Nghiên cứu hoạt tính prebiotic của polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm vân chi (trametes versicolor)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  TRẦN ĐÌNH CHÍ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH PREBIOTIC CỦA POLYSACCHARIDE CHIẾT XUẤT TỪ HỆ SỢI NẤM VÂN CHI (TRAMETES VERSICOLOR) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  TRẦN ĐÌNH CHÍ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH PREBIOTIC CỦA POLYSACCHARIDE CHIẾT XUẤT TỪ HỆ SỢI NẤM VÂN CHI (TRAMETES VERSICOLOR) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn Ths Nguyễn Thị Bích Hằng Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Bích Hằng cơng tác khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả (Ký tên) Trần Đình Chí i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ từ cá nhân tập thể suốt thời gian thực Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới ThS Nguyễn Thị Bích Hằng ThS Lê Thị Mai tạo điều kiện, giúp đỡ tơi thực hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm tồn thể q thầy khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn tập thể lớp 17 CNSH bạn sinh viên nghiên cứu khoa học phịng Cơng nghệ sinh học nấm hỗ trợ động viên tơi suốt q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ủng hộ, động viên tạo điều kiện cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học: 3.2 Ý nghĩa thực tiễn: Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Vân chi (Trametes Versicolor) 1.2 Tổng quan Polysaccharide 1.3 Giới thiệu Prebiotic 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Tác dụng prebiotic: 1.3.3 Cơ chế hoạt động prebiotic 1.3.4 Phân loại prebiotic 1.3.5 Tiêu chí phân loại prebiotic 1.4 Giá trị dược liệu nấm Vân chi 10 1.5 Tình hình nghiên cứu 11 1.5.1 Thế giới 11 1.5.2 Việt Nam 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 iii 2.2 Phạm vi nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp nhân sinh khối hệ sợi nấm 15 2.3.2 Phương pháp tách chiết Polysaccharide 15 2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng PS phương pháp phenol – sulfuric 16 2.3.4 Phương pháp kháng oxy hóa 17 2.3.5 Phương pháp đánh giá kích thích sinh trưởng vi sinh vật có lợi 17 2.3.6 Phương pháp đánh giá ức chế sinh trưởng vi sinh vật có hại 18 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu: 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Hàm lượng PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi (Trametes Versicolor) 20 3.2 Khả kháng oxy hóa PS: 20 3.3 Ảnh hưởng PS đến sinh trưởng vi sinh vật có lợi: 22 3.4 Ảnh hưởng PS đến ức chế vi sinh vật có hại: 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 Kết luận 26 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 PHỤ LỤC 31 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT PS Polysaccharide FOS Fructooligosaccharide CT Công thức ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tiêu đề bảng Trang 2.1 Bảng bố trí nghiệm thức thí nghiệm 18 3.1 Sự sinh trưởng L.plantarum ni cấy nghiệm thức nghiên cứu, 37 độ C 24h 22 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tiêu đề hình Trang 1.1 Hình thái hệ sợi nấm Vân chi 1.2 Đường Prebiotic thể người 1.3 Cơ chế hoạt động prebiotic 1.4 Hệ thống phân loại prebiotic 2.1 Sơ đồ quy trình chiết Polysaccharide 16 3.1 Hoạt tính bắt gốc tự ABTS.+ 21 3.2 Số lượng khuẩn lạc chủng L.plantarum môi trường MRS 23 3.3 Khả ức chế vi sinh vật có hại 24 3.4 Vịng vơ khuẩn với vi sinh vật có hại 24 vii TÓM TẮT Prebiotic nguồn thức ăn cho probiotic (vi sinh vật sống hữu ích đường ruột vật chủ) thơng qua việc kích thích có chọn lọc vi khuẩn giúp đường ruột khỏe mạnh Mặt khác, prebiotic đóng vai trị bẫy vi khuẩn gây hại Nghiên cứu thực khảo sát ban đầu hoạt tính prebiotic polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi Kết nghiên cứu rằng, hàm lượng polysaccharide thu nhận từ hệ sợi nấm Vân chi đạt 1,2112±0,207 mg/ml hiệu suất bắt gốc tự polysaccharide 31,86% PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi có khả thúc đẩy sinh trưởng hoạt động chủng vi sinh vật có lợi đường ruột Lactobacillus plantarum, cụ thể làm tăng mật độ lên 