Giáo trình xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm hóa học p4

90 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC Chương 4 XỬ LÝ THỐNG KÊ TRONG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình khẳng định độ chính xác của phương pháp bằng cách kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan cho thấy các yêu cầu kỹ thuật đã được đáp ứng Để đảm bảo độ chính xác trong phân tích và kiểm nghiệm, phương pháp sử dụng cần phải được thẩm định với điều kiện nguồn lực cụ thể của phòng thí nghiệm (còn được gọi là xác nhận giá trị sử dụng của phương.

90 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC Chương XỬ LÝ THỐNG KÊ TRONG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Thẩm định phương pháp phân tích q trình khẳng định độ xác phương pháp cách kiểm tra cung cấp chứng khách quan cho thấy yêu cầu kỹ thuật đáp ứng Để đảm bảo độ xác phân tích kiểm nghiệm, phương pháp sử dụng cần phải thẩm định với điều kiện nguồn lực cụ thể phịng thí nghiệm (cịn gọi xác nhận giá trị sử dụng phương pháp) Thẩm định phương pháp có hai dạng: (1) Đối với phương pháp tiêu chuẩn: Thẩm định phương pháp trình đánh giá phương pháp tiêu chuẩn áp dụng hệ thống điều kiện tiêu chuẩn thiết bị, hoá chất, tiện nghi mơi trường phịng thí nghiệm cụ thể có đạt u cầu hay khơng (method verification) (2) Đối với phương pháp không tiêu chuẩn, phương pháp phịng thí nghiệm phát triển: Thẩm định phương pháp trình đánh giá phương pháp dựa kết phân tích mẫu thử sử dụng phương pháp tiêu chuẩn khác dựa việc phân tích mẫu chuẩn chứng nhận (method validation) Những thông số cần xác nhận giá trị thẩm định phương pháp bao gồm: tính đặc hiệu, tính chọn lọc; giới hạn phát hiện, khoảng định lượng; độ lặp, độ đúng, độ không đảm bảo đo phương pháp 4.1 Tính đặc hiệu, tính chọn lọc 4.1.1 Tính đặc hiệu (Specificity) Tính đặc hiệu phương pháp phân tích khả phát rõ ràng chất cần phân tích với có mặt thành phần khác mẫu Những chất có tính chất tương tự giống với chất phân tích đồng phân, tiền chất, chất chuyển hóa có khả gây cản trở gây nhiễu tín hiệu chất cần phân tích Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích 91 Một phương pháp phân tích có tính đặc hiệu cao nếu: (i) có tín hiệu đặc trưng rõ ràng có mặt chất phân tích (với lượng đủ nhỏ gần giới hạn phát hiện); (ii) Khơng cho tín hiệu đặc trưng khơng có mặt chất phân tích có tồn chất gây cản trở đề cập Tùy theo phương pháp phân tích cụ thể mà tính đặc hiệu xem xét cách tiếp cận khác nhau, nhìn chung có hai nhóm bản: (1) nhóm phương pháp phổ thơng thường quang phổ, sắc ký, tính đặc hiệu dựa vào peak tín hiệu; (2) nhóm khối phổ dựa vào mảnh ion đặc trưng (ion sơ cấp, precursor ion) hoặc/và ion thứ cấp (product ion) Để xác định tính đặc hiệu phương pháp cần thực thí nghiệm sau: (1) Phân tích