Nghiên cứu hoạt tính prebiotics của polysaccharide chiết xuất từ sinh khối sợi nấm cordyceps militaris

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  BÙI ĐỨC THẮNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH PREBIOTICS CỦA POLYSACCHARIDE CHIẾT XUẤT TỪ SINH KHỐI SỢI NẤM CORDYCEPS MILITARIS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  BÙI ĐỨC THẮNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH PREBIOTICS CỦA POLYSACCHARIDE CHIẾT XUẤT TỪ SINH KHỐI SỢI NẤM CORDYCEPS MILITARIS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Bích Hằng Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả hướng dẫn Ths: Nguyễn Thị Bích Hằng cơng tác khoa sinh – môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả (Ký tên) Bùi Đức Thắng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ từ cá nhân tập thể suốt thời gian thực Đầu tiên tơi xin chân thành bày tỏ lịng cảm ơn quý báu tới ThS Nguyễn Thị Bích Hằng ThS Lê Thị Mai tạo điều kiện ln giúp đỡ tơi thực hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn BCN khoa tồn thể q thầy giáo khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu, xây dựng thành cơng khóa luận Tơi xin cảm ơn tập thể lớp 17 CNSH bạn sinh viên NCKH phòng công nghệ sinh học động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối xin chân thành cảm ơn tới ba, mẹ gia đình tơi ln lo lắng, chăm sóc tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày 10 tháng 05 năm 2021 ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nấm Cordyceps militaris 1.1.1 Giới thiệu nấm Cordyceps militaris 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps militaris Việt Nam giới 1.2 Tổng quan polysaccharide nấm Cordyceps militaris 1.3 Giới thiệu chung prebiotics 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Các loại prebiotics 1.3.3 Tiêu chí phân loại prebiotics 10 1.3.4 Tác dụng prebiotics 11 1.3.5 Cơ chế hoạt động prebiotics 13 1.3.6 Tình hình nghiên cứu prebiotics 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng 17 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp nuôi hệ sợi nấm Cordyceps militaris 17 iii 2.2.2 Phương pháp thu sinh khối hệ sợi nấm 18 2.2.3 Phương pháp tách chiết định lượng polysaccharide 18 2.2.4 Phương pháp kháng oxy hóa 20 2.2.5 Phương pháp đánh giá kích thích sinh trưởng vi khuẩn có lợi 20 2.2.6 Phương pháp đánh giá ức chế sinh trưởng vi khuẩn có hại 21 2.2.7 Phương pháp xử lí số liệu 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Tổng hàm lượng polysaccharide sợi hệ nấm Cordyceps militaris 22 3.2 Khả kháng oxy hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Cordyceps militaris 22 3.3 Ảnh hưởng polysaccharide đến phát triển vi sinh vật có lợi 24 3.4 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 Kết luận 30 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 36 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS+: 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt CT: công thức FOS: fructooligosaccharides OD: Optical density PD: potato dextros PS: Polysaccharide v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 3.1 Sự tăng trưởng L plantarum nuôi nghiệm thức nghiên cứu, 37 ° C 24h 25 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình vẽ Trang 1.1 Nấm Cordyceps militaris khoa sinh – môi trường – ĐHSP 1.2 Đường prebiotics thể người 11 1.3 Cơ chế hoạt động prebiotics 13 2.1 Hệ sợi nấm Cordyceps militaris nuôi cấy tĩnh khoa sinh – môi trường 17 3.1 Đường chuẩn D – Glucose 22 3.2 Kháng oxi hóa PS VTMC 23 3.3 3.4 Hoạt tính kháng oxi hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm C.militaris Số lượng khuẩn lạc L.platarum môi trường MRS 24 26 Đường kính vùng ức chế vi sinh vật gây bệnh B cereus, E 3.5 coli, Salmonella từ dịch nuôi cấy L plantarum nghiệm thức nghiên cứu 3.6 Vịng vơ khuẩn B cereus, E coli, Salmonella từ dịch ni cấy L.plantarum mơi trường có bổ sung chiết xuất PS từ nấm prebiotics thương mại vii 27 28 TÓM TẮT Prebiotics nguồn thức ăn cho probiotics (vi sinh vật sống hữu ích đường ruột vật chủ) thơng qua việc kích thích có chọn lọc vi