[Luận văn]nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố mùa vụ, phương pháp khai thác đến kết quả thu tế bào trứng và môi trường nuôi cấy, đông lạnh đến kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bò

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-& -

PHÙNG MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ MÙA VỤ, PHƯƠNG PHÁP KHAI THÁC ĐẾN KẾT QUẢ THU TẾ BÀO TRỨNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY, ĐÔNG LẠNH ĐẾN KẾT QUẢ THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TRỨNG BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: THÚ Y

Mã số: 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN TIẾN DŨNG

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác

Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Phùng Minh Nguyệt

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi tới Ban Giám hiệu trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại Học, Khoa Thú Y và các thầy cô giáo trong trường lời cảm ơn sâu sắc nhất

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Trần Tiến Dũng giảng viên Bộ môn Ngoại - Sản, khoa Thú Y - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các cô, chú, anh, chị em phòng Thí nghiệm Trọng điểm Tế bào Động vật, Viện chăn nuôi Quốc gia và các bạn bè đồng nghiệp, đặc biệt là tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Thoa đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện để luận văn này

có thể hoàn thành

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, anh em, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2008 Học viên

Phùng Minh Nguyệt

2.1 Tình hình nghiên cứu về thụ tinh ống nghiệm trong và ngoài nước 3

2.2.2 Thần kinh và thể dịch điều tiết hoạt động sinh sản ở bò cái 5 2.2.3 Cấu tạo buồng trứng và tế bào trứng 7

2.4 Nuôi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm 14 2.4.1 Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm 14 2.4.2 Đánh giá sự thành thục của tế bào trứng nuôi trong ống nghiệm 16

2.7 Tạo phôi bằng tế bào trứng thu từ bò sống 23

2.9.2 Những chất bảo vệ sinh học lạnh thông dụng 29

2.10 Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng sinh sản của bò 34

3.3.1 Thu tế bào trứng từ buồng trứng bò ở lò mổ 36 3.3.2 Nuôi tế bào trứng bò thành thục trong ống nghiệm 38 3.3.3 Hoạt hoá và kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng 38

3.3.6 Nuôi cấy in-vitro để đánh giá chất lượng phôi bò sau đông lạnh

4.1 Kết quả thu tế bào trứng và phân loại chất lượng tế bào trứng bò 45 4.1.1 Ảnh hưởng của phương pháp thu trứng tới số lượng tế bào trứng

4.1.2 Ảnh hưởng của mùa vụ thu trứng tới số lượng tế bào trứng bò

4.1.3 Ảnh hưởng của phương pháp thu trứng tới chất lượng tế bào

Foetal Calf Serum Follicle Stimulating Hormone Gonadotropin Releasing Hormone

In vitro Matured Luteining hormone Cumulus- Oocyte Complex Photphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Tissue Culture Medium 199 Cellules de rein singe vert Thụ tinh ống nghiệm

Bảng 4.10 Kết quả nuôi hợp tử trong ống nghiệm 61 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi tới sự phát triển của hợp tử 62 Bảng 4.12 Kết quả phân loại phôi bò sau khi thu hoạch 67 Bảng 4.13 Chất lượng phôi bò trước đông lạnh 68 Bảng 4.14 Kết quả đánh giá chất lượng phôi sau giải đông 70 Bảng 4.15 Ảnh hưởng của các phương pháp đông lạnh đến chất lượng

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh tới sự phát triển của

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Kết quả chất lượng trứng bò thu theo hai phương pháp

giải phẫu nang trứng và hút dịch nang trứng 50Biểu đồ 4.2 Kết quả chất lượng trứng bò thu theo mùa vụ 53Biểu đồ 4.3 Kết quả phát triển của hợp tử trong môi trường nuôi cấy 63Biểu đồ 4.4 Kết quả phát triển của phôi bò sau giải đông 76

1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự bùng nổ dân số là những yêu cầu cấp thiết về an ninh lương thực, thực phẩm Làm thế nào để tăng nhanh số lượng và chất lượng thực phẩm trong khi đất đai dành cho trồng trọt và chăn nuôi ngày càng bị thu hẹp? Một trong các giải pháp để giải quyết vấn đề đó là áp dụng công nghệ sinh học hiện đại vào cuộc sống

Công nghệ phôi là một công nghệ sinh học hiện đại, được hiểu như là một tổ hợp các kỹ thuật sinh sản, di truyền, sinh học tế bào và phân tử nhằm

sử dụng hợp lý các nguồn nguyên liệu mang thông tin di truyền Sự kết hợp

và ứng dụng các kỹ thuật trên vào chăn nuôi giúp chúng ta có thể nâng cao năng suất sinh học của vật nuôi, tạo các động vật có tiềm năng di truyền cao hoặc phục vụ các mục đính đặc biệt của con người Công nghệ phôi đồng thời góp phần bảo tồn sự đa dạng của các nguồn gen thông qua việc thành lập các ngân hàng tế bào sống

Mặt khác công nghệ phôi đã mở ra hàng loạt các kỹ thuật như thụ tinh ống nghiệm, xác định giới tính, nhân bản vô tính, đông lạnh phôi, ghép phôi, chuyển gen

Thụ tinh ống nghiệm (TTON) là quá trình kết hợp giữa tinh trùng (giao

tử đực) với tế bào trứng (giao tử cái) để tạo ra hợp tử ngoài cơ thể mẹ (trong phòng thí nghiệm) trong các môi trường nhân tạo có điều kiện thích hợp giống như trong cơ thể mẹ về nhiệt độ, độ ẩm, áp suất thẩm thấu Đây là kỹ thuật nền nhằm tạo ra lượng phôi lớn để phục vụ các nghiên cứu cơ bản khác trong công nghệ phôi

Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm

1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời vào năm 1978 ở Anh và con bê TTON đầu tiên ra đời năm 1981 ở Mỹ (Brackett và cs (1982)[23]) Bê đực này

là kết quả thụ tinh trong ống nghiệm giữa các tinh trùng với tế bào trứng đã thành thục in vivo, sau đó hợp tử được cấy vào ống dẫn trứng bò nhận Tại Việt Nam, TTON đã được nghiên cứu trên gia súc từ đầu những năm 1990 và tiếp tục được nghiên cứu tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Viện Chăn nuôi Quốc Gia

Với mục đích nâng cao hiệu quả của kỹ thuật TTON và tạo tiền đề áp dụng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng từ con vật sống để sản xuất phôi có

chất lượng cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu ảnh

hưởng của yếu tố mùa vụ, phương pháp khai thác đến kết quả thu tế bào trứng và môi trường nuôi cấy, đông lạnh đến kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bò”

- Góp phần tạo phôi trong ống nghiệm với số lượng lớn, chất lượng cao

và giá thành hạ nhằm phục vụ các nghiên cứu cơ bản khác như: cấy truyền phôi, đông lạnh phôi, cắt phôi, xác định giới tính, chuyển gen

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THỤ TINH ÔNG NGHIỆM TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Thí nghiệm đầu tiên về cấy phôi thành công trên thỏ được tiến hành do giáo sư Walter Heape thực hiện năm 1890 Đến năm 1932, cấy truyền phôi đã thành công trên dê bởi Warwich và Berry và con bê đầu tiên trên thế giới đã

ra đời bằng cấy phôi bởi Willet và cs (1951)[68] Từ đó công nghệ phôi đã đạt được các kết quả mới như đông lạnh phôi, cắt phôi, ghép phôi, xác định giới tính sớm từ giai đoạn phôi…

Những năm tiếp theo, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và các kỹ thuật liên quan đến công nghệ phôi tiếp tục được nghiên cứu cải tiến như nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm (Fukui và cs (1983)[31]; Beker và cs (2002)[17]), thụ tinh ống nghiệm (Leibfreid-Rutledge và cs (1986)[44]), nuôi phôi trong ống nghiệm (Ali và cs (2003)[13]), xác định giới tính phôi giai đoạn sớm bằng kỹ thuật PCR, khai thác trứng ở con vật sống với sự hỗ trợ của máy siêu âm (Ovum Pick Up - OPU) (Galli và cs (2001)[33])… Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước

và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm 1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1978 ở Anh và con bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1981 tại Mỹ

