2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Giống Nấm Cordyceps militaris được cung cấp từ phịng thí nghiệm khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN.
Hình 2.1 Hệ sợi nấm Cordyceps militaris nuôi cấy tĩnh tại khoa Sinh – Môi trường.
Prebiotics thương mại FOS và Inulin được cung cấp bởi công ty CP Dược phẩm Novaco.
Chủng probiotics (Lactobacillus plantarum) được cung cấp tại công ty CP Công nghệ Biotech Việt Nam và vi khuẩn gây hại (Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus) được cung cấp bởi phịng thí nghiệm khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu từ tháng 11/2020 đến tháng 05/2021.
- Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi hệ sợi nấm Cordyceps militaris
Tiến hành nuôi cấy hệ sợi nấm như sau: - Nuôi cấy lắc
18
Cho 100 ml mơi trường PD+ vào các bình tam giác (250ml). Hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121℃/30phút. Để nguội một ngày, cấy lượng tơ nấm như nhau vào mỗi bình từ ống giống cấp 1. Đặt các bình vào máy lắc có tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ từ 18 đến 22℃. Sau 7 ngày tiến hành thu hệ sợi nấm.
- Nuôi cấy tĩnh
Cho 20 ml mơi trường PD+ vào các bình 500ml. Hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121℃/30phút. Để nguội một ngày, cấy lượng tơ nấm như nhau vào mỗi bình từ ống giống cấp 1. Đặt các bình ở nhiệt độ từ 18 đến 22℃, sau 20 ngày tiến hành thu hệ sợi nấm.
Thành phần môi trường PD+ gồm: Khoai tây: 200g Glucose: 20g Cao nấm men: 2g Peptone: 2g H2O: 1 lít
2.2.2. Phương pháp thu sinh khối hệ sợi nấm
Sau khi nuôi, tiến hành thu sinh khối như sau: Giấy lọc được sấy ở nhiệt độ 50°C đến khối lượng không đổi. Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng. Dùng các giấy lọc đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi ni cấy. Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc. Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc. Sấy ở nhiệt độ 50°C đến khối lượng không đổi, để nguội rồi cân.
2.2.3. Phương pháp tách chiết và định lượng polysaccharide
Quy trình chiết suất Polysaccharide từ nấm thực hiện theo phương pháp của Yihuai gao và cộng sự (2001): Sợi nấm được sấy ở nhiệt độ 50 độ C để tách chiết. Tơ nấm đã sấy khô đem nghiền và ngâm với nước 70 độ C với tỉ lệ 1:20 trong 3h. Sau đó, lọc hỗn hợp thu dịch lọc và tủa với cồn 96% theo tỉ lệ 1:5 từ 12h đến 24h tại 4 độ C. Tiến hành lọc hỗn hợp thu tủa và rửa tủa 2 lần với cồn 96%, sấy ở 60 độ C trong 2h thu được polysaccharide thơ.
19
Quy trình tách chiết polysaccharide từ C. militaris:
Sau đó, xác định hàm lượng PS bằng phương pháp phenol – sulfuric
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành các monosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 𝜆 = 490𝑛𝑚.
Xây dựng đường chuẩn D – glucose sau đó đo mẫu thực và tính ra lượng PS. Cách xây dựng đường chuẩn D – glucose:
Cân chính xác 0.2500 (g) D – Glucose cho vào bình định mức 250ml rồi định mức bằng nước cất, ta được dung dịch A. Như vậy, nồng độ dung dịch D – Glucose là 1 mg/ml (1000 𝜇g/ml).
Lấy 50ml dung dịch A pha thành 500ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ 100 𝜇g/ml (dung dịch B).
Sinh khối sợi nấm (Sấy 50 độ C)
Bột nấm
Dịch chiết nước Nghiền
Chiết với nước nóng 3 lần
(70 độ C, 3h)
Dịch sau tủa Tủa với cồn 96 độ với tỉ
lệ 1:5 (12h, 4 độ C)
PS Lọc qua giấy lọc, thu
tủa, rửa tủa và sấy ở 60 độ C
20
Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 ml dung dịch B pha thành 100ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 𝜇g/ml.