2,25% mật độ quang 2,46 lần mật độ tế bào so với đối chứng Bên cạnh đó, dịch chiết từ mơi trường ni cấy Lactobacillus plantarum có khả ức chế vi sinh vật gây hại đường ruột như: E coli, Bacillus cereus, Salmonella với đường kính vô khuẩn 13,67±1,53; 11±3,61 14,67±1,52 (mm), tốt so với đối chứng tương ứng với FOS inulin Kết đề tài bước đầu cho thấy tiềm sử dụng sợi nấm Vân chi làm nguồn nguyên liệu sản xuất prebiotic, synbiotic bên cạnh nguồn prebiotic từ thực vật phổ biến Từ khóa: Polysaccharide, nấm Vân chi (Trametes Versicolor), prebiotic viii Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum nuôi 37 độ C 24h điều kiện kỵ khí mơi trường MRS (mẫu đối chứng); so với mơi trường MRS có bổ sung 1ml chiết xuất hệ sợi nấm Sau ủ, mẫu định lượng cách đo mật độ tế bào quang học phương pháp đo quang phổ bước sóng 620nm.(Siragusa cs, 2009) Sử dụng mơi trường MRS có bổ sung FOS Inulin làm đối chứng dương để so sánh với sinh trưởng phát triển chủng vi sinh vật có lợi môi trường đối chứng âm môi trường MRS có bổ sung polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi Sau xác định giá trị mật độ quang, tiến hành hút 10𝜇l mẫu cho vào đĩa môi trường MRS chuẩn bị sẵn, cấy trải đĩa đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào mẫu Mật độ tế bào tính theo cơng thức sau: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong : Ai số khuẩn lạc trung bình/ đĩa Di độ pha lỗng V dung tích huyền phù tế bào cho vào đĩa (ml) Bảng 2.1 Bảng bố trí nghiệm thức thí nghiệm Nghiệm thức Thành phần CT1 Môi trường MRS chất bổ sung CT2 Mơi trường MRS + FOS CT3 Môi trường MRS + Inulin CT4 Môi trường MRS + PS 2.3.6 Phương pháp đánh giá ức chế sinh trưởng vi sinh vật có hại Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum nuôi 37 độ C 48h mơi trường MRS có bổ sung 1ml chiết xuất hệ sợi nấm ly tâm điều kiện 5000 vòng/20 phút độ C Sau ly tâm, tiến hành thu chất để xác định ức chế sinh trưởng nhóm vi khuẩn có hại Các chủng vi khuẩn có hại E coli, Bacillus cereus Salmonella nuôi môi trường tương ứng Sau đó, lấy 50μl cấy vào đĩa môi trường NA kỹ thuật cấy trang Tiến hành đục lỗ thạch có đường kính 9mm đĩa vi khuẩn gây bệnh Tiếp theo, chất thu từ trình ly tâm cho vào lỗ thạch ủ 37 độ C 24h Khả ức chế xác định cách đo đường kính vịng vơ khuẩn đĩa có chất probiotic so với đĩa đối chứng (Rousseau cs, 2005) 18 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu: Tất số liệu thu từ thí nghiệm xử lý phần mềm SPSS 20 (Statistical Package for the Social Sciences) lệnh Descriptive Ducan test 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lượng PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi (Trametes Versicolor) Hệ sợi nấm Vân chi sau tách chiết, tiến hành tủa với cồn 96% qua đêm 4℃ để thu nhận polysaccharide thô Hàm lượng PS xác định theo phương pháp phenol – sulfuric bước sóng 490nm Kết hàm lượng polysaccharide có hệ sợi nấm Vân chi đạt 1,212±0,207 (mg/ml) Kết nghiên cứu cao so với nghiên cứu trước Wang cộng (2017) Santos Arteiro cộng (2012) Theo nghiên cứu Wang cộng nâng cao thu hoạt động chống khối u polysaccharide nội bào từ nấm Vân chi, kết polysaccharide nội bào thu nhận từ hệ sợi nấm Vân chi đạt 0,3900±0,02 (mg/ml) Ngoài kết nghiên cứu hàm lượng hoạt động sinh học polysaccharide thu từ sợi nấm Vân chi Santos Arrterio cộng cho thấy hàm lượng polysaccharide thu nhận từ hệ sợi nấm Vân chi 0,0203±0,76x10−4 (mg/ml) Ngồi ra, nghiên cứu cịn cho thấy hàm lượng extracellular polysaccharide thu từ môi trường nuôi cấy hệ sợi nấm Vân chi với nguồn Carbon Glucose đạt 0,1783±0,0401 (mg/ml) Như vậy, thu nhận polysaccharide từ hệ sợi môi trường nuôi cấy; nguồn tiềm để ứng dụng sản xuất prebiotic giúp hỗ trợ sinh trưởng vi sinh vật có lợi đường ruột 3.2 Khả kháng oxy hóa PS: Các chất kháng oxy hóa tự nhiên thường hỗn hợp nhiều cấu tử có cấu trúc hóa học nhóm chức khác Vì chúng thường kháng oxy hóa theo nhiều chức phương thức khác Do đó, phương pháp đánh giá mơ tả khía cạnh khả kháng oxy hóa Ở đây, sử dụng phương pháp khử màu ABTS.+ mô tả Nikolaos et al.