Tại Việt Nam, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu trên gia súc từ đầu những năm 1990 Bùi Xuân Nguyên và cộng sự (1994)[9] đã báo cáo kết quả bước đầu nghiên cứu nuôi trứng và thụ tinh ống nghiệm ở trâu bò Nguyễn Thị Ước (1996)[10] đã nghiên cứu về sự chín nhân ở tế bào trứng trâu đầm lầy nuôi trong ống nghiệm Nguyễn Hữu Đức và cs (1996)[2] đã

nghiên cứu về trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của

bò nội Việt Nam Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[11] đã báo cáo về sản xuất phôi bò bằng thụ tinh ống nghiệm và nghiên cứu sản xuất bò sữa giống thương phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính (Nguyễn Thị Ước và cs (2003)[12]) Nguyễn Hữu Đức và cs (2003)[3] đã báo cáo kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò lai Sind và con bê thụ tinh ống nghiệm ra đời vào ngày 28/11 năm 2002 tại Viện Công Nghệ Sinh Học Tại Viên Chăn Nuôi Quốc Gia, tác giả Nguyễn Văn Lý và cs (2003)[7] đã báo cáo nghiên cứu tạo đàn bê bằng phôi thụ tinh ống nghiệm

2.2 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH DỤC BÒ CÁI

2.2.1 Chu kỳ động dục của bò cái

Chu kỳ động dục được bắt đầu từ khi gia súc thành thục về tính và ở cơ quan sinh dục không có bào thai, không có hiện tượng bệnh lý, ở bên trong buồng trứng có quá trình phát triển của noãn bao, trứng chín và rụng

Ở bò thời gian bắt đầu thành thục về tính trung bình từ 8-24 tháng tuổi, lúc đó cơ thể con cái đặc biệt là cơ quan sinh dục có biến đổi kèm theo sự rụng trứng Dưới sự điều tiết của hocmone thuỳ trước tuyến yên, trứng phát triển, chín, rụng một cách có chu kỳ và biểu hiện bằng những triệu chứng động dục theo chu kỳ gọi là chu kỳ tính Bò thuộc loài gia súc đa chu kỳ, mỗi chu kỳ từ 18-24 ngày trung bình là 21 ngày Chu kỳ tính chia làm 4 giai đoạn:

Giai đoạn trước động dục: là giai đoạn từ khi thể vàng tiêu huỷ đến lần

động dục tiếp theo, chuẩn bị điều kiện cho đường sinh dục cái và trứng để tiếp nhận tinh trùng, đón trứng rụng và thụ tinh Thời gian của giai đoạn này là khoảng 3 ngày Giai đoạn này biểu hiện các đặc điểm sau: đường sinh dục xung huyết và tăng cường nhu động Các tuyến sinh dục phụ tiết chất nhầy,

âm đạo tiết dịch nhầy loãng làm trơn đường sinh dục, con vật bắt đầu xuất hiện tính dục

Giai đoạn động dục: gồm ba thời kỳ liên tiếp là hưng phấn, chịu đực

và hết chịu đực Đây là giai đoạn quan trọng nhưng thời gian lại ngắn khoảng 1-3 ngày Ở giai đoạn này con vật có những biểu hiện: âm đạo xung huyết, sưng tấy chuyển từ màu hồng nhạt sang màu mận chín; dịch trong suốt từ âm đạo chảy ra nhiều, con vật ở trạng thái không yên tĩnh, ăn ít hoặc bỏ ăn, phá chuồng kêu rít, nhảy lên lưng con khác hay để con khác nhảy lên lưng, xuất hiện các tư thế của phản xạ giao phối như hai chân sau dạng ra, đuôi cong về một bên Sau khi hết chịu đực 6-10 giờ thì trứng rụng Khi trứng rụng mà được thụ tinh thì chuyển sang thời kỳ chửa, nếu không được thụ tinh thì chuyển sang giai đoạn sau động dục

Giai đoạn sau động dục: bắt đầu từ khi kết thúc động dục và kéo dài

vài ngày, các hưng phấn thần kinh giảm dần, sự tăng sinh và tiết dịch của tử cung ngừng lại Biểu hiện về hành vi tính dục là không muốn gần con đực Con vật dần trở lại trạng thái sinh lý bình thường

Giai đoạn yên tĩnh: đây là giai đoạn dài nhất, thường bắt đầu từ ngày

thứ tư sau khi trứng rụng mà không thụ tinh và kết thúc khi thể vàng tiêu huỷ Giai đoạn này không có biểu hiện về hành vi sinh dục Đây là giai đoạn nghỉ ngơi yên tĩnh để khôi phục lại cấu tạo chức năng cũng như năng lượng cho chu kỳ tiếp theo

2.2.2 Thần kinh và thể dịch điều tiết hoạt động sinh sản ở bò cái

Hoạt động sinh lý sinh sản của gia súc chịu sự điều tiết của hệ thống thần kinh và thể dịch (Hypothalamus - tuyến yên - tuyến sinh dục) dưới tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài

Nhân tố nội tại: là hàm lượng Estrogen trong cơ thể gia súc khi đã thành thục về tính Estrogen tác động lên khu vỏ não và ảnh hưởng đến Hypothalamus, gây tiết GnRH theo chu kỳ

Nhân tố ngoại cảnh: nhiệt độ, ánh sáng, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng đặc biệt là Steroid tự nhiên trong thức ăn xâm nhập vào cơ thể thông qua tiêu

hoá, qua da vào cơ quan trong cơ thể gây nên những kích thích mãnh liệt tác động lên vỏ đại não

Vỏ đại não sau khi tiếp thu những kích thích sẽ truyền xung động đến Hypothalamus gây tiết các yếu tố giải phóng mà ngày nay gọi là các hocmonegiải phóng Các hocmone đó gồm:

LRH kích thích thuỳ trước tuyến yên tiết ra hoàng thể tố (Luteino Releslaing Hocmone – LH), LH tác động vào buồng trứng làm trứng chín

LH kết hợp với FSH làm bao noãn vỡ gây hiên tượng rụng trứng hình thành thể vàng

PRH kích thích thuỳ trước tuyến yên phân tiết LTH (Luteinotrofic hocmone) LTH tác động vào buồng trứng duy trì sự tồn tại của thể vàng, kích thích thể vàng tiết Progesteron Progesteron tác động lên tuyến yên gây ức chế quá trình phân tiết FSH, LH Quá trình động dục chấm dứt, nó tác động vào tử cung làm tử cung tăng sinh tạo điều kiện cho sự làm tổ của hợp tử Như vậy, hoạt động chu kỳ tính của gia súc chịu sự chi phối của các hocmon FSH, LH, LTH trong đó FSH và LH đóng vai trò quan trọng FSH và LH tuy được phân tiết riêng lẻ song lại hoạt động phối hợp chặt chẽ nhịp nhàng với nhau

Sự cân bằng nội tiết được giữ vững bởi cơ chế điều khiển ngược Khi hocmon của tuyến nội tiết nào tăng hoặc giảm sẽ gây hiện tượng giảm hoặc tăng hocmon tương ứng của tuyến yên Cơ chế đó được gọi là cơ chế điều khiển ngược dương tính

Cơ chế điều khiển ngược có ba kiểu:

Điều khiển ngược vòng dài (Long feed back): Hypothalamus và tuyến yên có những cảm thụ và chịu tác động của các hocmon tuyến sinh dục

Điều khiển ngược vòng ngắn (Short feed back): do các hocmon tuyến yên tác động vào cơ quan thụ cảm đặc biệt của Hypothalamus

Điều khiển vòng cực ngắn (Ultra-Short feed back): do chính các hocmon của Hypothalamus quay lại điều hoà chính Hypothalamus

(2): Sự điều khiển ngược vòng ngắn (Short feedback)

(3): Sự điều khiển ngược vòng cực ngắn (ultra-short feedback)

2.2.3 Cấu tạo buồng trứng và tế bào trứng

2.2.3.1 Cấu tạo và chức năng buồng trứng

Buồng trứng là cơ quan sinh sản cơ bản ở gia súc cái bởi vì chúng sản sinh ra giao tử cái (noãn bào-tế bào trứng) và hocmon sinh sản cái (oestrogen

và progesteron) Trâu, bò, ngựa, cừu là gia súc đơn thai, bình thường mỗi chu

Hypothalamus

Tuyến yên

Tuyến đích

Tổ chức ngoại vi

kỳ động dục chỉ có một tế bào trứng chín và rụng vì vậy mỗi lần chửa chúng chỉ đẻ một con Lợn là gia súc đa thai, mỗi chu kỳ động dục có từ 10-25 tế bào trứng chín và rụng do vậy có nhiều thai ở mỗi lần có chửa