mẫu trắng: Mẫu trắng cần phân tích lặp lại lần, mẫu trắng mẫu thực khơng có tín hiệu chất phân tích (2) Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn: nồng độ chất phân tích thêm chuẩn khoảng giới hạn phát (⁓LOD), sử dụng nhiều mức nồng độ thêm chuẩn để khẳng định đáp ứng tín hiệu với nồng độ chất phân tích (3) Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn chất cản trở (nếu có) Đối chiếu kết thu ta kết luận tính đặc hiệu phương pháp Một phương pháp có tính đặc hiệu cao tín hiệu đặc trưng thí nghiệm (2) rõ ràng, đồng thời thí nghiệm (1) (3) khơng cho tín hiệu chất phân tích Đối với phương pháp ghép khối phổ, ta sử dụng thí nghiệm trên, nhiên để xem xét độ đặc hiệu phương pháp cần xét đến số lượng, tín hiệu mảnh phổ đặc trưng Mảnh phổ đặc trưng ion sơ cấp (precursor fragment) lần khối phổ mảnh phổ thứ cấp (product fragments) phương pháp hai nhiều lần khối phổ Tính đặc hiệu phương pháp ghép khối phổ thơng qua chế độ qt phổ tồn (full scan) chế độ chọn lọc ion SIM (selective ion mode) Trong trường hợp quét phổ toàn bộ, tính đặc hiệu phép phân tích xác định 04 mảnh phổ có cường độ tương đối (relative abundant) 92 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC lớn 10% đồng thời ion phải nằm dung sai tối đa cho phép cường độ tương đối (bảng 4.1) Bảng 4.1: Dung sai tối đa cho phép mảnh ion xác định tính đặc hiệu phương pháp sắc ký ghép khối phổ Mức cường độ tương Dung sai GC–MS (CI), GC–MSn đối (relative intensity) GC–MS (EI) LC–MS, LC–MSn > 50% ± 10% ± 20% 20 % – 50% ± 15% ± 25% 20 % – 50% ± 20% ± 30% ≤ 10% ± 50% ± 50% Khi chạy chế độ SIM, tính đặc hiệu phương pháp xác nhận thông qua số điểm nhận dạng (IP– identification point), số điểm IP cao độ chắn xem xét tính đặc hiệu cao Số điểm IP khác phương pháp sắc ký ghép khối phổ khác trình bày bảng 4.2 (theo tiêu chuẩn 2002/657/EC) Bảng 4.2: Số lượng điểm IP tương ứng với phương pháp sắc ký ghép khối phổ Phương pháp MS Số lượng ion Số IP GC–MS (EI CI) n n GC–MS (EI CI) (EI) + (CI) GC–MS (EI CI) dẫn xuất (dẫn xuất A) + (dẫn xuất B) LC–MS n n HRMS n 2n GC–MS/MS ion mẹ hai ion GC–MS/MS ion mẹ, ion mẹ có ion LC–MS/MS ion mẹ hai ion LC–MS/MS ion mẹ, ion mẹ có ion LC–MS/MS/MS ion mẹ, ion con, ion cháu 5.5 Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích 93 Tùy vào nhóm chất cần phân tích mà số điểm IP u cầu tối thiểu khác Ví dụ số điểm IP tối thiểu cho nhóm chất có tác dụng đồng hóa chất cấm; số IP tối thiểu nhóm thuốc thú y chất gây nhiễm (bảng 4.3) Ngồi u cầu số IP tối thiểu tỉ lệ tín hiệu ion cần đánh giá Ít ion có tín hiệu lớn lần so với mẫu Bảng 4.3: Phân loại nhóm chất theo tiêu chuẩn 96/23/EC Nhóm A: nhóm chất có tác dụng Nhóm B: nhóm chất thuốc thú y đồng hóa chất cấm, IP ≥ chất gây ô nhiễm, IP ≥ – Stilbenes, đồng phân, muối – Các chất kháng khuẩn, bao