(2004) để xác định khả kháng oxy hóa PS Hoạt tính bắt gốc ABTS•+ tự khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả, nhanh chóng đơn giản Việc mẫu khảo sát có khả bắt gốc ABTS•+ chứng tỏ mẫu có chứa hợp chất có khả nhường hydrogen chuyển electron cho gốc tự cách trực tiếp, tạo thành sản phẩm ổn định hơn, có khả kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự Kết khảo sát khả bắt gốc ABTS•+ tự thể hình 3.1 20 Khả bắt gốc tự Mật độ quang Hiệu suất (%) 0.7 100% 0.6142 91.87% 0.6 90% 80% 0.477 70% 60% 0.4 50% 0.3 40% 31.86% 0.2 Hiệu suất (%) Mật độ quang 0.5 30% 20% 0.1 0.0569 12.26% 10% 0% ĐC (-) PS ĐC(+) Mẫu Hình 3.1 Hoạt tính bắt gốc tự ABTS.+ Dựa vào kết hình 3.1, mật độ quang mẫu PS thấp mẫu đối chứng âm chứng tỏ PS chiết từ hệ sợi nấm Vân chi có khả bắt gốc tự Mật độ quang mẫu thấp hiệu suất bắt gốc tự cao Mật độ quang hiệu suất bắt gốc tự mẫu PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi đạt 0,4770±0,01 31,86±0,76% Kết nghiên cứu gần tương đồng với kết nghiên cứu Santos Arteiro, nghiên cứu hoạt động sinh học protein – polysaccharide từ nấm Vân chi Kết nghiên cứu ra, hiệu suất bắt gốc tự IPS từ hệ sợi nấm Vân chi đạt 36,91±1,76% Ngồi ra, nghiên cứu cịn cho thấy EPS chiết xuất từ mơi trường ni cấy nấm Vân chi có khả bắt gốc tự với hiệu suất đạt 40,42±3,04% Khả chống oxy hóa PS có liên quan trực tiếp đến mối liên kết phân tử PS với ion có gốc oxy hóa tạo nên gốc ổn định, nhờ mà polysaccharide ngăn chặn chuỗi tác nhân phản ứng Các nhóm hydroxyl chiếm phần lớn phân tử PS nhờ tạo phản ứng mà kết hợp chúng với tạo thành chất vô hại (K Wang et al., 2014) Như vậy, polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm thu nhận từ môi trường nuôi cấy nấm chứng tỏ chúng có khả bắt gốc tự 21 3.3 Ảnh hưởng PS đến sinh trưởng vi sinh vật có lợi: Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum nuôi cấy nghiệm thức thí nghiệm khác Kết biểu diễn bảng 3.1 Bảng 3.1 Sự sinh trưởng L.plantarum nuôi cấy nghiệm thức nghiên cứu, 37 độ C 24h Mẫu OD620 L.plantarum Mật độ tế bào (CFU/ml) CT 3,1768±0,0028a 1,06 x 1010 CT 3,1866±0,0112a 1,23 x 1010 CT 3,2648±0,0140b 2,16 x 1010 CT 3,2483±0,0410b 2,61 x 1010 Ghi chú: Các chữ a,b cột thể sai khác mẫu mức ý nghĩa p < 0,05; giá trị giá trị trung bình±SD (n=3) Kết bảng 3.1 cho thấy mẫu bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum không ức chế sinh trưởng chủng vi sinh vật này, đo mật độ quang học 620nm (có khác biệt p < 0,05) Đáng ý, chủng vi sinh vật có lợi ni với chất bổ sung PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi 3,2483±0,0410, tương ứng tăng 2,25% mẫu nuôi môi trường MRS không chất bổ sung cao mẫu đối chứng dương có bổ sung FOS, khơng có sai khác với mẫu bổ sung chất Inulin Điều giải thích PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi thúc đẩy sinh trưởng hoạt động Lactobacillus plantarum Theo nghiên cứu Sawangwan cộng đặc tính prebiotic chiết xuất từ loại nấm ăn khác cho thấy nuôi chủng Lactobacillus plantarum môi trường có bổ sung chiết xuất từ nấm Pleurotus pulmonarius có hiệu suất tăng trưởng cao tăng 7,69% mẫu ni cấy mơi trường khơng có bổ sung chiết xuất từ nấm sản phẩm prebiotic thương mại Ngoài ra, số chiết xuất từ loại nấm ăn khác Lentinula edodes, Pleurotus citrinopileatus Auricularia auricular – judae có hiệu suất tăng trưởng cao so với mẫu đối chứng đạt 5,64%; 5,92% 6,05% Sau đo mật độ quang mẫu, tiến hành lấy 10𝜇l mẫu cấy trải đĩa đĩa môi trường MRS Agar để xác định số lượng khuẩn lạc mẫu sau 24h nuôi cấy Kết mật độ tế bào số lượng khuẩn lạc thể hình 3.2 22 Hình 3.2 Số lượng khuẩn lạc chủng L.plantarum môi trường MRS Chú thích: Các chữ A, B, C, D chủng Lactobacillus plantarum nuôi cấy mơi trường MRS, mơi trường MRS có bổ sung FOS, mơi trường MRS có bổ sung Inulin mơi trường MRS có bổ sung PS chiết xuất hệ sợi nấm Dựa vào kết bảng 3.1, mật độ tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum nghiệm thức tốt so với mẫu đối chứng Sau trình cấy trải đĩa để xác định mật độ tế bào kết cho thấy mẫu vi sinh vật nuôi với môi trường MRS bổ sung PS chiết xuất hệ sợi nấm Vân chi đạt mật độ cao 2,61 x 1010 tương ứng với giá trị mật độ quang 3,2483±0,0410 khác với mẫu nuôi môi trường MRS bổ sung prebiotic thương mại (p