Buồng trứng bò có hình ô van dẹt, nhưng hình dáng này cũng bị thay đổi do những nang trứng phát triển hay do sự tồn tại của thể vàng Buồng trứng gồm có hai miền: miền tuỷ bên trong và miền vỏ bên ngoài Miền tuỷ

có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết Miền vỏ gồm các tế bào và các

mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hocmon Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phương, đầu tiên được gọi là biểu mô sinh dục bởi vì người ta tin rằng nó là nguồn gốc của tế bào sinh dục cái Giờ đây người ta biết rằng tế bào sinh dục không xuất phát từ lớp biểu mô này Chúng có nguồn gốc từ mô ruột của phôi và sau đó

di chuyển vào miền vỏ tuyến sinh dục của phôi Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết gọi là áo trắng buồng trứng Phía dưới áo trắng là nhu mô, được coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hocmon buồng trứng

Người ta cho rằng tất cả nang sơ cấp được hình thành trước khi con vật cái được sinh ra Nang sơ cấp (nang bậc I) là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp tế bào hạt Chúng nằm trong nhu mô và thường xuyên được nhìn thấy theo nhóm gọi là tổ trứng Người ta ước lượng rằng có khoảng

75000 nang sơ cấp được tìm thấy trong buồng trứng bê Với sự phát triển liên tục và thành thục trong suốt đời sống sinh sản, mỗi bò già chỉ có khoảng 2500 noãn bào có khả năng phát triển Một số noãn bào có khả năng phát triển đã thành thục hoàn toàn và được giải phóng vào đường sinh dục để thụ tinh và phát triển thành bê Nhưng hầu hết noãn bào còn lại đã phát triển và thoái hoá

Vì thế, số noãn bào có khả năng phát triển thu được từ buồng trứng để tạo bê lớn hơn rất nhiều so với thực tế nhận thấy

Nang trứng thường xuyên ở trạng thái phát triển và thành thục Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng

có khả năng phát triển Một tế bào trứng có khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều lớp tế bào hạt gọi là nang thứ cấp (nang bậc II) Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành một xoang Khi một xoang đã được hình thành thì nang

đó được gọi là nang bậc III Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng, được gọi là nang Graaf Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng Đây là một dịch nhớt giàu hocmom sinh sản và các yếu tố khác giúp điều hoà chức năng buồng trứng

Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng Ngoài cùng là lớp tế bào sợi được gọi là tế bào vỏ bên ngoài Tiếp theo

là lớp tế bào vỏ bên trong Trong lớp này có nhiều mạch máu Các tế bào vỏ

và các mạch máu được hình thành khi nang trứng lớn lên và di chuyển vào miền tuỷ Màng mềm tách lớp tế bào vỏ bên trong khỏi lớp tế bào trong cùng

- lớp tế bào hạt và ngăn cản sự di chuyển của hệ thống mạch máu vào các tế bào này Các tế bào hạt bao quanh xoang Ngoài ra khối Cumulus Oophorus -

tế bào hạt nằm ở bên kia của xoang Noãn bào có khả năng phát triển nằm trong khối tế bào Cumulus với các tế bào hạt bao quanh Những tế bào hạt bao quanh và tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có khả năng phát triển được gọi là vành phóng xạ Khi rụng trứng xảy ra, nang trứng vỡ đẩy dịch nang trứng, một số tế bào hạt và tế bào trứng có khả năng phát triển vào xoang cơ thể gần với chỗ mở ra của ống dẫn trứng Trong lúc giải phóng ra, tế bào trứng được bao quanh bởi vành phóng xạ và một khối tế bào hạt (Cumulus) dính giúp ống dẫn trứng thu tế bào trứng và dịch chuyển trong ống dẫn trứng

Nang trứng vỡ làm chảy máu, do đó hình thành cục máu ở vị trí trứng rụng Nang trứng vỡ chứa đầy máu được gọi là thể huyết Thể huyết sau đó

được thay thế bằng thể vàng là một thể cứng được hình thành nhanh chóng bởi hỗn hợp tế bào vỏ và tế bào hạt Có hai loại tế bào được tìm thấy trong thể vàng Loại tế bào thể vàng nhỏ có nguồn gốc từ tế bào vỏ và loại tế bào lớn có nguồn gốc từ tế bào hạt Trong thể vàng có nhiều mạch máu và là nguồn progesteron và các progestin khác duy nhất của buồng trứng Khi thể vàng thoái hoá, nó không còn phân tiết progesteron nữa Nó thay đổi màu sắc cuối cùng trở thành một cái sẹo màu trắng trên bề mặt buồng trứng Nếu gia súc có chửa, thể vàng sẽ được duy trì đến cuối giai đoạn mang thai

2.2.3.2 Cấu tạo tế bào trứng

Hình thái: tế bào trứng bò là một loại tế bào lớn nhất trong cơ thể (0,135-0,145mm), có dạng hình cầu

Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: (Trần Tiến Dũng và cs (2002)[1]) nguyên sinh chất, nhân và màng bao Đi từ ngoài vào trong thì tế bào trứng có cấu tạo:

Màng ngoài cùng: là đám tế bào Cumulus, có dạng lầy nhầy, không rõ hình dạng, cấu trúc, bao gồm nhiều lớp tế bào hình nang, hình chóp, những tế bào này được phân bố khắp xung quanh tế bào trứng nên được gọi là màng phóng xạ Các tế bào này được gắn với nhau bởi axit Hyanuronilic

Lớp màng giữa: bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ lớp tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡng tế bào trứng còn được gọi là màng trong suốt, màng này đảm bảo dinh dưỡng cho tế bào trứng ở trong buồng trứng

Lớp màng trong: là một lớp tế bào màng mỏng bao bọc phần nguyên sinh chất gọi là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất Màng này có tác dụng nuôi dưỡng trứng đã thụ tinh

Ở giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng trống Khoảng trống có độ dầy 14-15µm, có độ pH = 3-5, chứa dịch có nồng độ ion cao

Nguyên sinh chất: bao quanh nhân trứng, thành phần chủ yếu của nguyên sinh chất là: nước, muối khoáng, các vật chất hữu cơ, các men và đặc biệt là các bào quan của tế bào

Nhân trứng: bao gồm lưới nhiễm sắc thể (NST) và nhiều hạt nhân Ở bò

có 29 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính

Đặc điểm chính trong các đợt phát triển nang này là sự phát triển có tính tự điều khiển và cạnh tranh giữa các nang Mỗi đợt có một nang chiếm

ưu thế (nang khống chế) tiết ra chất ihibin đè nén sự tăng trưởng của các nang khác Tuy vậy, trong khi thể vàng còn tồn tại nang khống chế này sẽ bị thoái hoá; chỉ có ở đợt cuối cùng, khi thể vàng không còn thì nang khống chế mới phát triển tới chín và sự rụng trứng mới xảy ra, chính đây là lý do giải thích tại sao mỗi chu kỳ động dục của bò chỉ có 1 trứng chín và rụng (cá biệt có 2) Trong mỗi đợt sóng như vậy, sự tồn tại của các nang không phải nang khống chế dao động 5- 6 ngày Riêng nang khống chế có thể phát triển nhanh sau 18

ngày, tốc độ phát triển nang ở thời điểm này có thể đạt 1,6mm/ngày Trong công nghệ cấy phôi, việc gây rụng trứng nhiều trong một lần động dục bằng cách đưa gonadtropin ngoại lai vào cơ thể là quá trình khống chế ảnh hưởng của nang trội đối với các nang phát triển, hoặc làm thoái hoá nang trội, tạo điều kiện cho một loạt nang phát triển đồng thời tới chín và rụng để quá trình thụ tinh tạo được nhiều phôi trong một chu kỳ động dục của bò

