CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.8. Phương pháp xác định mức độ peroxy lipid (TBARS)
Malonyl dialdehyd (MDA) được sinh ra trong q trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Ở trạng thái bình thường, màng tế bào vẫn có một lượng MDA nhất định, khi q trình peroxy hóa lipid xảy ra làm thay đổi cấu trúc màng và chức năng sinh lý của chúng. Do đó sự oxy hóa màng tế bào được đo bằng lượng MDA. Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng
16
thực hiện mơi trường có pH 2-3, ở nhiệt độ 90 - 100℃ trong vòng 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu.
Gan chuột sau khi cân được cho vào dung dịch KCl 1,15 % (Merck) với tỉ lệ là 1 g gan/10 mL KCl. Gan được đồng hóa bằng máy đồng hóa mẫu trong điều kiện lạnh. Qui trình xác định lượng MDA được tham khảo theo cơng trình trước với một số biến đổi [7],[9]. Qui trình tiến hành theo các bước sau:
1. Chuẩn bị các falcon 15, pha hỗn hợp phản ứng:
Ống Dịch đồng thể gan (mL) Đệm Tris - HCl 0,2 M pH = 7,4 (mL) Trắng 0 3 Thử 2 1
2. Ủ ở 37oC trong 60 phút, sau đó thêm vào mỗi ống 1 mL TCA 10 %
3. Chuẩn bị đường chuẩn: chuẩn bị dung dịch MDA (Sigma) có nồng độ 20 µM trong dung dịch PBS 50 mM. Sau đó pha thành dãy nồng độ sau:
Nồng độ (µM) MDA 20 µM (µL) PBS 50 mM, pH 7,4 (µL) 0 0 1000 1,25 62,5 937,5 2,5 125 875 5 250 750 10 500 500 20 1000 0
Pha hỗn hợp gồm 750 mL dd MDA + 250 mL TCA 10% 4. Ly tâm 10.000 rpm, 5 phút, 4oC.
5. Hút lấy 1 mL dịch nổi cho vào ông nghiệm, sau đó thêm 0,5 mL TBA 0,8 % (Sigma)
6. Đặt các ống nghiệm trong bồn ổn nhiệt 100oC trong 15 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phịng.
7. Hút 200 µL/giếng cho vào đĩa 96 giếng và đo mật độ quang ở bước sóng 532 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek).
17
8. Hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan được tính tốn dựa vào đường chuẩn. Dựa trên nồng độ protein của dịch đồng thể gan, hàm lượng MDA/mg protein được tính tốn.