gồm ester stilbene sulfonamides quinolone – Thuốc kháng giáp – Thuốc xổ giun, chống giun bao – Steroids gồm nitroimidazoles, carbamates – Acid resorcylic, lactones bao gồm zeranol – Beta–agonists – Nhóm Nitrofuran pyrethroids; thuốc an thần, thuốc chống viêm không steroid – Hợp chất organochlorine bao gồm PCBs – Hợp chất organophosphorus, độc tố nấm, thuốc nhuộm… 4.1.2 Tính chọn lọc (Selectivity) Xét chất, tính chọn lọc giống tính đặc hiệu phương pháp Tuy nhiên, tính chọn lọc sử dụng trường hợp phân tích đồng thời nhiều chất Trong trường hợp phương pháp có dùng chất nội chuẩn, phương pháp có tính chọn lọc cao phương pháp có khả phân biệt rõ ràng nhiều chất phân tích, chất nội chuẩn (internal standard, IS) so với thành phần nội sinh mẫu thành phần khác mẫu 4.2 Khoảng tuyến tính, độ tương quan đường hiệu chuẩn 4.2.1 Đường hiệu chuẩn (Calibration curve) Trong phân tích định lượng, đường hiệu chuẩn (gọi tắt đường chuẩn) sử dụng phổ biến để liên kết nhiều điểm chuẩn để xác định 94 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC giá trị mẫu cần phân tích Phương pháp cho độ xác cao so với phương pháp liên kết chuẩn (còn gọi phương pháp so sánh) Đường chuẩn thông thường xây dựng mẫu trắng để giảm thiểu ảnh hưởng mẫu đến chất phân tích (matrix–matched calibration) Phương trình đường chuẩn phương trình mơ tả mối quan hệ nồng độ với tín hiệu chất cần phân tích Một cách tổng quát, mối tương quan đại lượng X (biến độc lập) đại lượng Y (biến phụ thuộc) theo dạng tuyến tính biểu diễn phương trình dạng sau: y = ax + b (4.1) Hệ số a (hệ số góc/slope) hệ số b (tung độ gốc/intercept) xác định từ thực nghiệm thay đổi N lần biến độc lập xi đo lường giá trị phụ thuộc tương ứng yi theo bảng 4.4 Bảng 4.4 Giá trị thực nghiệm lập đường chuẩn thẩm định phương pháp phân tích (N ≥ 6) n i N x x1 x2 x3 xi xN y y1 y2 y3 yi yN Từ bảng kết thực nghiệm tính tổng ∑ xi , ∑ yi , ∑ xi yi , ∑ xi2 , hệ số a b tính phương pháp bình phương cực tiểu (least square method) theo hệ phương trình: ∑ yi = N b + a ∑ xi { (4.2) ∑ xi yi = bxi + a ∑ xi2 Hệ số a, b tính sau: a= b= { ∑ xi ∑ yi N (∑ xi )2 ∑ xi − N ∑x ∑x y ∑ x2i ∑ yi − i i i N N ∑ x2i − (∑ xi )2 ∑ x i yi − Độ lệch chuẩn hệ số a b tính theo cơng thức: (4.3) Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích ∑N i=1 xi Sa = Sresidue √ N N ∑N i=1 xi − (∑i=1 xi ) (4.4) (4.5) N Sb = Sresidue √ N ∑N i=1 xi − (∑N i=1 xi ) Độ lệch chuẩn dư, Sresidue = √ 95 ∑N ̂ 𝑖 )2 i=1(yi −𝑦 N−2 (4.6) Trong đó: yi giá trị thực nghiệm, ŷi giá trị tính theo phương trình hồi quy Trong số trường hợp, đường hiệu chuẩn bậc (parabol) Tương tự với hồi quy tuyến tính, hệ số phương trình đường hiệu chuẩn tính tốn phương pháp bình phương cực tiểu Nếu phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + bx + c (4.7) Để tìm hệ số a, b c