2.3 THU TẾ BÀO TRỨNG BÒ

Một bước quan trọng trong kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm cũng như trong kỹ thuật cloning tế bào soma là việc thu tế bào trứng để nuôi thành thục trong ống nghiệm Tế bào trứng bò có thể được thu từ buồng trứng lấy ở lò

mổ bằng kỹ thuật hút dịch nang trứng, kỹ thuật giải phẫu nang trứng hay từ gia súc sống bằng kỹ thuật nội soi và siêu âm Có thể hút dịch nang trứng từ

Sóng nang và tính trội của nang:

gia súc sống 2 lần/tuần trong khoảng thời gian dài và đây là một phương pháp thay thế cho tế bào trứng thu được từ buồng trứng lấy ở lò mổ để tạo phôi với

số lượng lớn (Bols và cs (2004)[19], Galli và cs (2001)[33] Các tác giả này

đã khẳng định rằng hút dịch nang trứng từ gia súc sống lặp lại có thể thực hiện ít nhất 2 lần/tuần trong nhiều tháng mà không cần phải dùng hocmon để kích thích Việc áp dụng kỹ thuật nào để thu tế bào trứng phụ thuộc vào trang thiết bị và kỹ thuật của mỗi phòng thí nghiệm Tuy nhiên, kỹ thuật thu tế bào trứng ở gia súc sống có ý nghĩa lớn vì biết rõ được nguồn gốc và tiềm năng di truyền của con cái Kỹ thuật này đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hút nội soi đắt tiền

Lựa chọn tế bào trứng bò cho, nuôi trong ống nghiệm (IVM) trên cơ sở đánh giá dưới kính hiển vi về những đặc điểm hình thái của chúng Loos và cs (1989)[48] đã chia trứng bò nuôi trong ống nghiệm thành 4 loại dựa trên sự chặt chẽ và trong suốt của tế bào Cumulus bao quanh tế bào trứng, sự đồng nhất và trong suốt của noãn bào chất (ooplasma) Sau đó Loos và cs đã mô tả hình thái của trứng sau khi IVM và so sánh với hình thái của tế bào trứng thành thục In -vivo Các tác giả này kết luận rằng có một sự dao động đáng kể

về hình thái giữa các tế bào trứng có khả năng phát triển bình thường

Loại Tổ hợp tế bào trứng-Cumulus (Cumulus-Oocyte Com plex - COC)

1 Các lớp Cumulus chặt chẽ, noãn bào chất đồng nhất Khối COC sáng

và trong suốt

2 Các lớp Cumulus chặt chẽ, noãn bào chất đồng nhất, nhưng có những

vùng tối phía ngoài tế bào trứng; khối COC sáng ít và ít trong suốt

3 Các lớp Cumulus ít chặt chẽ, trứng không đều có các đám đen, khối

COC tối hơn loại 1 và 2 ở trên

4 Các lớp Cumulus giãn nở, các tế bào Cumulus tụ tập thành từng đám

tối, noãn bào chất không đồng đều với các đám tối, khối COC tối và không đều

Tế bào trứng thành thục In-vivo, các tế bào trứng thứ cấp hình thành một nhóm đồng nhất về hình thái, trong khi đó các tế bào trứng nuôi thành thục trong ống nghiệm hình thành nên các nhóm không đồng nhất

2.4 NUÔI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM 2.4.1 Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm

Môi trường dùng cho nuôi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm không chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ tế bào trứng bò đạt tới trung kỳ II và có khả năng diễn ra thụ tinh, mà còn ảnh hưởng tới sự phát triển tiếp theo của phôi Các môi trường thường dùng để nuôi thành thục tế bào trứng bò trong ống nghiệm có thể chia thành 2 loại: đơn giản và phức tạp Các loại môi trường đơn giản thường là các hệ thống đệm bicacbonate có chứa muối sinh lý cơ bản với pyruvat, lactate và glucose Những khác biệt chính giữa các loại môi trường đơn giản là sự khác biệt về nồng độ ion của chúng và nồng độ các nguồn năng lượng Các loại môi trường thường được bổ sung thêm huyết thanh hay albumin và kháng sinh (penicillin, streptomycin, gentamycin) Môi trường phức tạp, ngoài các thành phần cơ bản của môi trường đơn giản, có chứa các axit amin, vitamin, purin và các chất khác, chủ yếu là các chất được tìm thấy trong huyết thanh

Một trong những môi trường phức tạp được sử dụng rộng rãi để nuôi tế bào trứng bò trong ống nghiệm là môi trường nuôi cấy mô 199 (TCM-199) Môi trường này chứa các loại muối Earle, đệm bằng N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N’-(2-ethanesulphonic acid) và sodium bicarbonate và bổ sung thêm pyruvat, lactate, axit amin, vitamin, purin và các chất khác tìm thấy rong huyết thanh TCM -199 là môi trường chuẩn để nuôi tế bào trứng bò và cừu trong ống nghiệm ở Ailen Ở Đan Mạch và Canada, môi trường F10 được dùng nhiều cho nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm

Hầu hết các phòng thí nghiệm TTON đều sử dụng TCM-199 làm môi trường cơ bản cho nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm và có rất ít báo cáo chỉ

ra rằng các môi trường khác có phù hợp không Kajihara và cs (1999)[40] nhận thấy rằng không có sự khác nhau về tỷ lệ phân chia, tỷ lệ phôi dâu, phôi nang giãn nở khi tế bào trứng sau khi được nuôi thành thục, thụ tinh trong môi trường M-199 so với CR1aa Môi trường F-10 gồm hệ đệm Kreb Ringer Bicacbonate bổ sung thêm pyruvat, lactate, axit amin, vitamin, các nguyên tố

vi lượng và các chất khác tìm thấy trong huyết thanh như thymidyne và hypoxanthine Ngoài ra còn có penicillin, streptomycin, albumin và huyết thanh bổ sung

Một điểm chính cần biết về các loại môi trường nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm, dù đơn giản hay phức tạp là cần phải xác định chính xác các thành phần trên cơ sở các nhu cầu đã cải tiến Thực tế, môi trường được bổ sung hypoxathine có thể được sử dụng với mục đích giúp phân bào giảm nhiễm trở lại của tế bào trứng ở một số động vật có vú Các môi trường sử dụng cho nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm hiện nay có chứa huyết thanh bò hay các thành phần tế bào, điều đó có nghĩa là nhiều chất chưa được biết đang

có mặt trong môi trường nuôi và nồng độ của nhiều chất không thể xác định được một cách chính xác

Đã có nghiên cứu chỉ ra rằng tế bào trứng chuột có thể nuôi thành thục

và thụ tinh trong môi trường không có huyết thanh Họ đã sử dụng môi trường Ham’ F10 có bổ sung albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin- BSA) để cung cấp một môi trường không có huyết thanh và nhận thấy “màng trong suốt cứng lại” không phải là do thiếu huyết thanh Tuy nhiên, Eppig và

cs (1992)[29] đã báo cáo rằng có thể bổ sung fetuin vào môi trường nuôi để ngăn cản sự cứng lại của màng trong suốt Fetuin là một lycoprotein chính trong huyết thanh bào thai bê (FCS) và được coi là yếu tố ngăn cản màng

trong suốt cứng lại khi tế bào trứng chuột được nuôi trong môi trường không

có huyết thanh

Đã có nhiều nghiên cứu báo cáo rằng gonadotropin, steroid và các yếu

tố tế bào tất cả tương tác với nhau để hỗ trợ trứng thành thục In-vivo Nang trứng trước rụng trứng có thể coi là một cấu trúc mà ở đó hàng triệu tế bào soma đóng góp cho sự phát triển của tế bào sinh dục: tế bào trứng Trong nhiều năm người ta biết rằng tế bào trứng có quan hệ chặt chẽ với tế bào Cumulus Những tế bào Cumulus tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có nguyên sinh chất kéo dài, xuyên qua màng trong suốt và kết thúc ở chỗ phồng

ra gần với màng tế bào trứng Tầm quan trọng của chỗ nối này tăng lên khi người ta biết rằng màng tế bào trứng không có khả năng xuyên thấm đối với các chất trao đổi có phân tử lượng thấp Sự xâm nhập của các chất đó được biết là thông qua chỗ tiếp xúc giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus

