nuôi cấy mô - tế bào thực vật

1.1 Khái niệmNuôi cấy mô - tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tếbào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp đểtạo ra những khối t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Hoa mười giờ Portulaca granflora nở hoa trong ống nghiệm 06

Hình 2 Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 07

Hình 3 Nuôi cấy phôi 08

Hình 4 Nuôi cấy mô 09

Hình 5 Mô phân sinh dinh dưỡng đang hoạt động của cây Tím Phi 09

Hình 6 Nuôi cấy bao phấn ở cây lúa 10

Hình 7 Sự nuôi cấy chuối bom (Musa acuminata) từ protoplast 11

Hình 8 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 13

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 1 Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C (Burgerr,1988) 19Bảng 2 Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử lí mô cấy thực vật 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ rất lâu, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp

Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng, gọi làgiâm cành, chiết cành… Hay chắp nối những thân cây này với thân cây kia bằngcách ghép cành Cùng một lúc chúng ta có thể nhân giống cây lên hàng loạt màkhông mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn Bên cạnh đó người talại có một công nghệ hiện đại hơn, gọi là công nghệ nuôi cấy mô tế bào Đối vớicác loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem lại nhữnghiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt

Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vậttách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học cógiá trị kinh tế cao

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng,được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế

PHẦN I TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ

TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tếbào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp đểtạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm

Hình 1 Hoa mười giờ Portulaca granflora nở hoa trong ống nghiệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh của

tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách cóđịnh hướng vào sự phân hóa và sự phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toànnăng của tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào: Tế bào bất kỳ nào của cơ thể sinh vật đa bào nào

cũng đều có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuậnlợi Đó là tính toàn năng của tế bào (Theo Gottlied Haberlandt trong cuốn ‟Thựcnghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” )

Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào: Cơ thể sinh vật trưởng thành bao

gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào.Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giaiđoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chứcnăng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biếnđổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô cơ quan khác nhau Đó là sựphân hóa Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyênbiệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong điều kiện thíchhợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đógọi là quá trình phản phân hóa tế bào

1.2 Sơ lược các kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào

Hình 2 Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

(A) Mô sẹo từ Catharanthus roseus (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp (C)

Nốt sần C roseus (D) Đầu rễ từ C roseus (E)Tái sinh cây từ C roseus callus (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.

1.2.1 Nuôi cấy phôi

Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷXVIII Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được câynhưng là cây lùn Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoànthiện hơn Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy

thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều lànếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom.

Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dịdưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinhtrưởng để phát triển Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cầnchất điều hoà sinh trưởng

Hình 3 Nuôi cấy phôi

Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng Trongnhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác Ngoài ramột số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là nhữngchất rất cần trong nuôi cấy phôi Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin,cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Auxin thường dùng ở nồng

độ thấp Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi

Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triểncủa phôi nuôi cấy in vitro Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơnphôi phát triển tự nhiên

1.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác,ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuậnlợi Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấykhi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn.Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhaunhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và cácmuối của các nguyên tố đa lượng ( nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng ( Mg, Fe,

Mn, Co,Zn, ) Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3, ) và cácchất điều hoà sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôicấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới

Hình 4 Nuôi cấy mô

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy

cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acideamine, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinhtrưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khử năng tổng hợp cácchất này

1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm ÷ 1cm.Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hìnhthành hoặc các cành non

Hình 5 Mô phân sinh dinh dưỡng đang hoạt động của cây Tím Phi 3 tháng tuổi

và Nụ hoa Tím Phi được nuôi cấy từ gốc cánh hoa (nách lá đài) sau 45

ngày trên môi trường MS với BA 1mg/l, IAA 0,1mg/l

Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởngrất quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợpcytokinine với auxin Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân

giống in vitro Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trìnhhình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin

1.2.4 Nuôi cấy bao phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiêncứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trênlúa Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên

30 loại cây Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thểphát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng conđường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan

Hình 6 Nuôi cấy bao phấn ở cây lúa 1.2.5Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thểđược tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp Những công trình về nuôi cấy

tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym.Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau.Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứuảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển vàphân hoá của tế bào Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào

1.2.6 Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960) Ông làngười đầu tiên dùng enzym để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tếbào rễ cà chua Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tếbào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Hình 7 Sự nuôi cấy chuối bom (Musa acuminata) từ protoplast

Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trongnghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật Bằng phương pháp dung hợp haiprotoplast có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dunghợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene

PHẦN 2

KỸ THUẬT NUÔI CẤY

MÔ - TẾ BÀO

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nàocủa cây: Các đoạn của rễ và thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá), các cấu trúccủa phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn, thậm chí các mẩuthân ngầm hoặc cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành) cũng được dùng chonuôi cấy

Mục đích của nuôi cấy và đặc tính của loài cây sẽ quyết định việc chọn lựa loạimẫu nào là phù hợp Chẳng hạn để thu cây đơn bội làm nguồn gen lai tạo giống thìphải dùng bao phấn, hạt phấn cho nuôi cấy Để tiến hành vi nhân giống thực vật,cây cho mẫu (cây mẹ) phải mang một hoặc nhiều đặc điểm ưu việt mà chúng taquan tâm: sinh trưởng tốt, cho sản lượng, chất lượng cao của quả, hạt hay cơ quansinh dưỡng, ít bị nhiễm bệnh, có khả năng chống chịu các điều kiện sống khôngthuận lợi của môi trường (hạn, lạnh) Các mẫu thường được thu nhận vào đầu mùasinh trưởng, lúc sáng sớm khi toàn cây vẫn còn ở trạng thái trương nước

Sự tái sinh của mẫu phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy, đặcđiểm di truyền của loài cây, trạng thái sinh lý của cây cho mẫu và đôi khi chịu ảnhhưởng của các mùa trong năm

