2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hệ sợi nấm Vân chi (Trametes Versicolor) được ni tại phịng Cơng nghệ sinh học nấm của khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
Chủng vi sinh vật có lợi được sử dụng cho quá trình nghiên cứu là Lactobacillus
plantarum được cung cấp bởi công ty cổ phần công nghệ Biotech Việt Nam.
Chủng vi sinh vật có hại được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là Escherichia coli (E. Coli); Bacillus cereus; Salmonella sp cung cấp bởi phịng thí nghiệm Vi sinh của khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
Các prebiotic thương mại là FOS và Inulin được cung cấp bởi công ty Dược phẩm Novaco.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Nấm và phịng Cơng nghệ vi sinh thuộc khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân sinh khối hệ sợi nấm
Môi trường sử dụng nhân sinh khối là mơi trường PDA+, gồm có các thành phần như sau: Khoai tây: 200g Glucose: 20g Cao nấm men: 2g Peptone: 2g H2O: 1 lít
Mơi trường nhân giống được hấp khử trùng ở điều kiện 121 độ C trong 20 phút.
Tiến hành cấy giống vào các mơi trường đã chuẩn bị và chăm sóc q trình ni. Sau thời gian 7 – 10 ngày nuôi cấy, tiến hành thu hoạch sinh khối sợi tươi, lọc sinh khối và sấy khô hệ sợi nấm ở 50 độ C để thực hiện tách chiết.
2.3.2. Phương pháp tách chiết Polysaccharide
Quy trình chiết xuất Polysaccharide từ nấm Vân chi thực hiện theo phương pháp của Yihuai gao và cộng sự (2001): Sợi nấm được sấy ở nhiệt độ 50 độ C để tách chiết. Tơ nấm
16
đã sấy khô đem nghiền và ngâm với nước 70 độ C với tỉ lệ 1:15 trong 3h. Sau đó, lọc hỗn hợp thu dịch lọc và tủa với cồn 96% theo tỉ lệ 1:5 trong 12 tại 4 độ C. Tiến hành lọc hỗn hợp thu tủa và rửa tủa 2 lần với cồn 96%, sấy ở 60 độ C trong 2h thu được polysaccharide thơ.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết Polysaccharide
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng PS bằng phương pháp phenol – sulfuric
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành các monosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 𝜆 = 490𝑛𝑚. Xây dựng đường chuẩn D – glucose sau đó đo mẫu thực và tính ra lượng PS.
Mẫu: 1 ml dung mẫu dung dịch PS được trộn với 1 ml phenol 5% và 5ml H2SO4 đậm đặc, lắc đều và đặt ống nghiệm vào cốc nước sơi 2 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phịng 30 phút. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 490nm. Xác định hàm lượng PS dựa trên đường chuẩn D - Glucose
17
Cân chính xác 0.2500 (g) D – Glucose cho vào bình định mức 250ml rồi định mức bằng nước cất, ta được dung dịch A. Như vậy, nồng độ dung dịch D – Glucose là 1 mg/ml (1000 𝜇g/ml).
Lấy 50ml dung dịch A pha thành 500ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ 100 𝜇g/ml (dung dịch B).
Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 ml dung dịch B pha thành 100ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100𝜇g/ml.
Lấy 125 ml dung dịch A pha thành 500ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ 250 𝜇g/ml. (dung dịch C)
Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 ml dung dịch C pha thành 100ml thu được dung dịch D – Glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200𝜇g/ml.
Mỗi mẫu lấy 1ml cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sơi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 490nm, thu được các giá trị độ hấp thụ quang.
Từ kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn D –Glucose.
2.3.4. Phương pháp kháng oxy hóa
Hoạt động loại bỏ gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS.+ mô
tả bởi Nikolaos et al.(2004). Dung dịch ABTS.+ được chuẩn bị bằng cách cho 2ml dung
dịch ABTS 7mM và 2 ml dung dịch K2S2O8 2.45mM. Ủ dung dịch trong bóng tối 16h, sau đó pha lỗng bằng ethanol (khoảng 50 lần), điều chỉnh độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 734nm có mật độ quang là 0.7±0.05. Tiến hành khảo sát hoạt động trung hòa gốc tự
do ABTS.+ bằng cách cho 990 𝜇L dung dịch ABTS.+ vào 10 𝜇L cao chiết PS nấm Vân chi.
Hỗn hợp phản ứng được ủ trong thời gian 6 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 734nm. Chất đối chứng dương được sử dụng là vitamin C. Hiệu suất phần trăm ức chế (I%) được tính theo cơng thức(Kosanić et al., 2012): I% = [(A0 – Ai)/ A0] x 100.
Trong đó: A0 là giá trị mật độ quang của mẫu trắng. Ai là giá trị mật độ quang của mẫu thử
18
Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum được nuôi ở 37 độ C trong 24h trong điều kiện kỵ khí trong mơi trường MRS (mẫu đối chứng); so với mơi trường MRS có bổ sung 1ml chiết xuất hệ sợi nấm. Sau khi ủ, các mẫu được định lượng bằng cách đo mật độ tế bào quang học bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 620nm.(Siragusa và cs, 2009).
Sử dụng mơi trường MRS có bổ sung FOS và Inulin làm đối chứng dương để so sánh với sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật có lợi trên mơi trường đối chứng âm và mơi trường MRS có bổ sung polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Vân chi.
Sau khi xác định giá trị mật độ quang, tiến hành hút 10𝜇l mỗi mẫu cho vào các đĩa môi trường MRS đã chuẩn bị sẵn, cấy trải đĩa và đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào trong mỗi mẫu. Mật độ tế bào được tính theo công thức sau:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Bảng 2.1. Bảng bố trí các nghiệm thức thí nghiệm.
Nghiệm thức Thành phần
CT1 Mơi trường MRS khơng có chất bổ sung
CT2 Mơi trường MRS + FOS
CT3 Môi trường MRS + Inulin
CT4 Môi trường MRS + PS
2.3.6. Phương pháp đánh giá ức chế sinh trưởng của vi sinh vật có hại
Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum được nuôi ở 37 độ C trong 48h trên môi trường MRS có bổ sung 1ml chiết xuất hệ sợi nấm được ly tâm ở điều kiện 5000 vòng/20 phút ở 4 độ C. Sau khi ly tâm, tiến hành thu chất nổi để xác định sự ức chế sinh trưởng đối
với các nhóm vi khuẩn có hại. Các chủng vi khuẩn có hại là E. coli, Bacillus cereus và
Salmonella được nuôi trên các mơi trường tương ứng. Sau đó, lấy 50μl cấy vào các đĩa mơi
trường NA bằng kỹ thuật cấy trang. Tiến hành đục lỗ thạch có đường kính 9mm trên các đĩa vi khuẩn gây bệnh. Tiếp theo, chất nổi thu từ quá trình ly tâm được cho vào các lỗ thạch và ủ ở 37 độ C trong 24h. Khả năng ức chế được xác định bằng cách đo đường kính vịng vơ khuẩn trên đĩa có chất nổi probiotic so với đĩa đối chứng. (Rousseau và cs, 2005).
19
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu:
Tất cả các số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý trên phần mềm SPSS 20 (Statistical Package for the Social Sciences) bằng lệnh Descriptive và Ducan test.
20