Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các thành phần môi trường tới sinh khối sợi nấm và một số hoạt tính chiết xuất từ sợi nấm linh chi (ganoderma lucidum)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG TỚI SINH KHỐI SỢI NẤM VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH CHIẾT XUẤT TỪ SỢI NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) CHU THỊ KIỀU OANH Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG TỚI SINH KHỐI SỢI NẤM VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH CHIẾT XUẤT TỪ SỢI NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2018-2022 Sinh viên: Chu Thị Kiều Oanh Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Bích Hằng Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa cơng bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tên SV i LỜI CẢM ƠN Ðể hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Ðại học Sư phạm - Ðại học Ðà Nẵng Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS NCS Nguyễn Thị Bích Hằng TS Phạm Thị Mỹ thầy cô giảng viên khoa Sinh-Môi trường tận tâm định hướng, tận tình dạy tơi kiến thức mặt chuyên ngành tạo điều kiện hỗ trợ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn anh Bùi Đức Thắng anh Trần Đình Chí ln giúp đỡ, hướng dẫn kỹ bổ ích suốt thời gian thực đề tài Cảm ơn anh theo sát, động viên thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo khoa Sinh - Môi trường, người trực tiếp giảng dạy, truyền đạt giúp trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm Đồng thời, tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ hóa chất để tơi thực tốt đề tài nghiên cứu Và lời cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người giúp đỡ tơi suốt thời gian làm khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày….tháng….năm 2022 Sinh viên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Linh chi 1.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi 1.3 Giá trị dược liệu nấm Linh chi 1.4 Tổng quan Polysaccharide 1.5 Giới thiệu chung phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) 1.6 Một số nghiên nghiên cứu nước 1.6.1 Một số nghiên cứu nước 1.6.2 Một số nghiên cứu giới 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Phương pháp nhân giống 14 2.2.2 Phương pháp tối ưu bề mặt 14 2.3.3 Phương pháp thu sinh khối hệ sợi nấm 16 2.3.4 Phương pháp tách chiết polysaccharide nội bào 16 2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng PS 17 2.3.6 Phương pháp xác định Lipid, Protein 19 2.3.7 Phương pháp đánh giá khả kháng oxy hóa 19 2.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng 19 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 iii 3.1 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Linh chi 20 3.2 Xác định hàm lượng số hoạt chất hệ sợi nấm Linh chi 24 3.2.1 Xác định hàm lượng polysaccharide tổng số sinh khối sợi nấm Linh chi 24 3.2.2 Xác định hàm lượng lipid protein sinh khối sợi nấm Linh chi 25 3.3 Khả kháng oxy hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi 26 3.4 Đánh giá hàm lượng kim loại nặng sinh khối sợi nấm Linh chi 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 Kết luận 29 Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT PS Polysaccharide IPS Intracellular polysaccharide EPS Exopolysaccharide CCD Central composite design BBD Box-Behnken design RSM Response surface methodology KLN Kim loại nặng VTM C Vitamin C v DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Kí hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Thành phần hóa dược tổng quát nấm Linh chi 1.2 Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm Linh chi 2.1 Giá trị yếu tố ảnh hưởng mơ hình thí nghiệm 15 2.2 Bố trí thí nghiệm 16 3.1 3.2 3.3 3.4 95 3.5 Các nghiệm thức thí nghiệm tối ưu hóa kết Phân tích phương sai (ANOVA) cho kết thí nghiệm mơ hình bậc hai BBD sinh khối sợi nấm Thể giá trị khảo sát biến độc lập mã thí nghiệm Hàm lượng lipid protein sinh khối khô sợi nấm Linh chi Kết phân tích kim loại nặng sợi nấm Linh chi mẫu vi 20 21 23 25 28 DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Kí hiệu hình 2.1 3.1 3.2 3.3 Tên hình Đường chuẩn D – Glucose Số trang 18 Mơ hình phản ứng bề mặt 3D sinh khối sợi nấm Linh chi 22 Kháng oxi hóa PS VTMC 26 Hoạt tính kháng oxi hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi vii 27 TÓM TẮT Thiết kế Box - Behnken phương pháp đáp ứng bề mặt RSM áp dụng để tối ưu hóa q trình ni sinh khối sợi nấm Ưu điểm phương pháp khảo sát ảnh hưởng đơn lẻ mà tác động tổng hợp biến độc lập lên biến đáp ứng biểu thị kết dạng mơ hình toán học biểu đồ trực quan RSM cho phép cải thiện trình thực nghiệm cách đề xuất thí nghiệm (Aydar, 2018) Trong nghiên cứu này, yếu tố tối ưu mơ hình ni sinh khối hệ sợi nấm Linh chi glucose, cao nấm men pH, phương trình dự báo mơ hình ni sinh khối hệ sợi nấm Linh chi là Y = 2,77333- 0,02x1 +0,0325x2 - 0,14x3 + 0,15 x1 x2 + 0,2 x1 x3 -0,02x2x3 - 0,324167x12 - 0,514167 x2 - 0,379167 x3 với điều kiện x1= -0,03, x2=0,033 , x3= -0,193, tương ứng với giá trị glucose = 25,18g/L, cao nấm men = 2,516 g/L pH = 5,902 sinh khối hệ sợi tối đa dự đoán đạt 2.78g/L Tuy nhiên, dựa vào thông số mơ hình đánh giá chưa phù hợp Cần có nghiên cứu thực nghiệm để hồn thiện phương trình dự báo tìm điều kiện tối ưu nuôi sinh khối hệ sợi nấm Linh chi Sinh khối sau thu từ nghiệm thức tối thích mơ hình phân tích số hoạt chấtnhư sau: hàm lượng polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm đạt là 0,88±0,02 g/L tổng khối lượng sợi nấm khô, protein lipid chiếm tỉ lệ 2,82% Protein 14,28% cho khối lượng sợi nấm khơ Bên cạnh nghiên cứu đánh giá khả kháng oxy hóa với hiệu suất bắt gốc tự polysaccharide xác định phương pháp khử màu ABTS.+ 77,66% Ngoài ra, hàm lượng kim loại nặng sinh khối sợi nấm xác định thấp so với ngưỡng cho phép Thủy ngân có hàm lượng 26,25 ppb, Cadmi có 25,12ppb; Asen Chì có hàm lượng 0,05) Cụ thể hơn, ảnh hưởng ba biến glucose, cao nấm men pH môi trường đến sinh khối đánh giá Kết thể Hình 3.1 Hình 3.1 Mơ hình phản ứng bề mặt 3D sinh khối sợi nấm Linh chi bị ảnh hưởng biến độc lập: glucose, cao nấm men pH phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) 22 Giá trị R2adj 0,6562 thể mức độ giải thích biến động suất chiết dựa biến khảo sát cao, đạt 65,62% Mơ hình tối ưu hóa cho thấy giá trị tối ưu đề xuất dựa mơ hình x1= -0,03; x2=0,033; x3= -0,193 tương ứng với điều kiện giá trị tối ưu đề xuất dựa mơ hình glucose = 25,18g/L, cao nấm men = 2,516 g/L pH = 5,902 Với giá trị này, sinh khối hệ sợi tối đa dự đoán đạt 2.78g/L Tuy nhiên, lack of fit mơ hình 0,022 (90% Sinh khối sợi nấm, EPS IPS thu qua trình tối ưu yếu tố ảnh hưởng (glucose, pH tốc độ lắc): 5,12 g/L sinh khối (độ pH ban đầu 4,01; 32,09 g/L glucose 102 vòng/phút), 2,49 g/L EPS (độ pH ban đầu 4,0; 24,25 g/L glucose 110 vòng/phút) 1,52 g/L IPS (và đề xuất thêm độ pH 4,0; 40,43 g/L glucoza, 103 vòng/phút) 500 mL Một ưu điểm