Lấy 125 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ 250 𝜇g/ml (dung dịch C).
Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 ml dung dịch C pha thành 100 ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 𝜇g/ml.
Mỗi mẫu lấy 1ml cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 490nm, thu được các giá trị độ hấp thụ quang.
Từ kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn D –Glucose.
2.2.4. Phương pháp kháng oxy hóa
Hoạt động loại bỏ gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS + mô tả bởi Nenadis et al, (2004). Dung dịch ABTS+ được chuẩn bị bằng cách cho 2ml dung dịch ABTS 7mM và 2 ml dung dịch K2S2O8 2.45mM. Ủ dung dịch trong bóng tối 16h, sau đó pha lỗng bằng ethanol (khoảng 50 lần), điều chỉnh độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 734nm có mật độ quang là 0.7±0.05. Tiến hành khảo sát hoạt động trung hòa gốc tự do ABTS + bằng cách cho 990 𝜇L dung dịch ABTS.+ vào 10 𝜇L cao chiết PS nấm Cordyceps militaris. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong thời gian 6 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang
phổ ở bước sóng 734nm. Chất đối chứng dương được sử dụng là vitamin C. Khả năng bắt gốc tự do ABTS∙+ : I(%) = 𝐴0−𝐴1
𝐴0 x 100 % (Kosanic et al., 2012) Trong đó: A0: giá trị mật độ quang của mẫu trắng;
A1: giá trị mật độ quang của mẫu thử.
2.2.5. Phương pháp đánh giá sự kích thích sinh trưởng của vi khuẩn có lợi
Các chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum được nuôi ở 37 độ C trong 24h, trong điều kiện kỵ khí trong mơi trường MRS (mẫu đối chứng); so với mơi trường MRS có bổ sung 1ml chiết xuất PS từ hệ sợi nấm. Sau khi ủ, các mẫu được định lượng bằng cách đo mật độ tế bào quang học bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 620nm (Siragusa et al., 2009).
21
Sử dụng mơi trường MRS có bổ sung FOS và Inulin làm đối chứng dương để so sánh với sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật có lợi so với mơi trường MRS có bổ sung polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm.
Sau khi xác định mật độ quang tiến hành cấy trải đĩa và đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào.
Mật độ tế bào dược tính theo cơng thức: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa
Di là độ pha lỗng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) Các cơng thức thí nghiệm:
CT1: môi trường MRS
CT2: môi trường MRS bổ sung FOS CT3: môi trường MRS bổ sung Inulin
CT4: môi trường MRS bổ sung chiết xuất PS từ C. militaris
2.2.6. Phương pháp đánh giá ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn có hại
Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantanum được nuôi ở 37 độ C trong 48h trên mơi trường MRS có bổ sung 1ml chiết suất hệ sợi nấm được li tâm ở điều kiện 5000 vòng/20 phút ở 4 độ C. Sau khi ly tâm, tiến hành thu phần dịch nổi để xác định sự ức chế sinh trưởng đối với các nhóm vi khuẩn có hại. Các chủng vi khuẩn có hại là Escherichia coli, Bacillus
cereus, Samonela typhy được nuôi trên các mơi trường NB tương ứng. Sau đó, lấy 50μl
cấy vào các đĩa môi trường tương ứng bằng kỹ thuật cấy tran, tiếp theo tiến hành đục các lỗ có đường kính 0,9 cm. Sau đó, dịch nổi thu từ quá trình ly tâm được lần lượt cho vào các lỗ trên các đĩa vi khuẩn gây bệnh. sau khi ủ ở 37 độ C trong 24h, hiệu suất của quá trình ức chế được xác định bằng cách đo đường kính vùng kháng khuẩn trên đĩa có chất nổi probiotics so với đĩa đối chứng (Rousseau et al., 2005).
Các cơng thức thí nghiệm: CT1: mơi trường MRS
CT2: môi trường MRS bổ sung FOS CT3: môi trường MRS bổ sung Inulin
CT4: môi trường MRS bổ sung chiết xuất PS từ C. militaris
2.2.7. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mền Microsoft Excel và phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences 20) bằng lệnh Descriptive và Ducan test.
22