Sự tương tác trao đổi chất giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus đóng một vai trò dinh dưỡng quan trọng trong giai đoạn trứng thành thục Người ta cũng biết rõ rằng các tế bào Cumulus liên kết với nhau bằng những chỗ trống tiếp xúc và những chỗ trống tiếp xúc này cho phép các chất có phân tử lượng thấp đi qua từ tế bào này sang tế bào khác Các tế bào Cumulus liên kết với các tế bào hạt, mà các tế bào hạt lại đi kèm với các tế bào vỏ bên trong Như vậy, có khả năng các chất do tế bào hạt tạo ra sẽ đi vào các tế bào nang trứng

và sau đó đi vào tế bào trứng

2.4.2 Đánh giá sự thành thục của tế bào trứng nuôi trong ống nghiệm

Các giai đoạn thành thục nhân

Trong quá trình nuôi thành thục trứng bò, cấu trúc chất nhiễm sắc trong trứng chưa thành thục diễn ra một loạt sắp xếp hình thái, bắt đầu từ tiền kỳ của sự phân chia giảm nhiễm lần thứ nhất và tiếp tục đến trung kỳ của lần phân chia giảm nhiễm lần thứ 2 Một số tác giả đã mô tả những thay đổi xảy

ra trong quá trình nuôi trong ống nghiệm Screean (1968)[58] báo cáo rằng 80% tế bào trứng bò thành thục sau khi bắt đầu nuôi 24 giờ trong ống nghiệm, màng nhân biến mất sau 5-6 giờ và đạt tới trung kỳ I sau 12 giờ Khoảng thời gian đỉnh điểm tế bào trứng đạt tới trung kỳ II là 24 giờ

Phát triển của tế bào Cumulus

Quá trình thành thục của trứng bò trong ống nghiệm liên quan đến sự phát triển và những thay đổi ở tế bào Cumulus bao quanh trứng Như báo cáo của Hensleigh và Hunter (1985)[38], các tế bào Cumulus phát triển hình thành một khối hình cầu và khối tế bào - Cumulus (COC) dường như nổi lên trong đĩa nuôi Người ta biết rằng các tế bào Cumulus được kích thích bởi gonadotrophin (FSH) và yếu tố sinh trưởng (EGF) để tạo ra và phân tiết hyaluronic axit, một chất làm phân tán tế bào, một quá trình được coi như phát triển giãn nở

2.5 HOẠT HOÁ TINH TRÙNG

2.5.1 Khái niệm

Việc sản xuất ra tinh trùng ở con đực là một quá trình phức tạp, xảy ra

ở tinh hoàn, tế bào mầm tinh nguyên bào (Spermatogonia) trên cơ sở của ống sinh tinh (Seminiferous Tubules) phân chia nguyên nhiễm để duy trì số lượng của chúng và để theo chu kỳ tạo ra tinh bào sơ cấp, sau đó tinh bào sơ cấp trong quá trình phân bào giảm nhiễm tạo ra các tinh tử đơn bội, những tinh tử đơn bội đó được biệt hoá thành tinh trùng và giải phóng vào lòng ống sinh tinh Kích thước tinh trùng bò rất nhỏ, chỉ bằng khoảng 1/20 nghìn thể tích tế bào trứng Sự thụ tinh của tế bào trứng bò liên quan đến một loạt các hoạt động mà ở đó tinh trùng phải có: 1- vận động (tiến tới tế bào trứng và di chuyển qua màng trong suốt); 2- có khả năng hoạt hoá và có phản ứng acrosome; 3- có khả năng gắn vào màng trong suốt và màng noãn hoàng nhờ

protein kết dính chính xác được tạo ra trong lúc trưởng thành và biểu lộ những bề mặt kết dính này với tế bào trứng ở một thời điểm phù hợp; 4- có khả năng hợp nhất với Oolea và hoà nhập với nhân của tế bào trứng Tinh trùng đạt được những khả năng này khi chúng đi qua phụ dịch hoàn

Khái niệm hoạt hoá lần đầu tiên được Austin (1951)[15] và Chang (1951)[26] nhận biết và mô tả một cách độc lập với nhau Họ đã chứng minh rằng tinh trùng của động vật có vú có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng thành thục chỉ sau khi chúng có một thời gian di chuyển ở trong đường sinh dục cái

Hoạt hoá giờ đây đã được nhận biết một cách rõ ràng như một quá trình

mà ở đó tinh trùng diễn ra một loạt các phản ứng sinh lý và sinh hoá phức tạp trước khi có khả năng thụ tinh với tế bào trứng thành thục Người ta cho rằng giai đoạn đầu tiên của quá trình hoạt hoá liên quan loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh, phụ dịch hoàn, ống dẫn tinh và tinh thanh Trong khi di chuyển từ tinh hoàn qua phụ dịch hoàn, tinh trùng được thay đổi để trở thành những tế bào thành thục có khả năng thụ tinh và dự trữ ở đuôi phụ dịch hoàn đến khi được giải phóng ra trong quá trình xuất tinh hay thải vào nước tiểu

Trong việc định nghĩa hoạt hoá, một số nhà nghiên cứu đưa cả khái niệm phản ứng acrosome vào, trong khi một số khác lại không đưa vào Khái niệm được Furuya và cs (1992)[32] đưa ra: hoạt hoá là một chuỗi thay đổi sinh hoá mà những thay đổi đó làm tinh trùng có thể diễn ra phản ứng acrosome khi tiếp xúc với màng trong suốt, mà màng trong suốt dường như là tác nhân sinh lý gây nên phản ứng đó Ở bò, dựa vào sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào tế bào trứng sau khi thụ tinh nhân tạo, thời gian cần cho hoạt hoá của tinh trùng trong đường sinh dục cái khoảng 6 giờ Tuy nhiên, các

yếu tố ở đường sinh dục bò cái liên quan tới hoạt hoá và nguồn gốc của chúng vẫn chưa được rõ

2.5.2 Các kỹ thuật kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng trong TTON

2.5.2.1 Kỹ thuật bơi ngược dòng (siwm up)

Chuyển động là một đặc điểm quan trọng của tinh trùng bò vì chúng phải đi qua đường sinh dục cái và ảnh hưởng đến sự thụ tinh Sự xâm nhập của tinh trùng qua màng trong suốt đòi hỏi một sự chuyển động rất mạnh của tinh trùng Kỹ thuật Swim-up trở thành một kỹ thuật có thể chấp nhận được

để thu được tinh trùng có hoạt lực cao dùng cho TTON ở bò Kỹ thuật

Swim-up thường liên quan đến việc giải đông tinh trùng và đưa chúng vào một thể tích môi trường thích hợp Môi trường này thường là môi trường không có canxi-tyrode/albumin/Na lactate/Na pyruvate (TALP) và được dùng cả cho kỹ thuật Swim-up và tiếp theo là rửa tinh trùng Mẫu tinh trùng được để trong tủ nuôi ở nhiệt độ 39oC từ 30-60 phút, trong thời gian đó những tinh trùng có hoạt lực tốt trong tinh dịch sẽ bơi lên phía trên môi trường TALP Mặc dù kỹ thuật Swim-up có thể cho mẫu tinh trùng có hoạt lực cao nhưng chúng cũng

có những bất lợi vì số lượng tinh trùng bơi lên tương đối thấp, đó là điều quan tâm trong thực tế khi sử dụng tinh cọng rạ rất đắt Các nhà khoa học cũng báo cáo rằng sử dụng kỹ thuật Swim-up trong TTON ở bò có một ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ thụ tinh Tỷ lệ thụ tinh thường tăng từ 46% lên 59% và các mẫu tinh trùng từ kỹ thuật Swim-up cho thấy tinh trùng có hoạt lực cao Tuy nhiên trong thực tế Swim-up không được sử dụng nhiều Catt (1990)[25] chỉ

ra rằng một số lượng lớn tế bào trứng đã được thụ tinh với phần môi trường

có tinh trùng bị bỏ đi Nhu cầu sử dụng kỹ thuật Swim-up có thể lớn hơn khi chất lượng tinh trùng và hoạt lực tinh trùng kém