phải giải hệ phương trình: ∑ yi = ∑ xi2 + b ∑ xi + N c {∑ xi yi = a ∑ xi3 + b ∑ xi2 + c ∑ xi ∑ xi2 yi = a ∑ xi4 + b ∑ xi3 + c ∑ xi2 (4.8) Tùy thuộc vào phương pháp, điều kiện kỹ thuật khác nhau, thí nghiệm xây dựng đường hiệu chuẩn trường hợp sau: (1) Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết: Khi khơng có mẫu trắng thích hợp ảnh hưởng mẫu đến phép phân tích khơng đáng kể, đường chuẩn xây dựng từ dung dịch chuẩn pha dung môi tinh khiết mà không xét đến ảnh hưởng mẫu Trong trường hợp này, để hạn chế khác biệt liên kết chuẩn cần xem xét đến bước quy trình xử lý mẫu xây dựng đường chuẩn, đồng thời cần có đánh giá ảnh hưởng mẫu (EM, effective matrix) thông qua so sánh giá trị hệ số dốc (slope) với đường thêm chuẩn mẫu thực 96 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC (2) Đường chuẩn mẫu trắng: Mẫu trắng sử dụng làm mẫu cho thí nghiệm điểm chuẩn Mẫu trắng mẫu thực khơng cho tín hiệu chất phân tích (3) Đường chuẩn mẫu thực: Mẫu thật sử dụng làm môi trường cho điểm chuẩn Đường chuẩn mẫu thực sử dụng lần để phân tích cho mẫu cụ thể Phương pháp cho độ xác cao loại bỏ ảnh hưởng mẫu lên chất phân tích Tuy nhiên phương pháp sử dụng cần lượng lớn mẫu thực tốn kinh phí thời gian (4) Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn: Là đường tương quan tỉ lệ nồng độ chất chuẩn (standard, sd) chất nội chuẩn (internal standard, isd) Csd/Cisd với tỉ lệ tín hiệu chất chuẩn chất nội chuẩn Wsd/Wisd Tín hiệu thường diện tích peak 4.2.2 Độ tuyến tính hệ số tương quan (Correlation coefficient) Độ tuyến tính đường chuẩn đánh giá thơng qua phép phân tích tương quan, giá trị hệ số tương quan (R) sử dụng làm thước đo cho độ tuyến tính Hai loại hệ số tương quan phổ biến hệ số tương quan Pearson Spearman Hệ số tương quan Pearson thường dùng cho mối tương quan tuyến tính (đường thẳng) Spearman tương quan thứ bậc sử dụng cho mối quan hệ phi tuyến tính 4.2.2.1 Hệ số tương quan Pearson Từ tập số liệu thực nghiệm để lập đường chuẩn thiết kế bảng 4.4, hệ số tương quan Pearson tính theo cơng thức sau: σx ∑N i=1(xi −X) y i=1(yi −Y) R = a σ = a √∑N = ∑ x i yi − (∑ xi ) √(∑ x2i − N ∑ xi ∑ yi N (∑ yi )2 ) )×(∑ y2i − N (4.9) a hệ số góc phương trình đường hồi quy Dấu hệ số góc dấu hệ số tương quan R > cho biết X Y có tương quan thuận Ngược lại R < 0, x y có tương quan nghịch Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích 97 Giá trị tuyệt đối R cho biết mức độ tương quan x y Do đó, đánh giá mức độ tương quan người ta thường quan tâm đến giá trị R2 thay cho R Ngoài cách tính tính theo cơng thức 4.5, R2 cịn dễ dàng tính theo biểu thức: S2y R2 = S2 (4.10) ̂ y Sy2 phương sai tính từ giá trị thực nghiệm y (giá trị điểm chuẩn) Sŷ2 phương sai tập giá trị 𝑦̂, 𝑦̂ giá trị tính theo phương trình hồi quy Một cách tương đối, phân mức độ tương