phương pháp RSM nghiệm thức đề xuất dựa liệu thí nghiệm cũ Sử dụng hàm "steepest" gói "rsm" R, nghiệm thức để khảo sát tìm điểm trung tâm đề xuất trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Thể giá trị khảo sát biến độc lập mã thí nghiệm dist x1 x2 x3 Glucose Cao nấm pH men yhat 0,0 0,000 0,000 0,000 25,00 2,5000 6,0000 2,773 0,5 0,242 0,085 -0,429 26,210 2,5425 5,7855 2,762 1,0 0,641 0,182 -0,746 28,205 2,5910 5,6270 2,620 23 1,5 1,045 0,281 -1,040 30,225 2,6405 5,4800 2,358 2,0 1,449 0,380 -1,326 32,245 2,6900 5,3370 1,978 2,5 1,851 0,478 -1,607 34,255 2,7390 5,1965 1,482 3,0 2,258 0,578 -1,890 36,290 2,7890 5,0550 0,860 3,5 2,655 0,675 -2,165 38,275 2,8375 4,9175 0,138 4,0 3,067 0,776 -2,450 40,335 2,8880 4,7750 -0,733 10 4,5 3,462 0,874 -2,722 42,310 2,9370 4,6390 -1,683 11 5,0 3,871 0,974 -3,004 44,355 2,9870 4,4980 -2,786 Với nghiệm thức này, thực nghiệm cho suất tương ứng Các giá trị suất kết hợp với giá trị khoảng cách (dist Bảng 3.3), tạo thành đường cong dạng hàm bậc mà đỉnh đường cong giá trị trung tâm để thiết kế thí nghiệm tối ưu Tóm lại, kết cho thấy ưu điểm phương pháp RSM việc nghiên cứu tối ưu hóa quy trình ni cấy sinh khối hệ sợi Phương trình dự báo mơ hình ni sinh khối hệ sợi nấm Linh chi Y = 2,77333- 0,02x1 +0,0325x2 0,14x3 + 0,15 x1 x2 + 0,2 x1 x3 -0,02x2x3 - 0,324167x12 - 0,514167 x2 - 0,379167 x3 với điều kiện x1= -0,03, x2=0,03, x3= -0,193, tương ứng với giá trị glucose = 25,18g/L, cao nấm men = 2,516 g/L pH = 5,902 Tuy nhiên, dựa vào thơng số mơ hình đánh giá chưa phù hợp Cần có nghiên cứu thực nghiệm để hồn thiện phương trình dự báo tìm điều kiện tối ưu nuôi sinh khối hệ sợi nấm Linh chi 3.2 Xác định hàm lượng số hoạt chất hệ sợi nấm Linh chi 3.2.1 Xác định hàm lượng polysaccharide tổng số sinh khối sợi nấm Linh chi Dịch từ sợi nấm sau tách chiết tủa với cồn 96% 24 4℃ để thu polysaccharide thô, hàm lượng PS xác định phương pháp Phenol– sulfuric đo hấp thụ quang phổ UV – VIS bước sóng 490nm Sau đó, dựa vào đường chuẩn D – glucose để tính hàm lượng polysaccharide Kết nghiên cứu cho thấy, nuôi môi trường tối ưu Nấm Linh chi có hàm lượng PS đạt 0,88±0,02 g/L Điều chứng tỏ nuôi môi trường tối 24 ưu dinh dưỡng, nấm Linh chi sinh trưởng tốt, tích lũy hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Tuy nhiên, kết nghiên cứu thấp so với nghiên cứu Supramani cộng sự., (2019) sản xuất IPS tối đa thu 1,57 ± 0,3 g/L điều kiện tối ưu hóa độ pH ban đầu 4, nồng độ glucose 40,45 g/L tốc độ lắc 103 vòng/phút (Supramani et al., 2019) Trong nghiên cứu Wang, (2017) PS tách chiết từ hệ sợi nấm Vân chi đạt 0,0390 ± 0,0220 g/L (K F Wang cs., 2017) 22 lần so với kết nghiên cứu 3.2.2 Xác định hàm lượng lipid protein sinh khối sợi nấm Linh chi Lipid Protein hai chất dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng sức khỏe, chúng tham gia vào hầu hết cấu trúc thể… Hàm lượng chất béo protein tính tỷ lệ % khối lượng chúng khối lượng bột nấm khô Hàm lượng lipid protein xác định theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 849:2006 10TCN 850:2006 Bảng 3.3 Hàm lượng lipid protein sinh khối khô sợi nấm Linh chi Hoạt chất Hàm lượng Lipid 2,82% Protein 14,28% Hàm lượng protein lipid chiếm tỉ lệ cao chất khô sợi nấm Linh chi, hàm lượng lipid chiếm 2,82% Protein 14,28% tổng khối lượng sợi nấm khô (Bảng3.3.) Tỷ lệ tương đương so với nghiên cứu trước tỷ lệ Lipid thể nấm Linh chi, đặc biệt hàm lượng Protein sợi nấm cao so với Protein thể nấm