2.5.2.2 Kỹ thuật lọc qua màng lọc thuỷ tinh (phân lớp Percoll)

Trong những năm 1950, người ta đã chỉ ra rằng tinh dịch bò pha loãng,

khi lọc qua một lớp thuỷ tinh nhỏ thì những tinh trùng chết bị màng lọc giữ lại, còn những tinh trùng sống đi qua được Gần đây, Daya và cs (1987)[28] đã sử dụng cột hạt thuỷ tinh để tách tinh trùng ở người; họ nhận thấy kỹ thuật này

có thể tin tưởng được và là một kỹ thuật có kết quả ổn định để tách các tinh trùng có hoạt lực từ những tinh dịch có chất lượng kém Khi lọc tinh trùng bằng cột màng thuỷ tinh cho số lượng tinh trùng có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng cao Khi so sánh với kỹ thuật lọc tinh trùng bằng Swim-up, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phát triển phôi là tương tự nhau song lọc bằng màng lọc thuỷ tinh chỉ đòi hỏi mất ba phút để hoàn thành, điều đó làm cho việc xử lý tinh trùng trong ống nghiệm tiết kiệm được nhiều

Ở sự chênh lệch tỷ trọng Percoll, tinh trùng được tách bằng cách cân bằng khi tỷ trọng của tinh trùng tương đương với tỷ trọng của sự chênh lệch Người ta cho rằng những tinh trùng có hình thái nhân tốt dầy đặc hơn so với những tinh trùng kém hơn và được lựa chọn ở phần tỷ trọng cao hơn của sự chênh lệch Percoll Người ta cũng nhận thấy rằng tách tinh trùng bằng Percoll cho tinh trùng có chất lượng tốt hơn so với phương pháp lựa chọn tinh trùng bằng Swim-up

2.6 SINH LÝ QUÁ TRÌNH THỤ TINH

2.6.1 Quá trình thụ tinh

Thụ tinh là quá trình đồng hoá giữa trứng và tinh trùng để tạo thành hợp tử 2n NST có bản chất hoàn toàn mới và có khả năng phân chia nguyên nhiễm liên tiếp tạo thành phôi Đó là sự tái tổ hợp các gen từ hai nguồn gen

khác nhau Sau khi rụng, tế bào trứng và dịch nang trứng được hút vào loa kèn rồi vận chuyển nhanh đến chỗ phình của ống dẫn trứng Trong thời gian

di chuyển, dịch ống dẫn trứng có tác động nhất định đối với tế bào trứng, lớp

tế bào vành phóng xạ của tế bào trứng cũng bị mất đi một phần bởi tế bào hình trụ ống dẫn trứng bào mòn

Sau khi thụ tinh (nhân tạo hay phối giống), tế bào tinh trùng tiến nhanh qua tử cung đến 1/3 phía trên của ống dẫn trứng trong vòng 5-15 giờ tuỳ loài nhờ nhu động của tử cung, ống dẫn trứng và hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng Quá trình thụ tinh xảy ra tốt nhất khi trứng và tinh trùng gặp nhau tại 1/3 phía trên ống dẫn trứng Các giai đoạn của quá trình thụ tinh diễn ra như sau:

Khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng, nó tiết ra một chất kích thích Ferilinzin làm cho tinh trùng hoạt động mạnh và tiến tới bao vây trứng Đồng thời xoang Aroxom của tinh trùng cũng tiết ra men Hyaluronidaza để phá vỡ lớp tế bào của màng phóng xạ nhờ hai quá trình phân giải và thuỷ phân Lượng tinh trùng để tiết ra men Hyaluronidaza làm nhiệm vụ phá vỡ lớp tế bào của màng phóng xạ ở các loài gia súc phải có một số lượng nhất định, men này cho hiệu quả tốt nhất khi có nồng dộ 4-6 mg% trong tinh dịch Tinh trùng của loài nào thì thụ tinh với trứng của loài đó đây chính là tín hiệu loài, tuy nhiên men Hyaluronidaza do tinh trùng tiết ra không đặc trưng cho loài cho nên tinh trùng của gia súc này có thể tiết men Hyaluronidaza để phá vỡ tế bào vành phóng xạ của tế bào trứng của loài gia súc khác

Tinh trùng đi vào tế bào trứng:

Sau khi phá vỡ lớp tế bào của màng phóng xạ nhờ men Hyaluronidaza, tinh trùng tiếp xúc với màng trong suốt của tế bào trứng Tại đây, tinh trùng tiết ra men Zonalizin phá vỡ màng trong suốt tạo thành khe hở, tạo điều kiện cho vài chục tinh trùng chui vào “khoảng trống”, ở đây tinh trùng được hồi

phục sức lực Số tinh trùng này tiếp tục phá vỡ màng noãn hoàng nhờ men Muraminidaza và chỉ cho một tinh trùng đi vào nhân tế bào trứng

Hai men Zonalizin và Muraminidaza là hai men đặc hiệu chủng loài nên chỉ cho phép tinh trùng cùng loài đi vào trong nhân của tế bào trứng để xảy ra quá tình thụ tinh Những khe hở để tinh trùng đi qua được đóng mở theo cơ chế đông máu với sự tham gia của ion Ca++

Khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng thì phần đầu của tinh trùng kết hợp với nhân tế bào trứng và xảy ra quá trình đồng hoá, dị hoá giữa hai loại tế bào, phần thân và đuôi của tinh trùng được nguyên sinh chất của tế bào trứng đồng hoá và tiêu tan

Sau khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng, lúc này xảy ra quá trình đồng hoá và dị hoá phức tạp Thực chất của quá trình thâm nhập là khích thích tế bào phân chia giảm nhiễm lần II hoàn thành quá trình chín của nó Sau khi thâm nhập vào tế bào trứng đầu tinh trùng tăng lên về thể tích rồi hình thành các nhân nguyên, sau đó các nhân nguyên chui qua màng tế bào

Khi nhân nguyên đực và nhân nguyên cái phối hợp với nhau có chọn lọc hình thành hợp tử và tiếp tục phân chia

2.6.2 Đặc điểm của phôi giai đoạn đầu

Sau khi hợp tử hình thành cùng với sự di chuyển của tế bào trứng đến nơi làm tổ theo quy định của giống loài, trứng bắt đầu phân chia theo cấp sô nhân: 1 thành 2, 2 thành 4 Do sự phân chia mà hình thành nên đường biên giới giữa các tế bào gọi là cầu phân chia, cầu phân chia có những rãnh dọc ngang gọi là rãnh phân chia Cầu phân chia to nhỏ khác nhau, màu sáng tối không giống nhau Những cầu mầu tối sẽ hình thành thân phôi, cầu màu sáng sẽ hình thành nên các khí quan, quá trình phân chia này diễn ra ở ống dẫn trứng

Một đặc điểm nữa của phôi là giai đoạn đầu của quá trình phân chia không làm phôi lớn lên về kích thước vì toàn bộ quá trình phân chia diễn ra

trong màng trong suốt Trong quá trình phân chia, cầu phân chia nhỏ đi hình thành các đám tế bào, giữa các đám tế bào đó có xoang chứa dịch keo to dần lên, lúc này kích thước phôi mới tăng lên, cuối cùng phá vỡ màng trong suốt, phôi chui ra ngoài, giai đoạn này tương ứng với ngày thứ 9-11 sau khi thụ tinh Thông thường phôi ở ngày thứ 5, 6 có 16-32 hoặc 64 phôi bào trở lên được gọi là phôi dâu (morula) vì trông nó nổi lên giống hệt quả dâu khi nhìn qua kính hiển vi Giai đoạn giữa và cuối của phôi dâu khó xác định được số phôi bào đã phân chia Những tế bào phôi sẽ tiết ra một ít dịch và hình thành nên một xoang gọi là xoang phôi, xoang này dần lớn lên và có thể nhận biết qua kính hiển vi Phôi khi đã hình thành xoang gọi là phôi nang (blastocyst) Xoang phôi lớn dần lên đẩy khối tế bào về một cực, khối tế bào này gọi là đĩa phôi hay mầm phôi Mầm phôi sau này biệt hóa hình thành nên các cơ quan

bộ phận của cơ thể Khối tế bào bao bọc mầm phôi và thành vách của xoang phôi gọi là lớp màng nuôi hay dưỡng bào (trophoblast) sau hình thành nên hệ thống nhau thai

Dựa vào các đặc điểm trên cùng kết quả của các nghiên cứu, phôi thường được thu vào ngày thứ 7 sau khi phối giống hoặc thụ tinh do phôi ở thời điểm này là phôi dâu, phôi nang, là loại phôi tốt nhất cho đông lạnh cũng như cấy truyền

