CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.9. Phương pháp xác định lượng glutathione (GSH)
Glutathione (GSH) là một chất chống peroxy hóa thơng qua enzyme glutathione peroxidase. Trong cơ thể, GSH sẽ liên kết các gốc tự do được sinh ra từ q trình peroxy hóa để tạo thành những chất hoạt động kém hơn, từ đó có thể ngăn cản tác động xấu do gốc tự do. Phản ứng được xúc tác bởi GSH proxidase: 2GSH + L-OOH
L-OH + GSSG + H2O. GSH trong dịch chiết sinh học phản ứng với thuốc thử
Ellman hay còn gọi là DTNB [5,5 - dithiobis - (2 - nitrobenzoid acid)] sẽ tạo sản phẩm là phức hợp có màu vàng hấp thu ánh sáng cực đại ở bước sóng 412 nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng GSH. Phương trình phản ứng như sau: DTNB + GSH GSSG + TNB (GSSG: Glutathione disulfide; TNB: 2 - nitro - 5 - thiobenzoic acid).
Gan chuột sau khi cân được cho vào dung dịch KCl 1,15 % (Merck) với tỉ lệ là 1 g gan/10 mL KCl. Gan được đồng hóa bằng máy đồng hóa mẫu trong điều kiện lạnh. Qui trình xác định lượng GSH được tham khảo từ các cơng trình trước với một số biến đổi [4]. Qui trình tiến hành theo các bước như sau:
1. Chuẩn bị các falcon 15, pha hỗn hợp phản ứng: Ống Dịch đồng thể gan (mL) Đệm Tris - HCl 0,2 M pH = 7,4 (mL) Trắng 0 3 Thử 1 2
2. Thêm vào mỗi ống 1 mL TCA 10% (w/v), sau đó ly tâm 10.000 rpm, 5 phút, 4oC. Thu 100 μL dịch nổi cho vào đĩa 96 giếng.
3. Chuẩn bị đường chuẩn: chuẩn bị dung dịch GSH (Sigma, G4251) có nồng độ 400 µM pha trong dung dịch đệm PBS 100 mM (pH 7,4). Sau đó pha thành dãy nồng độ như sau:
18 GSH (μM) GSH 400 µM (L) PBS 100 mM (L) 0 0 1000 12,5 31,25 968,75 25 62,5 937,5 50 125 875 100 250 750 200 500 500 400 1000 0
Tương tự mẫu thí nghiệm, cho 100 μL GSH chuẩn vào đĩa 96 giếng.
4. Thêm vào mỗi giếng 200 μL dung dịch phản ứng gồm 180 μL dung dịch EDTA phosphate (EDTA 5 mM, KH2PO4 0,1 M) + 20 μL thuốc thử Ellman (Sigma).
5. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng, rồi đo OD ở bước sóng 412 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek).
6. Hàm lượng GSH trong dịch đồng thể gan được tính tốn dựa vào đường chuẩn. Dựa trên nồng độ protein của dịch đồng thể gan, hàm lượng GSH/mg protein được tính tốn.