TNG HP MT s ACID HYDROXAMIC MANG HP

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  NGUYỄN MINH TUẤN MSV: 1201669 TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG HỢP PHẦN 1(TRIAZOL-4-YL)METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  NGUYỄN MINH TUẤN MSV: 1201669 TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG HỢP PHẦN 1(TRIAZOL-4-YL)METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS Đỗ Thị Mai Dung PGS.TS Phan Thị Phương Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận này, tơi nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô, bạn bè số tổ chức suốt thực đề tài Cho đến khố luận hồn thiện, tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành đến họ Đầu tiên từ tận đáy lịng mình, tơi xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung NCS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình dạy dỗ, hướng dẫn dìu dắt tơi suốt chặng đường khó khăn thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc, phòng nghiên cứu cấu trúc - Đại học Quốc gia Seoul - Hàn Quốc giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn anh chị, bạn em nghiên cứu mơn Hố Dược - trường Đại Học Dược Hà Nội, cảm ơn tập thể lớp M1K67 giúp đỡ nhiều thời gian thực đề tài Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến anh Lê Văn Cường, em Nguyễn Văn Huân, em Mai Quang Hưng bạn Nguyễn Gia Anh Tuấn người bạn bên lúc vui buồn giúp đỡ nhiều suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân bạn bè quan tâm, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất tình cảm giúp đỡ mà người thân bạn bè dành tặng cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Minh Tuấn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 CÁC HỢP CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACI) 1.1.1 Giới thiệu sơ lược enzym HDAC 1.1.2 Phân loại chất ức chế HDAC 1.1.3 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.1.4 Liên quan cấu trúc tác dụng 1.2 TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA KHUNG TRIAZOL 1.2.1 Các hợp chất kháng tế bào ung thư mang khung triazol cơng bố 1.2.2 Vai trị vịng triazol thiết kế cơng thức chất ức chế HDAC 13 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP KHUNG 1,2,3-TRIAZOL BẰNG PHẢN ỨNG CLICK 13 1.3.1 Tổng hợp vịng 1,2,3-triazol theo quy trình Kolarovič 13 1.3.2 Tổng hợp vịng 1,2,3-triazol theo quy trình Steven Lal 14 1.3.3 Tổng hợp vịng 1,2,3-triazol theo quy trình Yan 15 Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17 17 2.1.1 Hoá chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 18 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Tổng hợp hóa học 18 2.2.2 Thử tác dụng sinh học chất vừa tổng hợp 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 Nghiên cứu docking 19 2.3.2 Tổng hợp hoá học 19 2.3.3 Xác định cấu trúc dẫn chất tổng hợp 19 2.3.4 Thử tác dụng sinh học 20 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 NGHIÊN CỨU DOCKING 22 3.2 HỐ HỌC 23 3.2.1 Tổng hợp hố học 23 3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết 32 3.2.3 Khẳng định cấu trúc 33 3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 40 3.3.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 40 3.3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 41 3.4 BÀN LUẬN 42 3.4.1 Nghiên cứu docking 42 3.4.2 Tổng hợp hóa học 43 3.4.3 Khẳng định cấu trúc 46 3.4.4 Thử hoạt tính sinh học 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 1.1 VỀ TỔNG HỢP VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 53 1.2 VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT H-NMR 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon Nuclear Magnetic Resonance) AsPC-1 Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ DCM Dicloromethan DMF N,N-dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid FBS Huyết bào thai bò (Fetal Bovine Serum) FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HAT Histon acetyltransferase HDACi Histon deacetylase inhibitors HDAC Histon deacetylase HRMS Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MeCN Acetonitril MeOH Methanol PC-3 Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt SAHA Acid sulberoylanillid hydroxamic SW620 Dòng tế bào ung thư đại tràng TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TCTH Tiêu chuẩn tổng hợp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 So sánh IC50 chất có vịng 1,2,3 triazol so với 12 SAHA Bảng 1.2 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol từ azid alkyl phản ứng Click, xúc tác 15 [CuBr(PPh3)3] với số dung môi thông dụng Bảng 1.3 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol từ azid alkyl phản ứng Click, xúc tác muối đồng 16 với số dung môi thông dụng Bảng 2.1 Bảng liệt kê danh sách hoá chất sử dụng đề tài 17 Bảng 2.2 Quy trình thử độc tính tế bào 21 Bảng 3.1 Kết docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 22 Bảng 3.2 Khảo sát thời gian phản ứng tạo II1 25 Bảng 3.3 Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic 32 Bảng 3.4 Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tonc) chất VIa-f 33 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ IR dẫn chất VIa-f 34 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ MS dẫn chất VIa-f 35 Bảng 3.7 Kết phân tích phổ 1H-NMR dẫn chất VIa-f 36 Bảng 3.8 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất VIa-f 38 Bảng 3.9 Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất VIa-f 40 Bảng 3.10 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 41 Bảng 3.11 So sánh tương quan lượng tương tác dự đoán với tác dụng ức chế HDAC2 42 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 Vai trị HAT HDAC điều hoả biểu gen Hình 1.2 