2.7 TẠO PHÔI BẰNG TẾ BÀO TRỨNG THU TỪ BÒ SỐNG

Công nghệ cấy truyền phôi (CTP) truyền thống ngày nay đã có một kết quả tương đối ổn định và nhiều kỹ thuật viên CTP đã có trên 20 năm kinh nghiệm trong một công nghệ đã chín muồi Năm 1999, hơn 500.000 phôi đã được tạo ra và khoảng 440.000 phôi đã được cấy cho con nhận, trong đó khoảng 31.000 phôi thụ tinh ống nghiệm đã được cấy cho con nhận

Ở giai đoạn đầu của kỹ thuật tạo phôi trong ống nghiệm, nguồn tế bào trứng được thu từ buồng trứng lấy ở lò mổ Từ năm 1988, tế bào trứng đầu

tiên được Pieterse và cs [53] thu từ gia súc sống với sự trợ giúp của hệ thống siêu âm qua âm đạo (OPU) Siêu âm hút trứng qua âm đạo là một kỹ thuật thu

tế bào trứng chưa thành thục từ con cho còn sống Phương pháp này được xây dựng trên cơ sở phương pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản của người

Phương pháp OPU được sử dụng để khai thác trứng từ các cá thể có tiềm năng di truyền cao, kết hợp thụ tinh ống nghiệm cho phép tạo ra các phôi

có chất lượng tốt bằng việc chủ động dùng các nguồn tinh đực giống Các phôi này được cấy vào các bò nhận đồng pha để sinh ra các bê con có tiềm năng năng suất cao

Các thí nghiệm về thu tế bào trứng bò bằng phương pháp dùng siêu âm được tiến hành đầu tiên bởi Callesen và cs (1987)[24]; sau đó Pieterse và cs (1988)[53] là những người đầu tiên sử dụng phương pháp OPU như là một phương pháp khai thác trứng một cách hiệu quả và đều đặn trên đối tượng bò

Phương pháp OPU đòi hỏi phải có các thiết bị và dụng cụ chuyên dụng như máy siêu âm, đầu dò, kim chọc hút cũng như tay nghề cao của người thao tác Phương pháp OPU cho phép hút các trứng trong nang của buồng trứng từ con vật đang sống Con vật đưa vào khai thác được đứng trong giá cố định và người thao tác một tay đưa vào trực tràng kiểm soát buồng trứng, áp buồng trứng vào đầu dò, tay kia điều kiển kim hút

Khi quan sát thấy nang trứng xuất hiện trên màn hình của máy siêu âm, một tay (thông qua trực tràng) cố định buồng trứng áp sát vào đầu dò và tay kia ấn nhẹ kim chọc hút vào lòng nang trứng Thao tác này diễn ra nhẹ nhàng

và hình ảnh kim hút chọc vào nang sẽ hiện rõ trên màn hình máy siêu âm giúp người thao tác điều chỉnh chính xác và nhịp nhàng kim hút Những hình ảnh lần lượt hiện ra trên màn hình máy siêu âm giúp chúng ta biết được hướng đi của kim, vị trí nang trứng và vị trí kim chọc vào nang

Phương pháp khai thác trứng bò từ buồng trứng (phương pháp in-vitro

và phương pháp OPU) phục vụ công nghệ phôi cho phép cung cấp một số lượng lớn trứng với chất lượng tốt Phương pháp thu trứng in-vitro được sử dụng cho các nghiên cứu cơ bản tại hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới Phương pháp OPU kết hợp thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi đặc biệt có giá trị trong việc nhân nhanh các cá thể có tiềm năng năng suất cao Trứng bò sau khi được khai thác từ buồng trứng bò bằng một trong các phương pháp trên , chúng được phân loại và lập tức đưa vào các môi trường nuôi giàu dinh dưỡng

Tạo phôi trong ống nghiệm từ tế bào trứng của những con vật sống là một kỹ thuật linh hoạt bởi vì nó có thể áp dụng cho những con cho ở tất cả các giai đoạn tuổi từ bê 2 tháng tuổi đến những con bò rất già Nó có thể sử dụng cho những con cạn sữa hay đang vắt sữa và thậm chí ở giai đoạn có chửa đến tháng thứ 3 hay thứ 4 Nó không ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của con cho bởi vì không đòi hỏi sự khích thích của hocmon

2.8 NUÔI PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM

Trong những thập kỷ qua, khả năng nuôi phôi trong ống nghiệm ở giai đoạn đầu của nhiều loài động vật có vú trở thành hiện thực Từ cuối những năm 1960, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau để nuôi phôi ở giai đoạn đầu và hầu hết các loại môi trường đều dựa vào các chất

có trong ống dẫn trứng và dựa vào kiến thức về trao đổi chất của phôi Tế bào của ống dẫn trứng được sử dụng thành công đầu tiên trong các hệ thống nuôi kết hợp ở cừu và bò, việc sử dụng hệ thống nuôi các tế bào ống dẫn trứng ở cừu đã đặt những nền móng quan trọng cho việc nuôi phôi trong ống nghiệm Tuy nhiên, sau đó người ta đã biết rõ rằng không chỉ các tế bào ống dẫn trứng

mà còn nhiều loại tế bào sô ma khác cũng có khả năng cung cấp môi trường phù hợp để phôi vật nuôi có thể phát triển

Các môi trường nuôi thông thường là những môi trường được phát triển

để nuôi tế bào Việc sử dụng các loại môi trường này để nuôi phôi vật nuôi cho kết quả không thống nhất Các nhà khoa học đã báo cáo rằng hầu hết phôi nuôi bằng những môi trường này thường dừng phát triển ở giai đoạn 8 tế bào Ngoài ra chỉ số ít phôi nuôi lâu hơn cho thấy sự phân chia bình thường và hầu hết không phát triển khi cấy cho con nhận

Khi nuôi phôi ở giai đoạn đầu, nhiều công thức dựa trên dung dịch muối Krebs ringer Bicarbonate (KRB) đã sử dụng pyruvate, glucose và lactate làm nguồn năng lượng Những môi trường này còn được bổ sung thêm một nguồn protein như huyết thanh thai bê (FCS) hay albumin huyết thanh bò (BSA)

Ở hầu hết các phòng thí nghiệm, phôi dâu và phôi nang động vật có vú

có thể thu được bằng sự nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm/thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng Tuy nhiên dừng phát triển ở giai đoạn trước hay sau 8 tế bào khi sử dụng các loại môi trường nuôi chỉ bổ sung thêm huyết thanh bê đã đưa các nhà khoa học phải nghĩ đến các môi trường nuôi thay thế có sử dụng

tế bào Cumulus hay tế bào ống dẫn trứng Một kỹ thuật nuôi thay thế khác nữa là sử dụng môi trường nuôi không bổ sung thêm các loại tế bào, điển hình

là môi trường nuôi cấy mô TCM-199 có bổ sung thêm huyết thanh

2.9 ĐÔNG LẠNH PHÔI

Đông lạnh phôi là quá trình chuyển phôi từ trạng thái sinh lý bình thường (trong cơ thể mẹ hoặc ngoài cơ thể mẹ ở nhiệt độ 37oC) sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh để cất giữ, bảo quản ở nhiệt độ sâu -196oC Phôi đông lạnh vẫn có thể sống, phát triển bình thường sau giải đông và đem cấy cho con cái nhận phôi động dục đồng pha hoặc sử dụng trong các kỹ thuật sinh sản khác Nhờ có kỹ thuật đông lạnh và bảo quản mà phôi động vật có thể thương mại hoá trong nước cũng như trên phạm vi quốc tế một cách dễ dàng vì không phải vận chuyển gia súc sống, tránh được sự thay đổi đột ngột bất lợi đối với gia súc cũng như tránh được sự lây truyền dịch bệnh giữa các

vùng lãnh thổ Ngoài ra, kỹ thuật đông lạnh và bảo quản phôi còn là nền tảng cho việc duy trì ngân hàng phôi đông lạnh của những động vật có nguy cơ bị diệt vong