quan hai đại lượng theo giá trị hệ số tương quan hình 4.1 bảng 4.5 Hình 4.1 Tương quan Pearson đại lượng X Y Trong phân tích định lượng, yêu cầu đường hiệu chuẩn cần có giá trị R tối thiểu 0.990, tương ứng với giá trị R nhỏ 0.995 98 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC Bảng 4.5: Mối quan hệ giá trị hệ số tương quan mức độ tương quan R Mức độ tương quan Từ 0.00 đến ± 0.20 Rất yếu Từ ± 0.21 đến ± 0.40 Yếu Từ ± 0.41 đến ± 0.70 Vừa Từ ± 0.71 đến ± 0.90 Mạnh Từ ± 0.91 đến ± 1.00 Rất mạnh 4.2.2.2 Hệ số tương quan Spearman Hệ số tương quan Spearman (Rs) đánh giá mức độ tương quan thứ hạng có tham số khơng qua tham số yếu tố X Y với N số liệu đo tính theo cơng thức sau: 6∑d i R s = − N(N2 −1) (4.11) Với di sai khác xi yi Để tính di, giá trị xi xếp theo thứ tự từ thấp đến cao ngược lại cặp tương ứng với yi Trong trường hợp có nhiều giá trị giống thứ hạng chúng tính giá trị trung bình thứ hạng Khi cơng thức 4.11 thay bằng: Rs = − m ∑ (t3 −tj ) 12 j=1 j N(N2 −1) 6(∑ di + (4.12) Với tj số lần trùng thứ hạng j, tj tính cho giá trị x y Phương trình đường chuẩn hệ số tương quan Pearson tương ứng tính cách dễ dàng công cụ Excel đồ thị Charts, công cụ Regression Data analysis phần mềm thống kê chuyên dụng Ví dụ 4.1: Dữ liệu lập đường chuẩn phân tích tổng hàm lượng asenic nước mắm truyền thống phương pháp HG–AAS thu sau: C (ppm) 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 Abs 0.038 0.071 0.148 0.292 0.431 0.539 0.664 Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích 99 Hãy xác định phương trình hệ số tương quan đường chuẩn Giải: Cách 1: Dùng công cụ đồ thị Charts menu Insert Nhập bảng liệu, chọn vị trí vùng liệu chọn insert/charts/scatter sau enter Tiếp theo Format Trendline chọn Display Equation on chart Display R–square on chart ta thu kết hình đây: Phương trình đường chuẩn thu y = 0.0663x + 0.0136 tương ứng với R2 = 0.997 Đường chuẩn thu đạt yêu cầu R2 > 0.99 Cách 2: Dùng công cụ Regression Data analysis Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích 135 – Độ lặp phương pháp chuẩn độ (n=10) 0.05% Điểm cuối chuẩn độ điểm tương đương thu từ đường cong chuẩn độ Giải: Bước 1: Xác định đại lượng đo Quy trình chuẩn hóa nồng độ dung dịch chuẩn chất chuẩn gốc thực sau theo sơ đồ sau đây: Cân KHP Pha dd NaoH Chuẩn độ Kết CNaOH = 1000.mKHP PKHP MKHP VT (mol/L) Bước 2: Xác định nguồn gây độ không đảm bảo đo Từ cơng thức tính nồng độ dung dịch NaOH, nguồn gây ĐKĐB nồng độ bao gồm: phép cân, độ tinh khiết KHP, khối lượng phân tử KHP, thể tích chuẩn độ Nguồn gây độ khơng đảm bảo đo thể qua sơ đồ nguyên nhân: ĐKĐB 136 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HĨA HỌC Bước 3: Tính tốn nguồn gây độ không đảm bảo đo thành phần (1) Độ tinh khiết (PKHP) Độ không đảm bảo đo kiểu B áp dụng cho độ tinh khiết