khuẩn giúp đường ruột khỏe mạnh Mặt khác, prebiotics đóng vai trị bẫy vi khuẩn gây hại Nghiên cứu thực khảo sát ban đầu hoạt tính prebiotics polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Cordyceps militaris Kết nghiên cứu rằng, hàm lượng polysaccharide thu nhận từ hệ sợi nấm Cordyceps militaris 3204,65±214.48𝜇g/ml Khả kháng oxi hóa đạt 72,77% PS chiết xuất từ hệ sợi nấm C militaris có khả thúc đẩy sinh trưởng hoạt động chủng vi sinh vật có lợi đường ruột Lactobacillus plantarum Khả kích thích tăng trưởng lợi khuẩn L plantarum ni dịch chiết polysaccharide 3.2292±0,0013, hiệu suất kích tích tăng 1,65% so với mơi trường khơng bổ sung, mật độ tế bào đạt 2,58× 1010 Bên cạnh đó, dịch chiết từ mơi trường ni cấy Lactobacillus plantarum có khả ức chế vi sinh vật gây hại đường ruột như: Escherichia coli, Bacillus cereus, Salmonella Vùng ức chế E coli, B cereus, Salmonella là: 12.33±2.3094mm, 7.33±2.88mm 15.6±0.57mm, tốt so với đối chứng tương ứng với FOS, Inulin Kết đề tài bước đầu cho thấy tiềm sử dụng sợi nấm C militaris làm nguồn nguyên liệu sản xuất prebiotics, synbiotics bên cạnh nguồn prebiotics từ thực vật phổ biến Từ khóa: Cordyceps militaris, kháng oxi hóa, polysaccharide, prebiotics viii Tác dụng sinh học polysaccharide, bao gồm hoạt động chống oxy hóa liên quan chặt chẽ đến đặc điểm cấu trúc chúng trọng lượng phân tử, thành phần hóa học, liên kết glycosidic, mức độ phân nhánh, v.v… Hoạt động chống oxy hóa loại phụ gia phụ thuộc vào nhiều yếu tố hàm lượng lipid, nồng độ chất chống oxy hóa, nhiệt độ, oxy, có mặt chất chống oxy hóa thành phần khác thực phẩm nước protein Ở sử dụng ABTS+ gốc tự ổn định có khả nhận điện tử hydrogen để trở thành phân tử không ổn định nhằm khảo sát khả chống oxy hóa PS thu nhận VTM C sử dụng chất chuẩn đối chứng Hình 3.2 kháng oxi hóa PS VTMC Kết kháng oxi hóa polysaccharide trình bày hình 3.3 23 0.7 0.6142 91.87% OD 734nm 0.6 72.77% 0.5 0.4 0.3 0.1906 0.2 0.1 0.0569 12.26% ĐC (-) PS Mẫu VTM C Mật độ quang Hiệu suất (%) 100.00% 90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% Hiệu suất (%) Hoạt tính bắt gốc tự Hình 3.3 Hoạt tính kháng oxi hóa polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm C militaris Kết cho thấy giá trị OD mẫu PS thấp mẫu đối chứng, chứng tỏ PS từ hệ sợi nấm C militaris có khả bắt gốc tự Mật độ quang thấp khả kháng oxi hóa mạnh, mật độ quang PS 0,1906 Hoạt động chống oxi hóa PS tương đối cao 72,77%, nghiên cứu (Chen et al., 2014) nồng độ 0,3mg/ml hiệu suất bắt gốc tự đạt 56,46±2,65% Vitamin C chất có khả kháng oxi hóa mạnh, khả trung hòa gốc tự ABTS PS chiết xuất từ nấm so sánh với chất chuẩn Vitamin C thấp Vitamin C 19,1% Khả chống oxy hóa PS liên quan trực tiếp đến mối liên kết phân tử PS với ion có gốc oxi hóa tạo nên gốc ổn định, mà ngăn chặn chuỗi tác nhân phản ứng Thêm vào đó, có mặt lượng lớn nhóm hydroxyl phân tử PS tạo phản ứng mà kết hợp chúng với để tạo thành sản phẩm vô hại (K Wang et al., 2014) 3.3 Ảnh hưởng polysaccharide đến phát triển vi sinh vật có lợi Hệ vi sinh vật đường ruột có chức bảo vệ, chuyển hóa miễn dịch thể vật chủ Mối quan hệ cộng sinh hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ điều hịa trì ổn định nhờ vào trao đổi thông tin chéo Sự trao đổi qua trung gian chất chuyển hóa tổng hợp hệ vi sinh vật thể vật chủ phân tử tín hiệu điều hòa thần kinh miễn dịch, đáp ứng viêm nhằm kết nối thông tin đường ruột với quan khác (Ren & Lotfipour, 2020) Lactobacillus plantarum vi sinh vật có lợi hệ đường ruột Sử dụng PS chiết xuất từ C militaris bổ sung vào 24 môi trường nuôi cấy L plantarum nhằm theo dõi kích thích tăng trưởng PS L plantarum Chủng Lactobacillus plantarum nuôi cấy môi trường MRS có khơng bổ sung PS chiết xuất từ nấm C militaris, chúng so sánh với FOS Inulin Kết biểu diễn bảng 3.1 Bảng 3.1 Sự tăng trưởng Lactobacillus plantarum nuôi nghiệm thức nghiên cứu, 37 ° C 24h Mẫu OD Mật độ tế bào (CFU/ml) CT1 3.1768±0.0028a 1,06× 1010 CT2 3.1866±0,0112a 1,23× 1010 CT3 3.2648±0.014b 2,16× 1010 CT4 3.2292±0,0013c 2,58× 1010 Ghi chú: chữ a, b, c thể sai khác mức ý nghĩa p