2.2 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào

2.2.1 Các thiết bị, dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thường bao gồm:

- Phòng rửa dụng cụ

- Phòng chuẩn bị môi trường, hấp tiệt trùng và chứa dụng cụ

- Phòng cấy vô trùng

- Phòng nuôi mẫu

- Phòng quan sát và thu nhận số liệu

Hình 8 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Sơ đồ tổng quan như sau:

1 Phòng rửa và sản xuất nước cất

2 Phòng sấy hấp, kho thủy tinh sạch

3 Phòng chuẩn bị môi trường

- Máy cất nước hai lần

- Máy sản xuất nước khử ion

Phòng sấy hấp:

- Tủ sấy 60-6000C (loại có dung tích lớn)

- Nồi áp suất loại nhỏ (20-30 lít)

- Nồi áp suất loại lớn (70-100 lít)

Phòng chuẩn bị môi trường:

6789

10

Có hai loại tủ cấy thường được sử dụng: tủ cấy tĩnh và tủ cấy thổi khí vô trùng.Trong tủ cấy phải có đèn trắng để dễ làm việc và có đèn UV để khử trùng trước khilàm việc

- Laminar

- Quạt thông gió

- Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường

- Thiết bị lọc không khí

- Giá và bàn để môi trường

- Bộ dụng cụ cấy, đèn cồn…

Phòng nuôi mẫu cấy:

Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng, độ ẩm, độdài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp

Phòng nuôi có nhiệt độ 15-300C tùy theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm.Nhiệt độ phải được phân bố đều trong toàn phòng nuôi, phải có đầy đủ ánh sánghuỳnh quang và có thể điều khiển được cường độ và thời gian chiếu sáng Phòngnuôi phải được thổi khí đồng nhất và biên độ độ ẩm được điều chỉnh từ 20-98%

- Phòng nuôi sáng: tường nên sơn màu trắng Các giá đèn được lắp đèn ống để chiếusáng Trong phòng cần gắn các máy móc kiểm tra chính xác nhiệt độ, độ ẩm

- Phòng nuôi tối để nuôi mô sẹo và các xử lí đặc biệt Phòng cần tất cả các điều kiệnnhư phòng sáng chỉ khác là không cần lắp đèn chiếu sáng cho cây, cửa sổ cần đượcche kín bằng vải đen

- Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ2000-3000 lux

- Máy điều hòa nhiệt độ

- Máy điện di, máy soi AND

- Máy PCR,máy sắc kí,quang phổ

- Đảm bảo điều kiện vô trùng

- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

- Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy

2.2.2 Các thủ tục cơ bản trong phòng thí nghiệm

2.2.2.1 Cân

Việc chuẩn bị môi trường đòi hỏi thao tác cân phải chính xác Trước hết cânphải được đặt ở vị trí ổn định, không bị rung, không khí không bị dao động nhiều.Cân và dĩa cân phải được giữ gìn sạch sẽ Quan trọng nhất là không được cân qúatrọng lượng cho phép và nên sử dụng các vật đựng hóa chất có trọng lượng nhỏhoặc bằng giấy khi cân Không được để hóa chất tiếp xúc trực tiếp với mặt cân

2.2.2.2 Đong chất lỏng

Các dụng cụ thủy tinh có chia vạch (ống hút có chia độ, cốc thủy tinh có chiavạch, ống đong) cần thiết để pha môi trường Ống đong có thể tích 10, 20, 100 và1000ml được sử dụng để đong những chất lỏng có thể tích lớn còn ống hút có chia

độ, bình định mức dùng để đong những thể tích cần chính xác Đong các dung dịchchỉ chính xác khi đáy của không khí ngang với vạch đánh dấu

2.2.2.3 Xác định độ pH

Độ pH của môi trường cấy hầu hết được chỉnh ở 5,5 ± 0,1 trước khi hấp khửtrùng Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trườngkhoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào Vì vậy xác định chínhxác độ pH là cần thiết Murashige và Shoog nhận thấy rằng pH 5,7 - 5,8 thích hợp

để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS Nếu môi trường MSđược sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5, môi trường cấy huyền phù có pHthấp phần nào giảm bớt tính trạng nhiễm

Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl sau khi đãpha xong môi trường và chuẩn bị đưa và hấp khử trùng Có thể chỉnh pH bằng pH

kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giây đo pH Thường thì nhiệt độ cao sẽ làm tăng tínhaxit của môi trường Mann và cộng sự nhận thấy rằng nếu trước khi hấp pH = 5,7thì sau khi hấp pH = 5, Nếu muốn pH = 5,7 - 5,9 thì trước khi hấp khử trùng cầnđiều chỉnh pH đến 7

2.2.2.4 Rửa dụng cụ thủy tinh và bình nuôi cấy bằng plastic

Thông thường bình nuôi cấy sau khi sử dụng cần phải được rửa kỹ bằng xà bôngbột cho hết các chất bám trên thành chai rồi tráng lại nhiều lần bằng nước sạch cuốicùng tráng lại bằng nước cất Các dụng cụ thủy tinh bị quá bẩn cần phải được ngâmtrong axit HCl hoặc sulfuric sau đó rửa sạch bằng nước máy và tráng bằng nước cất.Các bình môi trường bị nhiễm trùng trong quá trính nuôi cấy cần phải được hấp tiệttrùng trước khi rửa Các dụng cụ thủy tinh sau khi rửa phải được sấy khô trong tủsấy và được cất cẩn thận

2.3 Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.3.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng,vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bàocủa nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trườngnuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩnhoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi

Thông thường một chu kì nuôi cấy mô và tế bào thực vật dài từ 1-5 tháng, trongkhi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một vài ngày Như vậy mức độ vô