hóa chất với phân phối hình chữ nhật a 0.0005 uPKHP = = = 0.00029 √3 √3 (2) Khối lượng cân (mKHP) mKHP = 60.5450 – 60.1562 = 0.3888 (g) Độ không đảm bảo đo kiểu B áp dụng cho chứng kiểm định cân phân tích với phân phối hình chữ nhật: ucân = a √3 = 0.15 √3 = 0.09 mg Theo ra, phép cân khối lượng KHP thao tác lần (khối lượng chén cân; khối lượng chén chất chuẩn) nên độ không đảm bảo đo phép cân KHP là: umKHP = √2 Ucân = √2 (0.09)2 = 0.13 mg (3) Khối lượng mol phân tử KHP (MKHP) Khối lượng mol phân tử KHP tính theo cơng thức C8H5O4K cho kết sau: MKHP = 8.MC + 5.MH + 4.MO + MK = 8×12.0107 + 5×1.00794 + 4×15.9994 + 1×39.0983 = 204.2212 g/mol Độ KĐBĐ nguyên tố tính theo phân phối hình chữ nhật uMC = uMH = uMO = uMK = aC √3 aH √3 aO √3 aK √3 = = = = 0.0008 = 0.00046 g √3 0.00007 √3 0.0003 √3 0.0001 √3 = 0.00004 g = 0.00017 g = 0.000058 g Độ KĐBĐ MKHP thu là: Chương 4: Xử lý thống kê thẩm định phương pháp phân tích 137 uMKHP = √(8uC )2 + (5uH )2 + (4uO )2 + (uK )2 = √(8 × 0.00046)2 + (5 × 0.00040)2 + (4 × 0.00017)2 + (0.000058)2 = 0.0038 (4) Thể tích chuẩn độ: Các nguồn gây nên sai số thể tích chuẩn độ từ dụng cụ thủy tinh, nhiệt độ, độ lặp độ cuối chuẩn độ – Dụng cụ thủy tính: Độ KĐBĐ (kiểu B) từ cơng bố nhà sản xuất cho dung cụ thể tích, áp dụng phân phối tam giác: a 0.03 udụng cụ = = = 0.012 mL √6 √6 – Độ KĐBĐ ảnh hưởng nhiệt độ đến thể tích: a unhiệt độ = 1.96 = 18.46 × × 2.1 × 10–4 1.96 = 0.006 mL – Điểm cuối chuẩn độ điểm tương đương (được xác định từ phép chuẩn độ tự động) nên sai số bỏ qua – Sai số ngẫu nhiên (kiểu A): đề cập độ tái lặp phương pháp, khơng xem xét sai số thể tích chuẩn độ Độ KĐBĐ thể tích gây nên là: uV = √u2dụng cụ + u2nhiệt độ = √0.0122 + 0.0062 = 0.013 mL (5) Độ lặp phương pháp: Bằng phép phân tích lặp lại 10 lần, độ lặp phương pháp độ lặp thể tích chuẩn độ 0.05% (0.0005) Bước 4: Tính độ không đảm bảo đo tổng chuẩn mở rộng CNaOH = 1000.mKHP PKHP MKHP VT = 1000 × 0.3888 × 1.0 204.2212 × 18.64 = 0.10214 mol/L Tổng hợp nguồn gây độ khơng đảm bảo đo trình bày bảng sau: 1.0 Độ KĐBĐ chuẩn 0.0005 Độ KĐBĐ tương đối 0.0005 0.3888 g 0.00013 g 0.00033 1.0 204.2212 g/mol 0.00029 0.0038 g/mol 0.00029 0.000019 18.64 mL 0.013 mL 0.0007 Nguồn Giá trị Độ lặp Khối lượng Độ tinh khiết Khối lượng mol Thể tích chuẩn độ Độ khơng đảm bảo tổng hợp phép chuẩn độ tính theo công thức 4.52 sau: 138 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM HÓA HỌC uRep u u u 2 u uCNaOH = CNaOH √( Rep ) + ( mm ) + ( PP ) + ( MM ) + ( VV ) = 0.0005 0.10214 √( 0.00013 0.00029 ) + ( 0.3888 ) + ( 0.0038 0.013 ) + (204.2212) + (18.64) = 0.000099 Độ KĐBĐ mở rộng: UcNaOH = × 0.000099 ≈ 0.0002 Kết biểu diễn là: CNaOH = 0.1021 ± 0.0002 mol/L Ví dụ 4.17: Xác định độ không đảm bảo đo phép xác định giải phóng chì cadimi từ dụng cụ gốm hình trịn (có độ sâu