Linh chi Tiêu biểu nghiên cứu Mau cộng (2001) xác định tỷ lệ thành phần chủ yếu nấm linh chi gồm: tro (1,8%), carbohydrate (26- 28%), chất béo thô (3- 5%), chất xơ (59%) protein (7- 8%) (Mau cs., (2001) Hàm lượng protein nấm Linh chi khoảng 7- 8%, thấp so với nhiều loại nấm khác Nhưng đặc biệt thành phần protein nấm Linh chi có nhiều amino acid thiết yếu lysine leucine Hàm lượng chất béo tổng thấp chứa nhiều acid béo khơng bão hịa nhiều nối đơi, hợp chất có lợi cho sức khỏe người (Chang cs., (1996); Borchers cs., (1999); Sanodiya cs., (2009)) 25 3.3 Khả kháng oxy hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi Các gốc tự O-, OH ROS coi tác nhân oxy hóa mạnh, chúng phản ứng với tất phân tử lớn tế bào dẫn đến gây đột biến ung thư Đặc tính chống oxy hóa PS từ thực vật, nấm nghiên cứu phổ biến sử dụng chất chống oxy hóa tự nhiên Tác dụng sinh học polysaccharide, bao gồm hoạt động chống oxy hóa liên quan chặt chẽ đến đặc điểm cấu trúc chúng trọng lượng phân tử, thành phần hóa học, liên kết glycoside, mức độ phân nhánh, v.v… Hoạt động chống oxy hóa loại phụ gia phụ thuộc vào nhiều yếu tố hàm lượng lipid, nồng độ chất chống oxy hóa, nhiệt độ, oxy, có mặt chất chống oxy hóa thành phần khác thực phẩm nước protein Ở sử dụng ABTS+ gốc tự ổn định có khả nhận điện tử hydrogen để trở thành phân tử không ổn định nhằm khảo sát khả chống oxy hóa PS thu nhận VTM C sử dụng chất chuẩn đối chứng Hình 3.2 Kháng oxi hóa PS VTMC Kết kháng oxy hóa polysaccharide trình bày Hình 3.2 26 0.7 0.6214 91.91 Mật độ quang 0.6 74.65 0.5 0.4 0.3 0.1575 0.2 0.0503 0.1 0 Đc - Đc+ 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Hiệu suất % Hoạt tính bắt gốc tự Mẫu Mẫu Mật độ quang % bắt gốc tự Hình 3.3 Hoạt tính kháng oxi hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi Kết cho thấy giá trị OD mẫu PS thấp mẫu đối chứng, chứng tỏ PS từ hệ sợi nấm Linh chi có khả bắt gốc tự Mật độ quang thấp khả kháng oxy hóa mạnh, mật độ quang IPS 0,1575 Hoạt động chống oxy hóa PS tương đối cao 77,66%, nghiên cứu (Kalyoncu et al., 2010) hiệu suất bắt gốc tự sợi nấm Linh chi đạt 70,71% Vitamin C chất có khả kháng oxy hóa mạnh, khả trung hòa gốc tự ABTS IPS chiết xuất từ sợi nấm so sánh với chất chuẩn Vitamin C thấp Vitamin C 15,21% (Kalyoncu et al., 2010) Khả chống oxy hóa PS liên quan trực tiếp đến mối liên kết phân tử PS với ion có gốc oxi hóa tạo nên gốc ổn định, mà ngăn chặn chuỗi tác nhân phản ứng Thêm vào đó, có mặt lượng lớn nhóm hydroxyl phân tử PS tạo phản ứng mà kết hợp chúng với để tạo thành sản phẩm vô hại (K Wang et al., 2014) 3.4 Đánh giá hàm lượng kim loại nặng sinh khối sợi nấm Linh chi Nấm Linh chi chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Việc nuôi trồng thể nấm Linh chi thường tốn thời gian dài nguy nhiễm KLN từ nguồn chất trồng dẫn đến ảnh hưởng đến chất lượng nấm đặc biệt sức khỏe người Vì vậy, nuôi trồng nấm Linh chi môi trường dịch thể xem giải pháp vừa thay với chi phí rẻ mà hiệu lại cao Nấm xem sinh vật có khả hấp thụ kim loại nặng, q trình ni sinh khối hệ sợi nấm mơi trường dụng cụ 27 xuất KLN, dẫn đến số loại nấm ăn nấm dược liệu thường có hàm lượng kim loại nặng vượt giới hạn cho phép Để khảo sát hàm lượng kim loại nặng hệ sợi nuôi cấy môi trường dịch thể nghiên cứu tiến hành phân tích hàm lượng kim loại nặng mà cụ thể là: Arsen (As), Chì (Pb), Cadimi (Cd) Thủy ngân (Hg) Bảng 3.4 Kết phân tích kim loại nặng sợi nấm Linh chi mẫu Kim loại Mẫu QCVN Asen (As)