Thành công đầu tiên của việc đông lạnh phôi động vật có vú được báo cáo ở chuột (Whittingham và cs (1972)[66]) Năm 1973, con bê đầu tiên ra đời bằng phôi đông lạnh-giải đông (Wilmut và Rowson [69]) Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được nghiên cứu từ năm 1984 Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12oC/phút) sau khi khử nước bộ phận ở nhiệt độ hiện trường trên phôi bò đã thành công với 63,40% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,20% (23/52) phôi nang thoát màng

và tỷ lệ có chửa sau khi cấy phôi đông lạnh - giải đông là 33,30% (7/21) (Bui Xuan Nguyen và cs (1984)[21]) Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs [6] đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol Năm 1990, bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu Đến nay đã có hàng trăm bê hướng sữa được sinh ra do cấy phôi đông lạnh trong nước cũng như phôi đông lạnh nhập khẩu

2.9.1 Cơ chế đông lạnh phôi

Khi hạ nhiệt độ, lúc xuất hiện tinh thể nước đầu tiên là bắt đầu thay đổi giai đoạn đông băng Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng độ hạ băng điểm của dung dịch Theo định luật Loi Raoult, độ hạ băng điểm của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ các chất hoà tan

Bên trong tế bào chứa hơn 80% nước, nồng độ nước này cao hơn bên ngoài tế bào Vì vậy, sự thay đổi giai đoạn đông lạnh nội bào xảy ra ở nhiệt

độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước được tạo thành trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào, làm tăng nồng

độ chất hoà tan nhanh chóng Đáp lại với sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước

sẽ đi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào Mức độ mất nước tế bào phụ

thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc độ này phải ở trên tốc độ giới hạn, mà tốc độ giới hạn lại thay đổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng đá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do đông lạnh hay giải đông Tốc độ đông lạnh ở dưới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ các chất hoà tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào Trong môi trường huyền phù (vừa lỏng vừa tinh thể) nước tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào Như vậy, sự hiện diện của tinh thể nước đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống sót của tế bào

Những hiện tượng vật lý chính xảy ra trong quá trình đông lạnh tế bào như sau: khi nhiệt độ hạ xuống -5oC, tế bào và môi trường xung quanh nó vẫn chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh chưa tạo đá (supercooling) và vì sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh Tinh thể sẽ hình thành ở bên ngoài tế bào ở nhiệt độ -5oC (do ngẫu nhiên hay do tạo mầm nước – seeding), nhưng các chất bên trong tế bào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ chưa tạo đá,

có thể màng tế bào trứng ngăn cản sự lan rộng tinh thể nước vào trong tế bào chất Theo định nghĩa, nước ở nhiệt độ lạnh chưa tạo đá bên trong tế bào có nồng độ hoá học cao hơn so với nước trong dung dịch được đông lạnh một phần bên ngoài tế bào, và đáp lại sự chênh lệch này nước sẽ đi ra ngoài tế bào

và đông lạnh bên ngoài tế bào

Các hiện tượng vật lý xảy ra tiếp theo bên trong tế bào phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh

do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hoá học ngoại bào Kết quả là tế bào mất nước và không đông lạnh bên trong tế bào Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh, nó

không có khả năng mất nước nhanh để duy trì cân bằng và vì vậy nhiệt độ lạnh chưa tạo đá tăng lên cuối cùng đạt được sự cân bằng bằng việc đông lạnh nội bào

Ở các loài động vật có vú, tuy đã có những phương pháp đông lạnh và giải đông thích hợp với phôi của mỗi loài, nhưng chúng đều phải chịu đựng những thay đổi như: sự bổ sung chất bảo vệ lạnh sinh học trong quá trình đông lạnh phôi còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh và phân tách chúng ra trong quá trình giải đông, sự thay đổi về giai đoạn của môi trường ở nhiệt độ tạo tinh thể nước đá bằng cảm ứng, tốc độ đông lạnh, sự mất nước trong quá trình đông lạnh

2.9.2 Những chất bảo vệ sinh học lạnh thông dụng

Phôi chỉ sống sót khi người ta bổ sung một dung môi hữu cơ hay còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh vào môi trường huyền phù để đông lạnh Các chất thường được sử dụng là: glycerol, dimethysufoxide (DMSO) và một số glycol (ethylen glycol, propylen glycol…) trong đó glycol là chất bảo vệ sinh học lạnh được sử dụng phổ biến trên nhiều loài động vật và có hiệu quả cao nhất

Glycerol có phân tử lượng 92, có độc tính nhẹ, có tác dụng như một chất chống đông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan trong nước và cồn Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên đóng băng ở dạng nhỏ, loại trừ được sự giãn nở của phân tử nước có kích thước lớn hơn, ngăn cản được sự phá vỡ màng tế bào Vì vậy mà glycerol giữ được sự ổn định về nồng

độ các chất hoà tan, không làm thay đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình đông lạnh Để phôi có thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phôi vào dung dịch PBS có nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định để thực hiện rút nước nội bào và

thay thế bằng glycerol Điều quan trọng nhất là thời gian và nồng độ thích hợp

để ngâm phôi, điều này phụ thuộc vào phôi của mỗi loài động vật và trạng thái phát triển của phôi

Năm 1977, Bilton và cs [18] đã sử dụng glycerol nồng độ 1,4M thu được phôi bò có sức sống cao khi đông lạnh với tốc độ -0,3oC/phút đến -30oC hoặc -35oC sau đó bảo quản phôi trong nitơ lỏng -196oC Renard và cs (1982)[56] đã cân bằng sáu bước với nồng độ glycerol ở mỗi bước là 0,25M; 0,5M; 0,75M; 1M; 1,25M và 1,5M cách nhau 10 phút và giữ phôi ở nồng độ cuối cùng

Có thể thay thế Glycerol bằng Ethylene glycol, có phân tử lượng thấp hơn (62,07), chất này tương tự như glycerol nhưng thời gian ngâm phôi bò ngắn hơn Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi theo các bước mà nó tự thẩm xuất ra khỏi tế bào, vì vậy người ta có thể cấy phôi ngay được Điều cần lưu ý là Ethylene glycol rất độc cho phôi do đó phải thận trọng khi sử dụng

Hasler và cs (1997)[37] đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5M ethylene glycol Sau khi giải đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phôi thoát màng tương ứng là 69,20% và 62,40%

Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lượng thấp (78,13) Chất này đầu tiên được Wilmut và Rowson (1973)[69] sử dụng để đông lạnh phôi bò Tuy nhiên, nhiều tác giả nhận thấy rằng, có sự khác nhau về khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi

bò thì glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO Vì thế đến cuối những năm 1970, glycerol được dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò

Đường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng được dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường được dùng với các chất bảo vệ lạnh khác Các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể

sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethy sulphoside, acetamide, propylen glycol, glycerol, ethylene glycol,

polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác nhau để đông lạnh phôi động vật có vú

Theo Bùi Xuân Nguyên (1997)[22], việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh

và khả năng sống của phôi đông lạnh có sự khác nhau giữa các loài Đối với thỏ, khả năng sống của phôi đông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glyceorol hay DMSO là rất thấp (0-5%) so với đông lạnh bằng propaneol (92%) Đối với phôi dâu - phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%) Trong khi đó phôi bò được đông lạnh trong hỗn hợp bảo vệ lạnh sucrose-propaneol-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn

so với hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0%) Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác nhau vẫn chưa được làm rõ

2.9.3 Phương pháp đông lạnh

Với quan điểm sinh học lạnh tế bào các tế bào phôi không khác biệt với các loại tế bào sống khác Điều quan trọng nhất của quá trình đông lạnh là loại bỏ nước nội bào trước khi chúng được đông lạnh Đã có nhiều nghiên cứu

về kỹ thuật đông lạnh bao gồm chất bảo vệ lạnh và nồng độ sử dụng của chúng cũng như độ hạ nhiệt độ, nhiệt độ tạo đá và nhiệt độ chuyển phôi sang nitơ lỏng cũng như nhiệt độ và tốc độ giải đông

Nhìn chung, đông lạnh phôi có thể chia làm hai phương pháp: đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh Đông lạnh chậm là phương pháp mà ở đó quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt độ có kiểm soát xảy ra chậm trước khi phôi được chuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng Đối với phương pháp đông lạnh chậm, phôi được chuyển vào môi trường có chứa chất bảo vệ lạnh theo nhiều bước với nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường đông lạnh có nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30 phút Sau khi cân bằng phôi