự thay đổi biểu hiện CAT ở các lơ thí nghiệm. Kí hiệu *(p<0,05) và #p(<0,05) lần lượt chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô CY và lô C ở mỗi gene #p(<0,05) lần lượt chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ CY và lơ C ở mỗi gene
Hình 3.17. Sự thay đổi biểu hiện SOD1 ở các lơ thí nghiệm. Kí hiệu *(p<0,05) và ở các lơ thí nghiệm. Kí hiệu *(p<0,05) và #p(<0,05) lần lượt chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ CY và lơ C ở mỗi gene
Hình 3.18. Sự thay đổi biểu hiện SOD2 ở các lơ thí nghiệm. Kí hiệu SOD2 ở các lơ thí nghiệm. Kí hiệu *(p<0,05) và #p(<0,05) lần lượt chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ CY và lô C ở mỗi gene
44
Bảng 3.12. Sự thay đổi biểu hiện gene của các lơ thí nghiệm (n=3)
C CY NDL1 NDL2 Sily
CAT 1 0,65 ± 2,67 11,28 ± 5,52*# 6,35 ± 4,82# 13,07 ± 3,33*#
SOD1 1 -5,50 ± 2,64# -1,77 ± 0,72# -2,76 ± 0,04# 0,01 ± 1,44# SOD2 1 -2,87 ± 1,13# -1,66 ± 2,67 -1,61 ± 0,37*# 0,19 ± 2,19**
*(p<0,05) và #p(<0,05) lần lượt chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ CY và lô C ở mỗi gene
Kết quả cho thấy rằng chuột tiêm CY không gây ra thay đổi đáng kể ở enzyme CAT so với chuột bình thường. Chuột được uống NDL sau khi tiêm CY có mức độ biểu hiện CAT tăng hơn đáng kể so với nhóm chuột CY + uống nước (Bảng 3.12, Hình 3.16). CY làm giảm sự biểu hiện SOD1 và SOD2 rõ rệt (Hình 3.17 và 3.18). Chuột uống NDL đã có sự cải thiện đáng kể sự biểu hiện của SOD2 (Hình 3.18). Đối với trường hợp gene SOD1, nhóm chuột uống NDL và silymarin có xu hướng ít giảm biểu hiện SOD1 hơn so với lô bệnh lý, nhưng do độ biến động của kết quả cao nên chưa có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê (Hình 3.17). Như vậy, NDL có tác
dụng làm giảm tác dụng của CY trên sự biểu hiện các enzyme CAT, SOD2. 3.5.5. Bàn luận
Sau quá trình trao đổi chất CY tạo thành các hợp chất thứ cấp ở trạng thái hoạt hóa là acrolein và phosphamide mustard, và sản sinh nhiều gốc oxi hoạt tính. Ngồi ra, acrolein còn tác động đến hệ thống kháng oxi hóa làm tăng số lượng gốc oxi hoạt tính, gây ra tình trạng stress oxi hóa [50]. Kết quả cho thấy chuột tiêm CY liều 150 mg/kg thể trọng có thể hiện phần nào tình trạng stress oxi hóa sau 5 ngày tiêm ở các đặc điểm: tăng mức độ peroxy hóa, giảm mức độ biểu hiện của SOD và có xu hướng giảm lượng glutathione trong máu. Nghiên cứu của Trương Thị Mỹ Chi và Nguyễn Thị Thu Hương (2010), nghiên cứu Nguyễn Thị Phương Thùy và Nguyễn Thùy Dung (2013) cho thấy chuột nhắt trắng tiêm CY liều 150 mg/kg thể trọng làm giảm trọng lượng gan, tăng MDA và giảm glutathione đáng kể [4],[7],[9]. Như vậy, mặc dù chưa tối ưu nhưng chúng tơi đã tạo được chuột có biểu hiện một số đặc điểm
45
stress oxi hóa đặc trưng, có thể sử dụng trong đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của bài thuốc.
Gốc tự do được sinh ra từ các quá trình trao đổi chất trong tế bào và có vai trị quan trọng trong q trình truyền tín hiệu, biểu hiện gene, apoptosis, vận chuyển ion,… Tuy nhiên, các gốc tự do là những phân tử hoạt động, gây ra tổn thương cho DNA, lipid, protein dẫn đến tổn thương tế bào. Bình thường cơ thể giữ trạng thái cân bằng gốc tự do, nhưng khi stress oxi hóa, lượng gốc tự do tăng cao gây nhiều bệnh lý nguy hiểm [39]. Do đó địi hỏi các hệ thống kháng oxi hóa của cơ thể phải hoạt động tích cực để loại trừ các gốc tự do. Các hệ thống kháng oxi hóa bao gồm: (1) các chất nội sinh (glutathione) hay ngoại sinh (các vitamin, flavonoid, … từ thực phẩm) trung hòa các gốc tự do, và (2) các enzyme kháng oxi hóa như SOD giúp chuyển hóa các gốc oxy hoạt tính thành H2O2 và nước, CAT hoặc GPx xúc tác phản ứng chuyển hóa H2O2 thành O2 và H2O [39]. NDL cũng đã thể hiện các đặc tính kháng oxi hóa trên mơ
hình chuột suy giảm miễn dịch bởi CY như: giảm peroxy hóa lipid, tăng glutathione, tăng sự biểu hiện CAT, ít giảm biểu hiện SOD2 so với lơ bệnh lý.
Các cơng bố về hoạt tính sinh học của các vị thành phần của bài NDL cho thấy đa số các vị ít nhiều có tác dụng kháng oxi hóa. Đậu xanh và đậu đen chứa nhiều protein, polypeptide, polysaccharide và polyphenol có tiềm năng kháng oxi hóa cao [15],[54]. Các nghiên cứu trên cao chiết, các hợp chất chiết từ Đậu xanh như vitexin, isovitexin, quercetin, … có hoạt tính kháng oxi hóa cao [15],[16]. Tương tự cao chiết Đậu đen đã được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa bằng các thử nghiệm sinh hóa như DPPH, ORAC, FRAP, TRAP cũng như trên mơ hình tế bào [58],[59]. Bên cạnh đó, cũng có một số ít nghiên cứu đề cập đến hoạt tính kháng oxi hóa của Bồ ngót và Địa long [45],[53].
Sự tương tác giữa các thành phần trong bài thuốc có thể tạo nên tác động phối hợp làm gia tăng tác dụng chính của bài thuốc, hay tạo ra một hiệu quả đa tác động giúp giảm các tác dụng phụ. Theo nguyên tắc này, một bài thuốc hỗ trợ điều trị ung thư có thể thể hiện hiệu quả đa tác động như: tiêu diệt tế bào ung thư, tăng cường hiệu quả của hóa trị/xạ trị, bảo vệ các tế bào lành, giảm viêm nhiễm ở các mô xung quanh khối u, tăng cường miễn dịch và sức đề kháng của cơ thể, cải thiện chất lượng cuộc sống
46
và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối [30]. Một nghiên cứu khác của nhóm cũng cho thấy NDL có tác động gây độc tế bào trên các dịng tế bào ung thư MCF-7, Hep G2 và NCI H460 và cảm ứng apoptosis ở tế bào MCF-7 [44]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh bài thuốc NDL có tác dụng tăng cường miễn dịch và kháng oxi hóa trên mơ hình chuột suy giảm miễn dịch dưới tác động của một chất hóa trị ung thư như CY. Như vậy với những kết quả thu được, bài thuốc NDL đã thể hiện ít nhất 3 tác động trong phối hợp điều trị ung thư là tiêu diệt tế bào ung thư và kích thích tăng cường miễn dịch.
47