Mơ hình mô tả cấu trúc chung hợp chất ức chế HDAC Hình 1.3 Các dẫn chất amid ngược SAHA Hình 1.4 Mơ hình ZBG Vanommeslaeghe Hình 1.5 Quy trình tổng hợp vịng triazol Kolarovič 13 Hình 1.6 Quy trình tổng hợp vịng triazol Steven Lal 14 Hình 1.7 Quy trình tổng hợp vịng triazol Yan 15 Hình 3.1 Hình ảnh docking dẫn chất VIc 23 Hình 3.2 Phổ IR chất Via 47 Hình 3.3 Phổ MS chất VIc 47 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR chất VIc 48 Hình 3.5 Phổ 13C-NMR chất VIa 49 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào dẫn chất 51 VIa-f dòng tế bào SW620, PC-3 AsPC-1 Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II1 23 Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất Iva 25 Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va 27 Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất VIa 29 Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d 43 Sơ đồ 3.7 Cơ chế phản ứng Click tạo thành Va-f 44 Sơ đồ 3.8 Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-f 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong 20 năm trở lại đây, thuốc làm chết tế bào ung thư “nhắm tới phân tử đích” hướng điều trị mà nhiều nhà khoa học hướng tới Các mục tiêu phân tử điển hình nghiên cứu như: protein kinase (khóa thụ thể HER1, HER2, Bcr-Abl …), histon deaceylase (HDAC), telomerase…Trong enzym HDAC mục tiêu phân tử quan tâm Một số chất ức chế enzym HDAC hữu hiệu sử dụng việc điều trị ung thư như: SAHA (Zolinza®) (tác nhân ức chế HDAC FDA cấp phép điều trị u lympho tế bào T da) Không lâu sau romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®) panobinosat (Farydax®) FDA cấp phép sử dụng điều trị ung thư Trên sở cấu trúc số chất ức chế HDAC công bố giới, nhóm nghiên cứu mơn Hố Dược – trường Đại Học Dược Hà Nội tiến hành thiết kế tổng hợp, công bố dãy chất với đích tác dụng HDAC Các dẫn chất thu cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [8], [27], [2] Đặc biệt phải kể đến acid hydroxamic GS.TS Nguyễn Hải Nam nhóm nghiên cứu thiết kế tổng hợp mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol Chúng có tác dụng ức chế HDAC tốt gấp nhiều lần so với SAHA [27] Từ nghiên thấy hợp chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC mang nhóm nhận diện bề mặt dị vịng thơm, cho hoạt tính in vitro khả quan Tiếp tục hướng nghiên cứu tiếp tục thiết kế tổng hợp dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on tiến hành đề tài “Tổng hợp số acid hydroxamic mang hợp phần 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với mục tiêu: Tổng hợp N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid dẫn chất Thử tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào chất tổng hợp Chương TỔNG QUAN 1.1 CÁC HỢP CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi) 1.1.1 Giới thiệu sơ lược enzym HDAC Sự điều hoà biểu gen phụ thuộc vào enzym: kinase, methyltransferase, histon actyltransferase (HAT) histon deacetylase (HDAC) tác động chúng lên phần histon nhiễm sắc thể (NST) [15] Hình 1.1 Vai trò HAT HDAC điều hoả biểu gen Histon acetyltransferase (HAT) nhóm enzym acetyl hoá ε-NH2 lysin (đầu N) gây trung hồ điện tích dương lysin, làm giảm khả tương tác với ADN (mang điện tích âm), tạo cấu trúc mở chromatin Đây enzym khởi đầu cho trình phiên mã dịch mã [24] (xem hình 1.1) Histon deacetylase (HDAC) enzym có chức đối lập với HAT Chúng gây deacetyl hố nhóm acetyl đầu N lysin histon, làm cho nhiễm sắc thể đóng xoắn ức chế q trình phiên mã [12] (xem hình 1.1) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu HDAC không liên quan đến cấu trúc chromatin biểu gen, mà biểu mức HDAC tác động đến tiến trình ung thư, bao gồm hình thành khối u ác tính [37] Chính ức chế HDAC điều trị số bệnh ung thư như: ung thư biểu mô thận, ung thư biểu mô vảy đầu cổ, u trung biểu mô, u lympho tế bào B T bệnh Hodgkins… đạt hiệu tốt Cấu trúc HDAC Việc xác định cấu trúc phân tử HDAC vơ quan trọng việc tìm hiểu chế tác dụng dựa sở để thiết kế cơng thức cho chất ức chế HDAC Sử dụng phương pháp kết tinh chụp tia X giúp tìm cấu trúc tinh thể Phụ lục 19 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIa Phụ lục 19 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIa (mở rộng) Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb (mở rộng) Phụ lục 21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc Phụ lục 21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc (mở rộng) Phụ lục 22 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId Phụ lục 22 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId (mở rộng) Phụ lục 23 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIe Phụ lục 23 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIe ( mở rộng) Phụ lục 24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIf Phụ lục 24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIf (mở rộng) VIa (-7.5 kcal/mol) VIb (-7.8 kcal/mol) Phụ lục 25 Hình ảnh docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 VIc (-8.1 kcal/mol) VId (-7.9 kcal/mol) Phụ lục 25 Hình ảnh docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 ( tiếp) VIe (-7.4 kcal/mol) VIf (-7.2 kcal/mol) Phụ lục 25 Hình ảnh docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 ( tiếp) ... thiệu s? ? lược enzym HDAC S? ?? điều hoà biểu gen phụ thuộc vào enzym: kinase, methyltransferase, histon actyltransferase (HAT) histon deacetylase (HDAC) tác động chúng lên phần đuôi histon nhiễm s? ??c... (Fetal Bovine Serum) FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HAT Histon acetyltransferase HDACi Histon deacetylase inhibitors HDAC Histon deacetylase HRMS Phổ khối... phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MeCN Acetonitril